本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种柑橘鳞皮病毒的rt-lamp检测试剂盒和方法。
背景技术：
柑橘鳞皮病毒(citruspsorosisvirus，cpsv)是一种对柑橘具有毁灭性的病害，该病自20世纪90年代在美国佛罗里达州和加利福尼亚州被首次发现以来，相继在阿根廷、西班牙、埃及、意大利等国家广泛发生(roistacher，1993)。柑橘鳞皮病主要危害甜橙、葡萄柚和宽皮柑橘，可引起寄主主干和大枝典型的树皮鳞片状开裂症状，并伴随木质部导管充胶变色，感染该病毒的树木产量只有健康树木产量的28％(achachietal.，2014)。柑橘鳞皮病主要通过嫁接进行传播(martínetal.，2002)，卵菌亚纲的油壶菌也可以传播cpsv(palleetal.，2005；vairaetal.，2007,2009)。柑橘鳞皮病有鳞皮病a(psa)和鳞皮病b(psb)两种类型，其中以psa最为常见。psa可引起植株主干树皮鳞片化开裂，木质部导管充胶变色。psb的危害比psa严重，主要引起嫰枝充胶，树皮大面积开裂，老叶上形成变色环斑，有时沿叶脉可见褪绿斑纹(velázqueetal.，2012)，10-20树龄的树木较易出现树皮鳞皮状开裂(achachietal.，2014)。
在田间样品大规模检测过程中发现我国田间有该病毒的分布，而目前关于cpsv的检测主要是通过elisa、分子杂交，rt-pcr和免疫电镜等方法(martínetal.，2004；achachietal.，2015)，其中rt-pcr的方法需要昂贵的检测仪器，且灵敏度需要进一步的提高；elisa、分子杂交和免疫电镜的方法操作费事，且灵敏度低。环介导等温核酸扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)技术是采用4条特异引物和dna链置换聚合酶(bstdnapolymerase)在恒温条件下建立的一种新型的分子检测技术(notomietal.,2000)，现已广泛的应用于各种病原微生物的检测(okudaetal.，2015；rudolphetal.，2015；warghaneetal.，2017；luetal.，2018)。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明旨在提供一种简单、方便、快捷、灵敏度高的柑橘鳞皮病毒的rt-lamp检测试剂盒和方法。
为此，本发明所采用的技术方案为：
一种柑橘鳞皮病毒的rt-lamp检测试剂盒，包括外引物对f3-5/b3-5和内引物对fip3-5/bip3-5，所述内、外引物对的序列为：
f3-5:5’-ctttgagtccatcaactgtt-3’，
b3-5:5’-tcactctgaagctgacat-3’，
fip-5:5’-ggtgaaggaccaactaggacgttgctgaaatctgcctc-3’，
bip-5:5’-gaaaccccttgttcttgtcgggtgctataatttacagcctca-3’。
在上述技术方案中，还包括
一种柑橘鳞皮病毒的rt-lamp检测方法，包括如下步骤：提取待测样品的总rna，以总rna为模板，利用权利要求1或2所述的试剂盒进行rt-lamp扩增，扩增条件为：58～68℃扩增40～80min，对扩增产物进行鉴定。
扩增产物进行鉴定的方法为凝胶电泳成像和紫外成像。
作为优选地，所述扩增条件为：60℃扩增60min。
所述内引物、外引物的浓度比为2～12：1。
作为优选地，所述内引物、外引物的浓度比为8：1。
反应体系为：warmstartlamp2×mix12.5μl、10μmol/l的f3/b30.5μl、10μmol/l的fip/bip4μl、rna2μl加水补足至25μl。
本发明的有益效果是：建立了特异的用于检测cpsv的rt-lamp试剂盒和方法，仅需一台水浴锅在60min就可完成反应，而rt-pcr的反应时间为2h左右。通过比较rt-lamp和一步法rt-pcr灵敏度发现，该方法的灵敏度是rt-pcr灵敏度的10倍。该方法具有简单、方便、快捷的特点，为今后田间快速、大量检测奠定坚实的基础。
附图说明
图1是cpsvrt-lamp最佳反应温度、时间筛选结果图。
图2是rt-pcr和rt-lamp方法检测田间10个cpsv疑似样品的结果图，其中，a：rt-lamp产物电泳检测，b：rt-pcr电泳检测。
图3是cpsvrt-lamp检测特异性结果图。
图4是cpsvrt-lamp与rt-pcr灵敏度对比图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图，对本发明作进一步说明：
实施例1建立柑橘鳞皮病毒rt-lamp检测方法
本实施例的供试材料：
感染了柑橘鳞皮病毒、柑橘黄化脉明病毒(citrusyellowveinclearingvirus,cyvcv)、柑橘衰退病毒(citustristezavirus,ctv)、柑橘碎叶病毒(citrustatterleafvirus,ctlv)、柑橘叶斑病毒(citrusleafblotchvirus,clbv)、柑橘黄龙病(citrushuanglongbing,hlb)的植物样品均由西南大学柑桔研究所国家柑橘苗木脱毒中心提供。
一、植物总rna的提取与引物合成
取50mg待测样品的叶片，按照trizol试剂说明书提取样品的总核酸，保存于-20℃备用。
根据ncbi数据库登录的cpsvcp基因序列(mg673946)为靶标基因组序列，使用专门的lamp引物设计软件primerexplorer4.0(http://primerexplorer.jp/e/index.html)设计了4组引物(表1)，参考
表1柑橘鳞皮病毒rt-lamp检测用引物序列
二、rt-lamp反应条件的优化
对rt-lamp的反应温度、反应时间和内外引物比进行优化。其中温度设置为58、60、62、64、66和68℃；反应时间为30、40、50、60、70和80min；fip/bip：f3/b3引物浓度比为2：1、4：1、6：1、8：1、10：1和12：1。
参考
1.4产物鉴定
提取从湖南采集的10份疑似cpsv样品的总核酸，分别用优化的rt-lamp的检测体系和rt-pcr的方法进行检测，将lamp产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取大小200bp左右的条带，用胶回收试剂盒回收目标片段连接于peasy-t1载体，连接产物转入trans1-t1感受态细胞，选取阳性克隆送去测序验证。对于这10份疑似cpsv样品，rt-lamp和rt-pcr检测结果一致，结果如图2所示，均有4个样品感染cpsv。
感染cpsv的样品的测序结果显示所克隆的片段大小为206bp，在ncbi数据库中进行序列比对，其与cpsv代表株系p-121的核苷酸同源性为96％，说明获得的序列为cpsv的基因组序列。
1.5rt-lamp特异性及灵敏度测定
用建立的lamp方法检测感染了ctv、cyvcv、clbv、hlb和cpsv的样品，结果如图2所示，只有cpsv的样品为阳性，表明体系可以特异性检测cpsv。
将提取cpsv的柑橘样品总rna经nandrop2000进行浓度测试，并将其10倍梯度稀释至10-4后作为模板，分别用于rt-lamp和rt-pcr检测。经测定感染cpsv的样品核酸总浓度为2.0μg/μl，经10倍梯度稀释后的检测结果如图3所示，rt-lamp可检测的最小核酸浓度为2.0×10-2μg/μl，rt-pcr可检测的最小核酸浓度为2.0×10-1μg/μl，rt-lamp的灵敏度是rt-pcr灵敏度的10倍。
rt-pcr一步法反应体系为：以1μlrna和1μlddh2o为模板，变性后加入10μl的混合液(2×1stepbuffer5μl，10μmol.l-1的上下游引物序列是f：5’-cggttattatcctctcggc-3’(seqidno:17)，r：5’-gcctttctgtctgggttgt-3’(seqidno:18)各0.2μl，primescript1stepenzymemix0.3μl(takara公司，primescriptonesteprt-pcrkitver.2))，ddh2o4.3μl；扩增条件为95℃解链5min；50℃反转30min；95℃预变性3min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸(1kb/min)，30个循环；72℃延伸10min。
序列表
<110>西南大学
<120>柑橘鳞皮病毒的rt-lamp检测试剂盒和方法
<160>18
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
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ctttgagtccatcaactgtt20
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<212>dna
<213>人工序列
<223>b3-5
<400>2
tcactctgaagctgacat18
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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gaaaccccttgttcttgtcgggtgctataatttacagcctca42
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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cctggaaaaaccgatgataaaaggcaccatcatacagcttcg42
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<212>dna
<213>人工序列
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<400>9
tgtgataaacttacatcaccat22
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caacttgttcaagatggaac20
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<400>15
gcaaagagagcaattcaagcgttttccaggaagagatcct40
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<211>43
<212>dna
<213>人工序列
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aatcacacactccatcaacttggaagggagatactaagtcact43
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<212>dna
<213>人工序列
<223>rt-pcr的上游引物
<400>17
cggttattatcctctcggc19
<210>18
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<223>rt-pcr的下游引物
<400>18
gcctttctgtctgggttgt19