本发明属生物技术领域，涉及检测乙型肝炎病毒的方法及试剂盒，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒共价闭合环状脱氧核糖核酸(hbvcccdna)的方法以及试剂盒。
背景技术：
现有技术公开了乙型肝炎病毒(hbv)属于嗜肝dna病毒家族，其基因组是双链松弛环状dna(relaxedcircu2lar，rcdna)，相对分子量为(116～210)×109全长约为312kb。研究表明，在hbv的生活周期中，共价闭合环状dna(covalentlyclosedcirculardna，cccdna)的形成是关键一步，其是hbv的原始复制模板，对乙肝病毒的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义。有研究显示，cccdna的半衰期约为33～70天，只要肝细胞中还存在cccdna，乙肝病毒的复制就不会停止，即使在药物的强烈抑制下，肝细胞中的cccdna仍然在少量复制，因此停用药物后，常可见到患者病情的反复，因此，研究人员认为，只有清除细胞核内的cccdna，才能彻底清除乙肝患者病毒携带状态。
乙型肝炎病毒共价闭合环状dna(covalentlyclosedcirculardna,cccdna)的发现与检测方法的建立始于上世纪80年代。最初采用dna电泳及southern杂交检测技术，发现慢性乙型肝炎患者肝组织内存在一种电泳带位置为2.0kb左右的hbvdna分子，并在电镜下证实为大小约3.2kb的超螺旋dna分子；20世纪90年代，pcr技术开始应用于cccdna检测，kock(hepatology,1996)等建立了选择性pcrcccdna检测技术；本世纪初，香港学者he(biochembiophysrescommun2002)等建立了选择性数字微滴pcr检测cccdna的技术，实现了真正意义上的定量检测。
目前cccdna检测技术面临的主要问题是特异性和敏感性，尚存在争议。有研究在研究过程中发现了一些引人注意的问题，如：通常国内外有关机构将实验室建立的技术用于临床标本的检测，但迄今为止，国内外尚无公认的、较稳定并得到cfda正式批准的hbvcccdna检测试剂盒问世；采用相同或不同技术研究外周血单个核细胞内是否存在cccdna，所得出结论截然相反；若干作者报告在慢性乙型肝炎的血清内检测到了高含量hbvcccdna，个别报告甚至高达107拷贝/ml，结果的可信度值得探讨；越来越多的研究报告采用cccdna定量检测结果比较或评价抗病毒药物疗效，但是鲜有作者关注cccdna检测技术问题。
业内共识，建立hbvcccdna检测技术的难点在于体内有大量与cccdna序列同源性较高的其他形式的hbvdna存在，包括：①成熟病毒颗粒中的松弛、环状、双链dna(relaxedcirculardna，rcdna)分子；②在5％～10％的病毒颗粒中存在的双链线性dna分子(double-strandlineardna，dsl-dna)；③由前基因组rna(pregenomicrna，pgrna)逆转录形成的单链dna(single-strandeddna，ssdna)。选择性荧光定量pcr的设计原理是：由于rcdna的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcdna不会被扩增，而cccdna则可被选择性扩增，如模板为dsl-dna或ssdna，由于两条引物的方向相反，也不会被扩增；嵌合引物法和侵入分析法区分rcdna和cccdna的主要依据是rcdna的正链不完整，因而嵌合引物或初始探针不能与之互补结合；但是，dsl-dna分子用两种方法均可以被扩增，两种方法的检测低限为50拷贝/反应，相当于模板浓度为5×104拷贝/ml，由于dsl-dna占总病毒基因组载量的5％～10％，当病毒载量超过5×104～1×104拷贝/ml，可出现病毒基因组“非特异”扩增而出呈假阳性。
研究实践中，通常采用下述方式解决上述方法的缺陷：一，需要通过反复实验，确定每一种方法能有效区分cccdna和其他形式的hbvdna的“安全”范围；二，在“噪声”背景较高时，采取有效措施降低其他形式hbvdna的含量，从而消除它们对cccdna检测的影响，根据cccdna本身的特殊性可以提高检测特异性，如，根据cccdna分布特点，cccdna仅位于细胞核内，而其他几种dna分子均位于细胞浆内，可采用细胞核分离技术，将细胞核分离出来进行cccdna检测；另外，其他三种dna均位于核衣壳蛋白中，且末端与p蛋白共价结合，易于与十二烷基硫酸钠(sds)结合，加氯化钾后即形成沉淀，通过离心可加以分离；另外，cccdna不能被一些酶如绿豆核酸酶(mungbeannuclease，mbn)等降解，而其他形式的dna可降解，等等。
基于现有技术的现状，本申请的发明人结合市场需求，拟提供一种乙型肝炎病毒cccdna的数字微滴pcr检测方法及其试剂盒。本发明采用专用组织dna提取试剂盒提取hbvdna，同时采用选择性荧光定量pcr技术对乙型肝炎病毒cccdna进行检测，在核酸提取结束后，采用psad酶(plasmid-safeatp-dependentdnase)处理，该操作可以提高检测cccdna的灵敏性和特异性。
技术实现要素：
本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷，提供一种乙型肝炎病毒cccdna的数字微滴pcr检测方法及其试剂盒。具体涉及一种设计有高特异性的引物借助微滴数字pcr系统实时检测乙型肝炎病毒cccdna的方法；
本发明的另一目的在于提供一种用于上述方法的试剂盒。
本发明采用专用组织dna提取试剂盒提取hbvdna，同时采用选择性荧光定量pcr技术对乙型肝炎病毒cccdna进行检测，在核酸提取结束后，采用psad酶(plasmid-safeatp-dependentdnase)处理，该操作可以提高检测cccdna的灵敏性和特异性。
本发明中，在对hbv序列分析的基础上，设计跨越两个缺口的引物，使rcdna不被扩增，而cccdna则可被选择性扩增。
更具体的，本发明的一种乙型肝炎病毒cccdna的数字微滴pcr检测方法及其试剂盒包括：
在按下述方法设计的引物和探针存在下，用psad酶预处理乙肝病毒dna，实现对hbvcccdna特异性检测：
1、引物和探针的制备：
根据hbv全序列，在hbv基因组前c编码区，设计并合成如下序列的引物：
pcr引物f：5’-tccccgtctgtgccttc-3’(nt1547-nt1565)
pcr引物r：5’-ccccaaagccacccaa-3’(nt1902-nt1887)
2、制备包括以下成分的试剂盒：
一对特异性hbv引物、taq酶、plasmid-safeatp-dependentdnase酶、乙型肝炎病毒cccdna阳性对照、阴性对照和pcrbuffer；
3、制备反应液：
反应液每份为26μl，每份反应液中含组分：5×pcrbuffer，0.2mmol/ldntps，
2.5mmol/lmgcl2，引物hbv-f和hbv-r各0.2μmol/l，dna聚合酶1u；
4、psad酶处理hbvdna：在25μl总反应体系中：依次加进1μl25mmatp，
2.5μl10倍的buffer，提取好的乙肝dna模板溶液12.5μl，和0.5μl的质粒保护dna酶，再用25μl。将反应体系置于37℃环境中温育30min，再70℃灭活30min；
5、定量检测：psad酶处理的hbvcccdna，浓度分别为108、107、106、105、104copies/ml的5个标准品各4μl，各加入步骤(3)制得的反应液26μl，分别放入各个反应管中进行处理，同时设空白管和阴性对照；各反应管进行扩增，将含待测样品反应管的扩增结果与其它反应管扩增结果比较，得出待测样品中hbvcccdna的含量。
本发明中，步骤（5）中的扩增是于伯乐微滴数字pcr仪中进行扩增：扩增时的温度条件依次为50℃下2分钟、94℃预变性4分钟、94℃下15秒、60℃45秒构成一个循环，共40个循环。
本发明经对150例阳性乙型肝炎临床样品进行检测，结果显示，其中检出hbvcccdna患者141例，占总数的94％，并且能够对hbvcccdna进行准确定量分析，明显优于一般方法，本发明具有特异性好，灵敏度高，定量准确，快速简便，重复性好的特点，有宜于提高检测cccdna的灵敏性和特异性，本发明的方法及试剂盒不仅可用于hbvcccdna的检测，也可作为临床实验室对hbv感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1-3分别显示了于伯乐数字pcr仪中进行扩增的扩增结果。
具体实施方式
实施例1按下述步骤进行乙型肝炎病毒cccdna数字微滴pcr检测
1、组成乙型肝炎病毒cccdna数字微滴pcr诊断试剂盒：一对特异性引物phbv、一条taqman荧光探针fphbv、taq酶、plasmid-safeatp-dependentdnase酶、乙型肝炎病毒cccdna阳性对照、阴性对照、乙型肝炎病毒cccdna；
定量标准品和pcrbuffer；
2、根据hbv全序列，在hbv基因组前c编码区，应用beacondesigner2.1软件，设计并合成如下序列的引物：
pcr引物f：5’-tccccgtctgtgccttc-3’(nt1547-nt1565)
pcr引物r：5’-ccccaaagccacccaa-3’(nt1902-nt1887)
3、制备反应液：反应液每份为26μl，每份反应液中含下列组分：5×pcrbuffer，
0.2mmol/ldntps，2.5mmol/lmgcl2，引物hbv-s和hbv-as各0.2μmol/l，探针hbv-p0.1μmol/l，dna聚合酶1u；
4、psad酶处理hbvcccdna：在25μl总反应体系中：依次加进1μl25mmatp，2.5μl10倍的buffer，提取的乙肝dna模板溶液12.5μl，和0.5μl的质粒保护dna酶，再用25μl，将反应体系置于37℃环境中温育30min，再70℃灭活30min；
5、荧光定量检测：psad酶处理的hbvcccdna，浓度分别为108、107、106、105、104copies/ml的5个标准品各4μl，各加入步骤(3)制得的反应液26μl，分别放入各个反应管中进行处理
，同时设空白管和阴性对照；各反应管进行扩增，将含待测样品反应管的扩增结果与其它反应管扩增结果比较，得出待测样品中hbvcccdna的含量；
其中的扩增是于伯乐数字pcr仪中进行扩增：扩增时的温度条件依次为50℃下2分钟、94℃预变性10分钟、94℃下15秒、60℃45秒构成一个循环，共40个循环；
附图1-3分别显示了扩增结果。
实施例2临床检测
采用本发明方法对150例阳性乙型肝炎临床样品进行检测，结果显示，其中检出hbvcccdna患者141例，占总数的94％，并且能够对hbvcccdna进行准确定量分析，明显优于一般方法，具有特异性好，灵敏度高，定量准确，快速简便，重复性好的优点；尤其本发明中设计跨越两个缺口的引物，使rcdna不被扩增，而cccdna则可被选择性扩增，而且通过psad酶对提取的样本dna进行处理，能有效降低非cccdna扩增，进一步提高检测的灵敏性和特异性。
本发明不仅可用于hbvcccdna的检测，也可作为临床实验室对hbv感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。
sequencelisting
<110>复旦大学附属华山医院
<120>一种乙型肝炎病毒cccdna的数字微滴pcr检测方法及其试剂盒
<130>
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>3215
<212>dna
<213>乙肝病毒序列
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