本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种引物对、试剂盒及用途和检测紫花苜蓿产品中是否含有大豆的方法。
背景技术：
紫花苜蓿(medicagosatival.)具有优质、高产、饲用价值高(粗蛋白含量21％)、适口性好和用途广泛等特点，被世界誉为“牧草之王”。牧草颗粒化后，密度比原样增加5倍以上，具有体积减少，方便贮存和运输的优点。紫花苜蓿草颗粒因其体积小、饲喂便捷、营养价值较高，耐贮藏的特点，深受养殖户的青睐，是紫花苜蓿作为饲料来使用的重要方式。欧美国家使用的牛饲料约50％以上是草颗粒，饲喂苜蓿颗粒可显著提高奶牛的产奶量和牛奶的品质，粗饲料颗粒化也是我国饲料工业的发展方向。紫花苜蓿草颗粒是饲料贸易中的重要角色。
大豆[glycinemax(linn.)merr.]是世界上重要的油料作物之一，2008年中国大豆种植面积为955万hm2，较2007年增加9.1％，再创历史新高。虽然大豆的适用范围广泛，但大豆的秸秆利用价值却不大。大豆秸秆由于质地硬和木质素含量较高，仅在春季饲草短缺、饲草价格昂贵的时候才用做牛、羊粗饲料，如果把大豆的秸秆打碎后添加进紫花苜蓿草颗粒中，会使草颗粒的品质下降，大豆秸秆直接作为饲料营养价值较低，其干物质瘤胃有效降解率仅有17.98％，从而使消费者的权益受到伤害。
紫花苜蓿打成草粉用来制作草颗粒时，通过肉眼来分辨其中是否混有大豆秸秆是不可能的，如果使用者购买了大量的含有大豆秸秆的紫花苜蓿草颗粒将会对消费者的权益受到巨大的损害，用常规化学分析法检测苜蓿草颗粒质量会耗费大量人力、物力、财力，并且现在国内外还没有一个统一的、行之有效的检测方法。准确迅速检测紫花苜蓿草颗粒中是否含有其他作物秸秆是苜蓿草颗粒质量检验中的一大难题。因此一种检测紫花苜蓿草颗粒饲料中是否掺杂大豆秸秆的方法是目前市场需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种检测紫花苜蓿和大豆的引物对，缓解了现有技术中检测技术不足的技术问题，该引物对可以扩增出紫花苜蓿和大豆的dna片段，并且由于紫花苜蓿和大豆的扩增产物片段长度不同，因此可以同时检测出待测样品中是否含有紫花苜蓿和/或大豆。
本发明的第二目的在于提供一种包含上述引物对的试剂盒，该试剂盒配合其他分子生物学实验中常用试剂具有广泛的用途。
本发明的第三目的在于提供一种上述引物对或上述试剂盒在在检测紫花苜蓿和/或大豆中的用途，该用途十分广泛，可应用于检测待测样品中是否含有紫花苜蓿和/或大豆，并且由于该引物对灵敏度高，该引物对及包含其的试剂盒适合用于检测多种待测样品，即使待测样品中包含较少的紫花苜蓿和/或大豆，上述引物对及包含其的试剂盒也可以将紫花苜蓿和/或大豆检出。
本发明的第四目的在于提供一种检测紫花苜蓿产品中是否含有大豆的方法，缓解了现有技术中缺乏一种检测紫花苜蓿产品中是否掺杂大豆的方法的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
一种检测紫花苜蓿和大豆的引物对，所述引物对包含引物md5-f和引物md5-r；
所述引物md5-f具有如seqidno.1所示序列，所述引物md5-r具有如seqidno.2所示序列。
进一步的，引物md5-f和/或引物md5-r经过修饰；
进一步的，所述修饰包括在引物的5’端和/或3’添加标记物；
进一步的，所述标记物包括荧光标记、生物素标记或地高辛标记。
本发明还提供了一种包含上述引物对的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒还包括mg2+、dntp，dna聚合酶和pcrbuffer。
本发明还提供了一种上述引物对或上述试剂盒在检测紫花苜蓿和/或大豆中的用途。
本发明还提供了一种检测紫花苜蓿产品中是否含有大豆的方法，该包括如下步骤：对紫花苜蓿产品的dna进行pcr扩增，并检测扩增产物中是否含有大豆的dna片段，若产物中含有大豆的dna片段，则紫花苜蓿中包含大豆；
其中，所述pcr扩增时使用的引物包含上述引物对。
进一步的，所述紫花苜蓿产品为紫花苜蓿草颗粒饲料。
进一步的，所述pcr扩增的体系为20μl体系，其中包括2×pcrmaster10μl，浓度为50ng/μldna模板1μl，浓度为10nm的引物md5-f1μl，浓度为10nm的引物md5-r1μl和ddh2o7μl；
其中2×pcrmaster包括3mmmgcl2、0.2mmdntp、0.1u/μltaq和2×pcrbuffer。
进一步的，所述pcr扩增的条件为a)94℃预变性4分钟；b)94℃变性30秒；c)55-65℃退火30秒；d)72℃延伸30秒；步骤b)-d)循环25-40次；e)72℃延伸7分钟；
其中，步骤b)-d)优选循环30-38次；更优选循环32-36次；
退火温度优选为55-62℃；更优选为57-59℃。
进一步的，使用凝胶电泳的方法检测扩增产物；其中，所述凝胶为6％-10％的page胶；所述电泳的条件为：电压180-220v，电泳时间90-120min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的检测紫花苜蓿和大豆的引物对，可以同时扩增出紫花苜蓿和大豆的dna片段，并且其扩增紫花苜蓿和大豆的扩增产物长度不相同，因此一次扩增待测样品即可分辨出待测样品中是否含有紫花苜蓿和/或大豆，避免了分开扩增时由于扩增效率的差异或者人员操作的误差导致的假阳性或假阴性。
本发明提供的包含上述引物对的试剂盒，该试剂盒将上述引物对预先制备成为试剂盒，可提高实验效率，该试剂盒配合其他分子生物学实验中常用试剂具有广泛的用途。
本发明提供的上述引物对或上述试剂盒在检测紫花苜蓿和/或大豆中的用途十分广泛。上述引物对能够从待测样品中检测出其中是否含有紫花苜蓿和/或大豆。并且由于该引物对灵敏度高，该引物对及包含其的试剂盒适合用于检测多种待测样品，即使待测样品中包含较少的紫花苜蓿和/或大豆，上述引物对及包含其的试剂盒也可以将紫花苜蓿和/或大豆检出。并且在实际生产中，由于紫花苜蓿是一种应用广泛且营养丰富的饲料，而大豆秸秆产量丰富但并不适用于饲料，存在在紫花苜蓿饲料中掺杂大豆秸秆以次充好的问题，因此将上述引物对或上述试剂盒应用于检测紫花苜蓿和/或大豆是十分具有价值的。
本发明提供的检测紫花苜蓿产品中是否含有大豆的方法，可以在1％水平上有效的检测出紫花苜蓿产品中是否混有大豆秸秆。此方法具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等优点，能够进行大批量紫花苜蓿产品的检测，为保障紫花苜蓿产品草颗粒饲料的纯度检测提供可行依据。该方法可以快速、高效和准确的检测紫花苜蓿产品中是否混有大豆，省时省力，操作简便，在实验室条件下较短时间内能够很好的完成。该方法使紫花苜蓿产品更好的为畜牧业生产服务，为保障饲草安全打下坚实的基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4提供的pcr扩增产物电泳图；
图2为本发明实施例4提供的pcr扩增产物电泳图；
图3为本发明实施例6提供的pcr扩增产物电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种检测紫花苜蓿和大豆的引物对，所述引物对包含引物md5-f和引物md5-r；其中，所述引物md5-f具有如seqidno.1所示序列，所述引物md5-r具有如seqidno.2所示序列。
引物md5-f和引物md5-r可以同时扩增出紫花苜蓿和大豆的dna片段，并且其扩增紫花苜蓿和大豆的扩增产物长度不相同，因此一次扩增待测样品即可分辨出待测样品中是否含有紫花苜蓿和/或大豆，避免了分开扩增时由于扩增效率的差异或者人员操作的误差导致的假阳性或假阴性。
可以理解的是，当待测样品中只含有紫花苜蓿时，使用上述引物对可以扩增出紫花苜蓿的dna片段；当待测样品中只含有大豆时，使用上述引物对可以扩增出大豆的dna片段；当待测样品中同时含有紫花苜蓿和大豆时，上述引物对可以同时扩增出紫花苜蓿和大豆的dna片段，并且紫花苜蓿和大豆的扩增产物不同，扩增后可以分辨出上述引物对扩增出的两种产物，因此可以从上述引物对的扩增产物中知晓待测样品中同时包含紫花苜蓿和大豆两种成分。
在本发明的引物对的一种扩增产物中，引物md5-f和引物md5-r扩增出紫花苜蓿的dna片段具有如seqidno.3所示序列，该序列片段长度为194bp，其互补序列如seqidno.4所示；引物md5-f和引物md5-r扩增出大豆的dna片段具有如seqidno.5所示序列，该序列片段长度为203bp，其互补序列如seqidno.6所示。
在一些可选的实施方式中，引物md5-f和/或引物md5-r经过修饰；所述修饰例如可以为但不限于为磷酸化、生物素标记、地高辛标记、荧光基团标记、硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰或脱氧次黄嘌呤修饰。可以理解的是只要符合分子生物学实验的常规实验原理，本发明不限制引物的修饰方式。在一些优选的实施方式中，所述引物使用荧光标记修饰，经荧光标记修饰的引物可用于荧光定量pcr。
本发明还提供了一种包含上述引物对的试剂盒。将上述引物对预先制备成为试剂盒，可提高实验效率，该试剂盒配合其他分子生物学实验中常用试剂可以具有广泛的用途。例如该试剂盒可选地包括mg2+、dntp、dna聚合酶等pcr试剂时可以作为pcr扩增试剂盒，当进一步还包括荧光染料时可以作为荧光定量pcr试剂盒。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括3mmmgcl2、0.2mmdntp，0.1u/μltaq酶和2×pcrbuffer。可以理解的是，该试剂盒可以用于检测待测样品中是否独立的包含紫花苜蓿或大豆，也可以用于检测是否同时包含紫花苜蓿和大豆；当该试剂盒还包含检测其他物种的引物时，也可用于同时检测多种物种的样品。
本发明还提供了一种上述引物对或上述试剂盒在检测紫花苜蓿和/或大豆中的用途。由于上述引物对灵敏度高，该引物对及包含其的试剂盒适合用于检测多种待测样品，即使待测样品中包含较少的紫花苜蓿和/或大豆，上述引物对及包含其的试剂盒也可以将紫花苜蓿和/或大豆检出。上述引物对不仅能够从待测样品中检测出其中是否含有紫花苜蓿和/或大豆，更重要的是还可以在包含紫花苜蓿的待测样品中检测出其中是否混有大豆，由于紫花苜蓿是一种应用广泛且营养丰富的饲料，而大豆秸秆产量丰富但并不适用于饲料，存在在紫花苜蓿饲料中掺杂大豆秸秆以次充好的问题，因此将上述引物对或上述试剂盒应用于检测紫花苜蓿产品中是否含有大豆是十分具有价值的。
本发明还提供了一种检测紫花苜蓿产品中是否含有大豆的方法，该方法包括如下步骤：对紫花苜蓿产品的dna进行pcr扩增，并检测扩增产物中是否含有大豆的dna片段，若产物中含有大豆的dna片段，则紫花苜蓿中包含大豆；其中，所述pcr扩增时使用的引物包含上述引物对，既引物md5-f和引物md5-r。
可以理解的是，所述pcr扩增时使用的引物除了引物md5-f和引物md5-r还可以包含其他引物对，以达到同时扩增其他目的片段的目的。例如当需要检测紫花苜蓿中是否还掺杂其他作物时，可以添加相应的引物，进行复合pcr，本发明不限制添加的其他引物对，可以理解的是，另添加的引物对不应该影响本发明引物对的扩增效率。可以理解的是，上述pcr例如可以为但不限于为普通pcr、荧光定量pcr或高分辨率溶解度曲线(hrm)等，本发明不限制pcr的类型，只要可以使用本发明提供的引物对对待测样品的dna进行链式聚合酶反应即可；本发明也可以进一步对pcr的体系和使用的试剂进行改进以增强pcr的反应效率，但这些改进都是基于扩增时使用本发明提供的引物对完成的。
本发明提供的检测紫花苜蓿产品中是否含有大豆的方法，可以在1％水平上有效的检测出紫花苜蓿产品中是否混有大豆秸秆。此方法具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点，能够进行大批量紫花苜蓿产品的检测，为保障紫花苜蓿产品的纯度检测提供可行依据。该方法可以快速、高效和准确的检测紫花苜蓿产品中是否混有大豆。此方法省时省力，操作简便，在实验室条件下较短时间内能够很好的完成。使紫花苜蓿产品更好的为畜牧业生产服务，为保障饲草安全打下坚实的基础。
在一些可选的实施方式中，所述紫花苜蓿产品为紫花苜蓿草颗粒饲料。牧草颗粒化后，密度比原样增加5倍以上，具有体积减少，方便贮存和运输的优点。紫花苜蓿草颗粒因其体积小、饲喂便捷、营养价值较高，耐贮藏的特点，深受养殖户的青睐，是紫花苜蓿作为饲料来使用的重要方式。而在紫花苜蓿草颗粒中添加大豆秸秆作为饲料是以次充好的主要方式，但是紫花苜蓿打成草粉用来制作草颗粒时，通过肉眼来分辨其中是否混有大豆秸秆是不可能的。而本发明提供的方法通过检测紫花苜蓿草颗粒饲料中是否含有大豆dna来鉴别紫花苜蓿草颗粒饲料中是否含有大豆秸秆，该方法避免了肉眼观察和化学检测，具有速度快，通量大，只需很少的样品即可完成检测的优点，且灵敏度和准确性具较高。
在一些可选的实施方式中，所述pcr扩增的体系为20μl体系，其中包括2×pcrmaster10μl，浓度为50ng/μldna模板1μl，浓度为10nm的引物md5-f1μl，浓度为10nm的引物md5-r1μl和ddh2o7μl；其中2×pcrmaster包括3mmmgcl2、0.2mmdntp、0.1u/μltaq和2×pcrbuffer。在用于检测的pcr扩增反应中，20μl体系即可以满足扩增后产物检测的用量的需要。可以理解的是，上述pcr体系可以根据实际的实验和检测情况进行调整和优化。
在一些可选的实施方式中，上述pcr扩增的条件为a)94℃预变性4分钟；b)94℃变性30秒；c)55-65℃退火30秒；d)72℃延伸30秒；e)72℃延伸7分钟；其中，步骤b)-d)循环25-40次。可选地，上述退火温度例如可以为但不限于为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃，优选57-59℃，更优选58℃；可选地，步骤b)-d)循环次数例如可以为但不限于为25、28、30、32、35、38或者40次，优选32-36次。上述pcr扩增条件可以根据pcr体系的改变进行调整和优化。
在一些可选的实施方式中，例如可以为但不限于使用聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳等方法检测pcr扩增的产物，也可以将pcr产物直接测序，或者当使用荧光定量pcr或hrm等可以在pcr扩增的同时显示产物的方法时，也可以选择不使用额外的技术手段检测pcr的扩增产物，因此可以理解的是本发明不限制pcr产物的检测方法。在一个优选地的实施方式中，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法检测扩增产物，该方法成本低，速度快，不需要额外修饰引物；优选使用凝胶为6％-10％的page胶，例如可以为但不限于浓度为6％、7％、8％、9％或10％的page胶，优选浓度为8％的page胶；在电压180-220v的条件下电泳90-120min；可选的，电压条件例如可以为但不限于为180v、185v、190v、200v、210v或220v，优选200v；可选的，电泳时间例如可以为但不限于为90min、100min、105min、110min或120min；优选100min；可以通过调整优化电泳的条件使电泳的条带更为清晰。
下面结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1一种检测紫花苜蓿和大豆的引物对
本实施例提供了一种检测紫花苜蓿和大豆的引物对，该引物对包含引物md5-f和引物md5-r，其中，引物md5-f具有如seqidno.1所示序列，引物md5-r具有如seqidno.2所示序列。
md5-f(5′-3′)：tccgtaccaactcaagatatgc
md5-r(5′-3′)：taagctccaattgcatcatagg
实施例2一种检测紫花苜蓿和大豆的试剂盒
本实施例提供了一种检测紫花苜蓿和大豆的试剂盒，该试剂盒包含如下组分：引物md5-f和引物md5-r、2×pcrmaster和ddh2o；
其中2×pcrmaster包含3mmmgcl2，0.2mmdntp，0.1u/μltaq和2×pcrbuffer。
实施例3一种检测紫花苜蓿草颗粒饲料中的大豆的方法
本实施例提供了一种检测紫花苜蓿草颗粒饲料中的大豆的方法，该方法包含如下步骤：
a)收集紫花苜蓿草颗粒，提取草颗粒基因组dna备用；
b)使用引物md5-f和引物md5-r对步骤a)中提取的基因组dna进行pcr扩增；
pcr扩增体系为20μl体系，其中包括2×pcrmaster10μl，浓度为50ng/μldna模板1μl，浓度为10nm的引物md5-f1μl，浓度为10nm的引物md5-r1μl和ddh2o7μl；其中2×pcrmaster包括3mmmgcl2、0.2mmdntp、0.1u/μltaq和2×pcrbuffer；
pcr扩增程序：a)94℃预变性4分钟；b)94℃变性30秒；c)58℃退火30秒；d)72℃延伸30秒；步骤b)-d)循环35次；e)72℃延伸7分钟；
c)pcr产物检测：用8％的page胶进行检测，100ml体系，53.0mlh2o，26.3ml聚丙烯，20ml5×tbe，700μl35％过硫酸铵，70μltemed，凝固50min，在竖板电泳仪中，200v电压电泳1h40min，之后用核酸染料染色，放在凝胶成像仪上照相；
若扩增产物中包含大豆dna片段，则待测紫花苜蓿草颗粒饲料中掺杂有大豆。
实施例4验证引物md5-f和引物md5-r的有效性
提取10个紫花苜蓿品种，如表1所示，每个品种各随机提取5个单株的基因组dna，将其浓度稀释为50ng/μl，用作pcr中dna模板；
提取10个大豆品种，如表2所示，每个品种各随机提取3个单株的基因组dna，将其浓度稀释为50ng/μl；用作pcr中dna模板；
表1紫花苜蓿品种参试材料的信息描述
表2大豆品种参试材料的信息描述
使用引物md5-f和引物md5-r对上述提取的紫花苜蓿基因组dna和大豆基因组dna进行pcr扩增；
pcr扩增体系为20μl体系，其中包括2×pcrmaster(上海生工产品编号：sk2082)10μl，浓度为50ng/μldna模板1μl，浓度为10nm的引物md5-f1μl，浓度为10nm的引物md5-r1μl和ddh2o7μl；
pcr扩增程序如下：a)94℃预变性4分钟；b)94℃变性30秒；c)58℃退火30秒；d)72℃延伸30秒；步骤b)-d)循环35次；e)72℃延伸7分钟；
pcr产物检测：用8％的page胶进行检测，100ml体系，53.0mlh20，26.3ml聚丙烯，20ml5×tbe，700μl35％过硫酸铵，70μltemed，凝固50min，在竖板电泳仪中，200v电压电泳1h40min，之后用核酸染料染色，放在凝胶成像仪上照相，结果如图1和图2所示，其中各泳道代表的样品如表1和表2所示，泳道m表示marker；
其中，图1、图2显示以10个品种的紫花苜蓿的50个单株基因组dna为模板的电泳条带清晰明亮，而以10个品种的大豆的30基因组dna为模板的电泳条带也清晰明亮，都与预测的条带基本一致，电泳条带之间相差9bp，能够明显的区分出大豆和紫花苜蓿。
实施例5：验证引物md5-f和引物md5-r扩增产物
为进一步验证引物md5-f和引物md5-r的有效性，对紫花苜蓿和大豆的扩增产物的dna片段进行了测序。其结果显示紫花苜蓿和大豆dna的扩增产物中都包含引物md5-f和引物md5-r。
以50ng/μl紫花苜蓿基因组dna为模板，采用引物md5-f和引物md5-r进行pcr扩增。pcr体系和方法同实施例4。pcr产物经2％琼脂糖中检测，回收长度约190bp的dna片段，连接pgem-t载体后得到重组质粒pgem-t-md5-紫花苜蓿，然后将该质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。将含pgem-t-md5-紫花苜蓿质粒的大肠杆菌涂于含amp、iptg和x-gal的lb培养基上，37℃过夜培养，挑取3个阳性克隆菌斑，在含amp的lb液体培养基中37℃过夜摇菌培养。菌液检测后与预计条带大小相符，送上海生工生物工程有限公司进行测序，送测3个阳性克隆紫花苜蓿片段。结果显示，引物md5-f和引物md5-r可以很好地扩增出紫花苜蓿194bp的基因片段。其中扩增出的紫花苜蓿的片段具有如seqidno.3所示序列，该序列片段长度为194bp，其互补序列如seqidno.4所示。
以50ng/μl大豆基因组dna为模板，采用引物md5-f和引物md5-r进行pcr扩增。pcr体系和方法同实施例4。pcr产物经2％琼脂糖中检测，回收长度约200bp的dna片段，连接pgem-t载体后得到重组质粒pgem-t-md5-大豆，然后将该质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。将含pgem-t-md5-大豆质粒的大肠杆菌涂于含amp、iptg和x-gal的lb培养基上，37℃过夜培养，挑取3个阳性克隆菌斑，在含amp的lb液体培养基中37℃过夜摇菌培养。菌液检测后与预计条带大小相符，送上海生工生物工程有限公司进行测序，送测3个阳性克隆大豆片段。结果显示，引物md5-f和引物md5-r可以很好地扩增出大豆203bp的基因片段。其中扩增出的大豆的片段具有如seqidno.5所示序列，该序列片段长度为203bp，其互补序列如seqidno.6所示。
实施例6对紫花苜蓿与大豆基因组不同比例的检验
把大豆和紫花苜蓿的dna，分别以100:0、99:1、75:25、50:50、25:75、1:99、0:100的质量比例混样，然后按照实施例4提供的检测方法进行pcr和电泳，显示引物md5-f和引物md5-r能够清晰的区分紫花苜蓿中含有的1％的大豆基因，因而能够较精准的检测紫花苜蓿草颗粒的质量。结果图3所示，其中泳道1-7分别表示：大豆和紫花苜蓿的dna的混样比例为100:0、99:1、75:25、50:50、25:75、1:99和0:100，泳道m表示marker。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
sequencelisting
<110>兰州大学
<120>引物对、试剂盒及用途和检测紫花苜蓿产品中是否含有大豆的方法
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<213>紫花苜蓿（medicagosatival）
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