专利名称：：一种苜蓿种子加速老化测定方法
技术领域：
：本发明涉及苜蓿种子活力测定方法的研究与应用，属于种子质量检测技术。
背景技术：
：植物种子是进行农林园艺生产的最基本生产资料，种子质量的优劣直接关系到生产的效益。据统计，在美国每年生产的种子中，有25%的种子发生质量问题，造成的经济损失价值可达5亿美元。在世界范围内，种子劣变造成的经济损失将更加巨大。种子和其它一切活的有机体一样，必然经过出生、生长、发育、成熟到衰亡的一个过程。种子在母株上从形成发育直到成熟，经收获而贮藏的过程中，无时无刻不受外^境条件的影响。种子在其生理成熟时，活力达到最高点，此后，生命将随着不停的衰老过程向着死亡推移，而活力也越来越降低。这种不停的衰老过程就是老化和劣变。种子活力与种子的劣变存在密切相关，即种子活力水平高则种子劣变程度就低。因此种子活力与种子劣变的关系是现代活力和活力测定的主要生物学基础。老化一般指种子逐渐自然衰老，劣变指种子生理机能明显恶化。一般来说，种子的老化和劣变是不可避免的客观事实。种子的老化和劣变的结果有轻度和重度两种，轻度可以导致活力下降，劣变早期在发芽率上是看不出差别的，只有表现在发芽速率和幼苗长势的下降上，同时也会影响到幼胚、幼苗以至植株的抗逆性，劣变后期表现为发芽率的略为降低。重度老化、劣变者，不仅在发芽率上明显变化，而且会出现畸形苗，以致最后完全丧失发芽率。种子活力(Seedvigour)是决定种子或种子批在萌发和出苗期间活性和表现水平的所有特性的总和，是反映种子质量劣变的主要指标之一。活力测定可反映种子在田间或贮藏条件下的潜在质量表现，在种子质量管理中具重要意义。自1950年国际种子检验协^(ISTA)将活力列为种子质量评价指标以来，活力测定方法的研究一直为国际种子工作者所重视与关注。活力与标准发芽率的主要差别在于，其不是单一的而是反应种子质量综合水平的指标。因此，如何在种子众多特性中确定出能够普遍反应活力水平(或劣变程度)的指标，并将其作为某种或某一类作物种子的活力测定方法，始终是各国种子科技工作者致力解决的命题之一。历经半个多世纪的不懈努力，一些种子活力测定方法已应运而生，ISTA和美国官方种子检验员协会(AOSA)先后出版的《活力测定方法手册》、《ISTA种子检验规程》和《种子活力测定手册》，是对国际种子活力测定方法研究工作的系统总结和对主要方法的详细阐述。由于新检验方法的陆续提出和对早期方法的不断改进，ISTA与AOSA等机构仍将继续致力于促进检验方法的研究和推进方法标准化工作的进程。人工加速老化法是一种由美国J.C.Delouche(1965购造的检查种子质量的方法。Helruer等(1962)对不同类型种子的寿命和耐藏性的研究后认为，加速老化测定可预测种子的耐藏力和生长表现。该法目前已在全世界广泛应用，主要用于预测种子的耐藏力和活力的强弱，具有简便、经济和适用度广的特点。人工加速老化测定方法是测定种子活力的一种常用方法，具有可靠度好，应用局限性小的特点。此方法通过在人为控制下将种子短期内放在高温和高湿环境中，让种子从潮湿环境中吸水，提高其含水量，伴随高温导致种子迅速老化。高活力种子批能够忍受这样的极端逆境条件，比低活力种子批老化缓慢，于是在加速老化后高活力种子批保持较高的发芽率，而低活力种子批发芽率降低。同时，加速老化方法也可以在可控条件下获得不同老化程度的种子以供作活力研究的材料，极大方便了对种子劣变过程中生理生活变化的研究。目前，对大豆、棉花、小麦等粮食及经济作物的人工加速老化方法研究较多，也开展了大量的标准化工作。加速老化方法也用于东子、黄瓜、甜瓜、羽衣甘蓝等蔬菜种子的活力测定，牧草种子方面在高羊茅、三叶草、雀麦和黑麦草等种类开展了相关研究。于2001年6月在法国Angers巿召开的国际种子检验协会(ISTA)第26届大会上，将"加速老化法测定大豆种子"技术首次列入《国际种子检验规程》当中，表明加速老化方法是一种比较稳定的活力测定方法。但是，由于不同牧草要求老化的温度和时间也不尽相同，因此，需要研究确定不同草种适宜的老化条件。到目前为止，国际种子检验协会检验规程中仅对大豆种子人工加速老化的具体方法进行了明确规定，而在中华人民共和国国家标准《牧草种子检验规程GB/T2930—2001》中也未包含种子加速老化测定技术的内容。紫花苜蓿(Me血"goM^")是豆科苜蓿属多年生草本植物，起源于小亚细亚、外高加索、伊朗和土库曼等地。作为一种重要的牧草和绿肥兼用作物，紫花苜蓿在我国已有两千多年的栽培历史，具有适应性广、产量高、质量好、耐刈割、并可增加土壤肥力等优点，故有"牧草之王"之称。随着我国生态治理规模的增加和草地畜牧业的快速发展，人工草地面积大幅度增加，对于优良牧草种子的需求成上升趋势。尤其是随着奶牛饲养规模的迅速增加，需要大量优质高产的饲草。但由于苜蓿品种缺乏和牧草生产管理水平落后，草产品的生产尚无法满足奶牛饲养的营养需求。因此，深入开展种植业结构调整，不断扩大优良苜蓿品种的种植面积将是草地畜牧业持续发展的重要基础。而种子质量的优劣是提高播种技术和牧草产量的关键因素，针对常规苜蓿种子发芽检测的局限性，确定苜蓿种子加速老化的适宜条件和标准程序，不仅为完善牧草种子活力测定方法，而且也为牧草种子质量检验技术的提高提供技术指导。
发明内容本发明的目的在于提供一种苜蓿种子加速老化测定方法，在技术应用程序上，形成从种子水分调整、老化、发芽培养到种苗鉴定一套标准化体系，避免由于实验室或技术人员不同造成的误差。从而实现苜蓿种子加速老化测定技术的完善和适用，为种子活力水平的检测提供一种标准化的可靠方法。本发明方法包括如下步骤1)调整种子含水量，优选含水量调整为为1(M4%。2)将种子置于3945。C，湿度为100%的环境中进行人工加速老化处理，老化时间为24^96h;优选老化温度为45。C，老化时间为84h。3)测定老化后种子的发芽率，发芽率应当在老化处理后lh内进行。其中，步骤1)选择发芽率为60^0%的种子进行测定。其中，步骤2)称取调整含水量后的种子，平铺于老化盒内支架网上，老化盒内装有蒸馏水，确保种子可以从环境中均匀吸水且距水面约lcm，然后将老化盒放入老化箱内进行老化。其中，步骤3)发芽率的测定方法是选取均匀饱满一致老化后的种子，将其放入盛有3层滤纸的培养皿中，设4次重复，在2(TC8h光照16h黑暗条件下培养，第4天初次计数，第10天进行末次计数，最终统计正常种苗数，计算种子发芽率。本发明通过研究比较确定了苜蓿种子加速老化测定的具体參数，在技术应用程序上，形成从种子水分调整、老化、发芽培养到种苗鉴定一套标准化体系，避免由于实验室或技术人员不同造成的误差。从而实现苜蓿种子加速老化测定技术的完善和适用，为种子活力水平的检测提供一种标准化的可靠方法。本发明技术针对种子发芽检测的不足，即具有相近发芽能力的不同种子在田间的出苗能力存在很大差异的问题，可以比较具有较高发芽率的苜蓿种子活力状况，避免造成经济损失。本发明技术方法简便，易于操作和程序规范化，适合相关企业、质检机构进行苜蓿种子质量的检测。图1老化处理对Lotl苜蓿种子发芽率的影响；图2老化处理对Lot2苜蓿种子发芽率的影响；图3老化处理对Lot3苜蓿种子发芽率的影响。具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。根据人工加速老化测定方法的基本要求和原理，确定苜蓿种子老化温度和老化时间参数是解决种子老化技术的关键，然后根据各环节技术要求，完善苜蓿种子老化测定技术程序。为实现上述目的，本发明釆用下列技术方案1供试种子材料的选择为确保种子加速老化测定技术应用的广泛性，选用苜蓿种子具有不同的发芽水平。2种子含水量测定参照国际种子检验协会(ISTA)种子检验规程第9章测定种子的含水量。3加速老化过程称取调整含水量后的种子5g左右，平铺于老化盒(11.0cmxll.Ocmx5.0cm)内支架网(直径10.0cm,高3.5cm)上，老化盒内装有40ml蒸馏水，确保种子可以从环境中均匀吸水且距水面约lcm。然后将老化盒放入老化箱内(DNP-9162型电热恒温箱)进行老化。将种子分别置于39°C、41°C、43°C、45。C下，湿度为100%的环境中进行人工加速老化处理，并在每个温度环境下对供试种子分别老化24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h。老化箱内置一水源，保证老化期间湿度达到100%。在老化至规定时间后，将种子样品取出，应在lh内进行发芽率测定。4老化后发芽率测定将老化后的种子按照标准发芽所规定的条件进行苜蓿种子发芽培养。选取均匀饱满一致的种子100粒，将其放入盛有3层滤纸的直径10cm培养皿中，每皿放置100粒，设4次重复，在20。C8h光照16h黑暗条件下放置于微电脑控制的光照配养箱(LRH-250-GII)中培养。初次计数为第4d,末次计数为第10d，最终统计正常种苗数，按照国家标准《牧草种子检验规程GBAT2930.4—2001》规定，计算种子发芽率。发芽率=(发芽终期全部正常种苗数/供试种子数)xlOO%5数据处理和分析试验数据釆用SPSS13.0软件进行单因素及双因素统计分析，EXCEL软件作图。实施例l1供试种子材料的选择本例选用了3份苜蓿样品，具体发芽情况见表1。表l供试苜蓿种子发芽情况<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2种子含水量测定试验所用苜蓿种子样品Lotl、Lot2、Lot3的含水量分别为6.2%、6.7%和8.1%，参照ISTA规程第15章要求，进行人工加速老化种子含水量应为10%-44%间，需要对3份样品种子含水量进行调整。按照Wang和Hampton调节种子含水量的方法，直接将种子装入铝箔袋中并加入达到相应含水量所需的蒸馏水量后立即封好销箔袋，在51(TC条件下平铺放置18-24h,将供试种子含水量统一调整至12.0%(表2)。表2种子含水量调整<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*调整1.2§供试种子含水量至12.0%，所需加的蒸馏水质量3老化温度处理对苜蓿种子发芽率的影响经不同老化温度处理后测定结果显示(表3)，苜蓿种子老化后发芽率均显著(PO.05)低于对照种子，并且随着老化温度的升高，种子老化后发芽率均呈下降的趋势。不同温度老化后种子发芽率平均值间差异均不显著(P>0.05)。虽然不同苜蓿样品种子老化发芽率均随老化温度的升高而下降，但由于老化前标准发芽率间的差异，在老化过程中发芽率下降情况则不同。Lotl种子在39。C、4rC、43。C处理后老化发芽率间差异不显著(P〉0.05),却与45。C老化发芽率间具有显著性差异(P<0.05)，并且45。C老化处理后发芽率由对照种子发芽率88%下降至59%。Lot2苜蓿种子仅在39'C和4rC处理间老化发芽率差异不显著(P>0.05)，43°C、45。C处理后种子老化发芽率显著下降(P<0.05),并且在45。C时种子发芽率由对照73%下降至43%。Lot3种子在39°C、41°C、43C处理后老化发芽率间差异不显著(P>0.05),均与45。C老化发芽率间具有显著性差异(P<0.05)，并且在45°C时种子发芽率由对照59%下降至34%。综上所述，经过不同温度的老化处理均能够降低种子的发芽率，但是种子老化发芽率下降的程度与老化前种子发芽率的高低有关。较低温度处理对发芽率高的种子老化效果不明显，而较高温度老化却可导致种子发芽率的迅速下降。因此，根据对不同发芽率苜蓿种子老化情况，确定45'C为种子老化的适宜温度。表3老化温度^S对苜蓿种子老化发芽率的影响老化温度CC)加速老化后种子发芽率(％)对照(CK)3941434573a65b64b59b45b注不同小写字母表示同列平均值差异显著(P<0.05)。4老化时间对苜蓿种子发芽率的影响苜蓿种子经不同时间老化处理结泉泉明(表4),与对照相比老化后发芽率呈现下降的趋势，并且在下降过程中老化24h、36h、48h、60h、72h、84h处理间种子平均发芽率差异不显著(P>0.05)，老化96h处理与老化24h、36h、48h、60h处理间种子平均发芽率具有显著差异(P<0.05)。另外，受供试样品发芽率的影响，老化96h后发芽率下降幅度也不同，Lotl、Lot2和Lot3苜蓿种子分别下降了41。/。、34%和28%，并且Lotl苜蓿种子老化后发芽率最高，Lot3种子最低。Lotl苜蓿种子在老化24h、36h、48h、72h、84h间发芽率差异均不显著(P〉0.05)，却都与老化96h后发芽率具有显著差异(P<0.05，表4)。另外，在39。C、4rc和43x:老化温度条件下，随着老化时间的延长，各温度处理中种子发芽率的变化较小，只有在45'C处理中，老化84h后种子发芽率迅速下降，至96h后老化发芽率已降至2%(图1)。表4老化时间处S3l寸苜蓿种子老化发芽率的影响加速老化后种子发芽率(％)老化时间(h)LotlLot2Lot3对照(CK)88a73a59ab76b66ab63a75b61bc58ab74b61be56ab72b52bc54ab68b52c50b66b51c4%73a68a65a64a59a57ab55ab243648607284注不同小写字母表示同列平均值间差异显著(P<0.05)。同样，老化时间也导致Lot2苜蓿种子发芽率逐渐下降，且老化36h、48h、60h、72h、84h间发芽率差异不显著(P〉0.05，表4)。在不同老化温度处理条件下，39'C和4rc处理中老化时间对发芽率的影响较小，而在43'C和45。C处理中随着老化时间的延长种子发芽率不断下降，但在45。C处理条件下老化72h后种子发芽率迅速下降，到老化96h时发芽率降至4%(图2)。Lot3苜蓿种子老化发芽率变化情况与Lot2种子变化相似,老化36h、48h、60h、72h、84h间发芽率差异不显著(P〉0.05，表4)。在不同老化温度处理条件下，在39'C处理中，随着老化时间的增加发芽率变化较小，但在4rC和43'C处理中老化84h后种子发芽率迅速下降，45。C处理中发芽率呈现阶段性降低，从老化24h起种子发芽率迅速下降，老化48h时至72h处于相对稳定阶段，此后开始迅速下降，直至96h老化发芽率为6%(图3)。综上所述，供试苜蓿样品在老化时间处理过程中的发芽率变化表明，老化48h~96h处理可以明显降低种子的发芽率。另外，老化温度的提高可以加速种子的老化，尤其是对于标准发芽率低的种子，较高温度老化导致种子发芽能力的迅速丧失。5老化温度与老化时间的互作效应根据二因素处理的方差分析结果(表5)，温度、时间以及温度与时间的互作对苜蓿种子发芽率的影响均极显著(P〈0.01)。可见，在苜蓿种子加速老化处理中，老化温度、老化时间是影响种子加速老化的关键因素，说明随着老化温度的提高和老化时间的延长，种子加速老化的效果越明显。因此，根据不同发芽能力苜蓿种子老化温度和老化时间处理结果，确定苜蓿种子人工加速老化的适宜温度是45。C、老化时间是84h。表5苜蓿种子老化二因素5B里方差分+^计结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实验表明，本发明可以作为苜蓿种子活力水平测定的有效手段，筛选确定的老化温度45'C和老化时间84h,不仅是一系列老化温度和老化时间组合处理筛选比较的结果，而且也覆盖了苜蓿种子发芽率60%至90%这一范围。因此，利用本发明对于确定具有较高发芽能力的苜蓿种子活力差异，并且建立标准化的测定程序可以广泛应用于种子质量的检测。权利要求1、一种苜蓿种子加速老化的测定方法，其特征在于，包括步骤1)调整种子含水量；2)将种子置于39～45℃，湿度为100％的环境中进行人工加速老化处理，老化时间为24～96h；3)测定老化后种子的发芽率。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于，其中步骤2)将种子置于45。C下进行老化。3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤2)老化时间为84h。4、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤2)称取调整含水量后的种子，平铺于老化盒内支架网上，老化盒内装有蒸馏水，确保种子可以从环境中均匀吸水且距水面约lcm，然后将老化盒放入老化箱内进行老化。5、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤l)调整种子含水量为为10~14%。6、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤l)选择发芽率为60－90%的种子进行测定。7、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤3)在lh内测定老化后种子的发芽率。8、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤3)发芽率的测定方法是选取均匀饱满一致老化后的种子，将其放入盛有3层滤纸的培养皿中，设4次重复，在20℃8h光照16h黑暗条件下培养，第4天初次计数，第10天进行末次计数，最终统计正常种苗数，计算种子发芽率。全文摘要本发明提供了一种苜蓿种子加速老化测定的方法，包括以下步骤调整种子含水量；将种子置于45℃，湿度为100％的环境中进行人工加速老化处理，老化时间为84h；测定老化后种子的发芽率。利用本发明提供的测定方法，不仅避免了常规种子发芽率测定的局限性，能够更好反映种子在田间的表现和贮藏性能，而且缩短了测定周期，操作简单，无需复杂设备，可以预测种子在田间的实际出苗情况和种子的耐藏性，反映种子活力水平的高低，适合将不同质量水平的苜蓿种子分开。文档编号A01C1/02GK101341816SQ20081011797公开日2009年1月14日申请日期2008年8月18日优先权日2008年8月18日发明者彦孙,李寅菲,毛培胜,王显国申请人:中国农业大学