本发明属于家禽病害检测技术领域，具体涉及一种检测猪瘟病毒的方法。
背景技术：
猪瘟(classicalswinefever，csf)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的一种猪的高接触性、高死亡率的急性热性传染病[1]。该病呈世界性分布，感染后表现为高热稽留，全身各器官组织出现败血、梗死、坏死，母猪出现流产、死胎、木乃伊胎或弱仔等症状，给养猪业带来了巨大的经济损失，严重影响了世界各国间的猪只贸易的往来。目前国际动物性卫生组织(oie)将其列为法定疫病之一，我国将其列为一类传染病。
尽管我国在上世纪50年代就研制出了世界上较为有效的猪瘟兔化弱毒疫苗，并且成功控制了csfv在我国的大规模爆发，但猪瘟并没有得到根除。近年来，猪瘟在我国的流行呈现非典型性、慢性、持续性感染和隐性感染等新特点，普通rt-pcr方法虽然具有快速、特异性强、适合做大面积的检测等优点，并且可以获得cdna基因序列，来进行csf的流行病学研究及csfv的进化变异情况，有着不可替代的优势。但是目前猪瘟病毒基因组的含量一般都较低，使用常规pcr扩增得到的产物量经常不能满足后续实验的需要，且敏感性不高；另外，免疫猪群发生猪瘟的情况越来越多，且容易导致基层兽医人员误诊。因此，监测猪群中病原体的分布，及时了解猪场的csf疫苗免疫效果和发病情况就对于有效防治动物疫病尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测猪瘟病毒的方法，可以有效的检测猪群中猪瘟病毒病原体的分布情况，从而为猪瘟早期预防诊断上起到重要作用。
本发明首先提供一种用于检测猪瘟病毒的引物组合，包含有用于第一次扩增的外引物对(csfv-p3)，其序列如下：
上游引物：taactggggcacaaggccggct(seqidno:1)，
下游引物：tttctttataggttcatccctcatg(seqidno:2)；
第二次扩增的内引物对(csfv-p4)，其序列如下：
上游引物acaggggggctagtaaaacaatgta(seqidno:3)，
下游引物actatcagccacaggacatatcttc(seqidno:4)；
引物组合在制备检测猪瘟病毒的制品中的应用。
所述的制品为检测试剂盒；
本发明再一个方面提供一种检测猪瘟病毒的方法，所述的方法包括如下的步骤：
1)核酸样品的提取：提取待检测样品的rna核酸，进行反转录为cdna备用；
2)第一次扩增：使用csfv-p3上游引物和下游引物对cdna样品进行扩增，
3)第二次rt-pcr扩增：将第一次扩增的产物稀释后作为第二次扩增的模板，使用csfv-p4上游引物和下游引物进行扩增；
4)2.5结果判定
将第二次rt-pcr扩增pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果待检样品的泳道内出现494bp的目的条带，判为csfv核酸阳性，否则为阴性。
本发明筛选了用于检测csfv的引物组，建立csfv的检测方法。特异性试验结果表明本发明筛选的引物组对prv、prrsv、pedv、csfv、tgev、pcv26种病原不敏感，具有良好的特异性。敏感性实验结果表明能检出csfv的cdna的最低浓度为1.35×10-6ng/ml，比普通rt-pcr的灵敏度高出1000倍，敏感性较高，能满足临床上csfv感染检测的要求，可以用于临床检测。
附图说明
图1：csfve2蛋白保守性分析图；
图2：csfvnestedrt-pcr的特异性实验图，
其中：m、dl-2000marker；1、prv；2、prrsv；3、pedv；4、csfv；5、tgev6、pcv2；0、阴性对照；
图3：rt-pcr的敏感性试验图，
其中：m.dl-2000marker；0.阴性对照；1-10泳道依次为cdna稀释10－1-10－1110倍梯度稀释浓度pcr鉴定结果；
图4：敏感性试验图，
其中：m.dl-2000marker；0.阴性对照；泳道1-10依次为cdna稀释10－1-10－1110倍梯度稀释浓度pcr鉴定结果。
具体实施方式
本发明所使用的试剂如下：
csfv疫苗购自青岛易邦生物工程有限公司，
rnaisoplus、premixtaq(extaqversionn2.0plusdug)、dntps、extaq、5×revertranscriptasem/mlvbuffer、revertransciptasem-mlv、dnamarker(dl2000)、pmd19-t载体、dh5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；lb培养基、琼脂粉购自青岛高科园海博生物技术有限公司；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；氨苄青霉素购自sigma公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇购自上海国药。
eppendorf5418离心机：上海心亮实业有限公司；超净工作台：苏州净化设备有限公司；pcr基因扩增仪：appliedbiosystems9700，appliedbiosystems；电热恒温水浴锅：龙口市先科仪器有限公司；微量振荡器：金坛市恒丰仪器厂；紫外可见分光光度计：日本岛津；全温振荡器：中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；电子天平：上海海康电子仪器厂；紫外凝胶成像系统：t2a，bio-rad。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：引物的筛选
根据genbank上发表的csfv基因序列(基因登录号：ay259122)，为筛选csfv特异性引物，采用ncbi中cd-search(conserveddomainssearch)程序对csfv全基因序列进行分析，csfv全基因序列共包括21个功能性蛋白，其中csfve2蛋白(pestivirus_e2)序列与保守序列数据库(cdd-conserved)中序列号为cdd：pfam16329的保守序列相比，e-value值最小，保守性最高(图1)。为保证引物特异性，同时增加引物筛选过程中的可选择性，最终确定内引物对e2蛋白序列进行扩增(基因序列起止位点2444-3553)。
使用primerpremier5.0软件设计2对外引物p1、p2与两对内引物p3、p4，其中，保证内引是对csfve2蛋白进行扩增(扩增位置位于2444-3553)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(见表1)。
对上述设计的引物采用csfv-p1/p2、csfv-p1/p4、csfv-p3/p2、csfv-p3/p4的组合方式进行巢式pcr试验，及特异性、灵敏度和重复性试验，筛选出目的引物组：
1、csfv巢式pcr方法的特异性试验
以伪狂犬病毒(prv)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒(prrsv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪瘟病毒(csfv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪圆环病毒(pcv2)的核酸和ddh2o为模板进行目的基因的扩增，然后分别将pcr产物进行电泳鉴定，检验所建立的csfv巢式pcr方法的特异性。
2、csfv巢式pcr方法的敏感性试验
紫外分光光度计测定csfv的cdna浓度，然后将csfv的cdna进行10倍比的梯度稀释，共稀释10个梯度，然后用rt-pcr方法和所建立的csfv巢式pcr方法进行目的基因的扩增，分别将pcr产物进行电泳，观察结果以确定反应的敏感性。
对csfvpcr方法的退火温度和退火时间等进行优化，优化后第1次pcr体系25μl：包括cdna2.0μl，extaq酶0.5μl，dntp2.0μl，csfvp10.5μl，csfvp20.5μl，10×pcrbuffer2.5μl，ddh2o补足25μl。反应体系为94℃/5min、30×(94℃/30s、55℃/30s、72℃/90s)、72℃/10min，最后4℃冷却10min结束反应；第2次pcr反应体系：94℃/5min、30×(94℃/30s、52℃/30s、72℃/90s)、72℃/10min，最后4℃冷却10min结束反应。
用建立的csfv巢式pcr方法进行pcr扩增，重复5次试验，以验证结果的可靠性。
通过特异性和灵敏性筛选，最终确定的引物组的序列信息如下：
表2：引物序列信息
其中csfv-p3、csfv-p4检测csfv的效果如下：
应用建立的csfvnestedrt-pcr方法，分别对提取的prv、prrsv、pedv、csfv、tgev、pcv2的核酸及ddh2o进行pcr扩增，结果见图2。由图2可知，所确定的引物组只有在检测csfv的cdna模板时会出现与试验设计相符合的494bp的特异性扩增条带，其他5种病原和阴性对照检测均没有出现目的条带；表明所筛选的引物组与猪的其他常见病原无交叉反应，说明建立的检测方法具有特异性强的特点。
将csfv的反转录产物用紫外分光光度计测定，cdna浓度是135ng/ml，将其进行10倍的梯度稀释，共稀释10个梯度，用rt-pcr方法和所建立的csfv巢式pcr方法进行扩增，结果见图3。由图3可知，rt-pcr方法对csfv能够扩增出目的片短的最大稀释度为10×10-5ng/ml，即cdna最小检出浓度为1.35×10-3ng/ml；由图4可知，建立的csfv巢式pcr方法对csfv能够扩增出目的片段的最大稀释度为10×10-8ng/ml，即cdna最小检出浓度为1.35×10-6ng/ml；所建立的csfv巢式pcr比rt-pcr方法的灵敏性至少高1000倍。
实施例2：
将猪瘟病毒疫苗按照疫苗使用说明进行稀释，取适量稀释液，进行核酸的提取。
一、病毒rna的提取及反转录为cdna
1、病毒rna的提取
(1)取250μl疫苗稀释液置于1.5ml离心管中，加入750μlrnaisoplus，颠倒混匀6～8次，冰浴5～10min。
(2)12000g4℃离心5min，吸上清600μl至新的1.5ml离心管中，加入150μl三氯甲烷(氯仿)，颠倒混匀后，冰浴5min.
(3)12000rpm4℃离心15min。
(4)吸取200μl上清放于新的1.5ml离心管中，加入200μl异丙醇，颠倒混匀后，－20℃放置1h。
(5)12000g4℃离心10min。
(6)将上清弃去，用1ml75％乙醇洗涤2次，7500g4℃离心5min。
(7)洗涤完成后，将洗涤液弃去，把离心管倒置在超净工作台的吸水纸上进行干燥，用20μldepc水将rna溶解，置于-80℃冰箱保存备用。
2、病毒rna反转录为cdna
按照表1-2反转录体系在20μl的pcr反应管中加入试剂混匀，在42℃水浴lh，然后72℃水浴10min，将反转录好的cdna保存在-20℃冰箱。
表3：反转录反应体系(20μl)
3、csfvnestedrt-pcr方法反应条件的优化
3.1第一次扩增
表4：第一次rt-pcr扩增反应体系
在冰盒上配置上表25ul体系，csfvp1/csfvp2引物用量分别为0.5和1.0μl，
对csfv巢式pcr方法进行第一次pcr扩增引物浓度、退火温度、退火时间的优化。反应条件：预变性94℃/5min，变性94℃/30s，退火温度共设置51、53、54、55、56、57、59℃7个梯度，延伸72℃/90s，进行30个循环。终延伸72℃/10min，最后4℃冷却10min，第一次扩增结束。
3.2第二次rt-pcr扩增
表5第二次rt-pcr扩增反应体系
在冰盒上配置上表25ul体系，见表1-4。对csfv巢式pcr方法进行退火温度、退火时间的优化。反应条件：预变性95℃/5min，变性94℃/30s，退火温度共设置49、50、51、52、53、55、57、58℃8个梯度，延伸72℃/1min，进行30个循环。终延伸72℃/10min，最后4℃冷却10min，第二次扩增结束。
4、结果判定
二扩结束后，pcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。取每个扩增样5ul进行120v、45min核酸电泳，如果待检样品的泳道内出现494bp的目的条带，判为csfv核酸阳性，否则为阴性。
对出现的目的条带切胶回收后，进行测序操作，测序结果表明目的条带正是对应的csfv片段，表明本发明能够有效的检测csfv。
序列表
<110>青岛农业大学
<120>一种检测猪瘟病毒的方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
taactggggcacaaggccggct22
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tttctttataggttcatccctcatg25
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
acaggggggctagtaaaacaatgta25
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
actatcagccacaggacatatcttc25