一种ε-聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法
【专利摘要】本发明涉及一种ε-聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法，属于生物化工领域。本发明将发酵液pH值调节至pH0.5—4.0；在搅拌条件下缓慢加入20—1200mg/L絮凝剂，缓慢搅拌10-20分钟；加入0.5％-1.0％助滤剂后将絮凝好的发酵液压入板框压滤机中进行过滤。与目前常用的分离方式相比，本发明工艺不需要加热和稀释，固液分离速度快，滤液澄清度高；设备投资低，维护成本低；ε-聚赖氨酸收率高，杂蛋白去除率高，适合工业化大生产使用。
【专利说明】一种ε-聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种ε -聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法，特别涉及一种用絮凝剂去 除ε-聚赖氨酸发酵液中菌体、纯化ε-聚赖氨酸的方法，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002] ε -聚赖氨酸（ε -poly-L-lysine, ε -PL)是由链霉菌、丝状真菌或芽孢杆菌等微 生物分泌产生的一种同型氨基酸聚合物。它一般由25-35个L-赖氨酸单体通过a -C00H 和ε-ΝΗ2脱水缩合而成，分子量通常为2500_4500Da。由于ε-PL具有抑菌谱广、水溶性 好、热稳定性强、安全性高等特点，目前主要作为生物食品防腐剂广泛应用于日本、韩国、欧 美等国家和地区的食品工业。另外，ε -PL还被用于药物载体、基因芯片等领域的应用研究。 因此，ε -PL被认为是一种具有重要工业应用价值的新型工业生物技术产品，近年来受到越 来越多的食品和生物材料领域关注。目前ε-PL的生产还只能在少数国家实现，主要集中 在日本。然而，随着国内ε-PL发酵水平的稳步提升，已经具备了产业化的潜力。因此，研 发ε -PL高效分离和提取技术对实现其工业化生产至关重要。
[0003] 目前ε -PL -般只能通过微生物发酵法进行生产。ε -PL发酵液是一个非常复杂 的体系，除了含有少量目标产品（3-4%，干重）外，还含有大量的菌体细胞（20-30%，湿菌 体体积）、细胞碎片、生物大分子（如蛋白质和核酸）和胶体物质等。同时，发酵液还具有 较高的表观粘度并呈现出典型的非牛顿流体特性；另外，菌体细胞与发酵液密度相当，形成 了稳定的胶体溶液。因此，使用一般的分离方法进行ε-PL发酵液的固液分离是十分困难 的。然而，若要实现ε-PL高效分离和提取，去除发酵液中菌体和生物大分子等固体及可溶 性固定杂质是首先需要解决的问题。
[0004] 目前关于ε -PL发酵液中菌体细胞分离和去除的方法主要有离心法和过滤法。然 而，在工业生产中，离心法存在设备投资大、运行费用高、分离效率不高等诸多缺点；另外， 离心法对于粘度和固形物含量较高的发酵液进行分离时，还需要进行稀释处理，这样就额 外增加了水资源的消耗和后续提取工序的负荷。还有一种基于酸化和热变性的过滤方法来 对ε -PL发酵液进行固液分离处理，但是，加热操作往往会产生大量的色素，势必给后续的 脱色工序增加负担，也容易降低产品的收率和纯度以及影响成品外观。另外，菌体细胞在没 有形成絮凝体的情况下，过滤时会在滤布表面形成可压缩的胶粘状滤饼，极易堵塞滤布，造 成过滤速率迅速下降，耗时耗能且效率低。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种不需要加热和稀释处理的且能够 高效分离ε -聚赖氨酸发酵液中菌体的方法，达到对ε -PL发酵液进行有效固液分离的目 的。
[0006] 本发明方法包括以下步骤：将ε -PL发酵液pH值调节至pHO. 5-4. 0,在搅拌条件 下缓慢加入20-1200mg/L絮凝剂。缓慢搅拌10-20分钟。
[0007] 在一种实施方式中，还向经絮凝处理的发酵液中加入0.5% -1.0% (g/lOOmL)助 滤剂，然后将絮凝好的发酵液压入板框压滤机中进行过滤。
[0008] 所述ε -PL发酵液优选链霉菌、丝状真菌或芽孢杆菌ε -PL发酵液。所述链霉菌 优选白色链霉菌。
[0009] 所述pH值调节优选无机酸。所述无机酸包括盐酸、硫酸、磷酸等。
[0010] 所述絮凝剂优选高分子有机阴离子絮凝剂，可以是聚丙烯酸、聚丙烯酸盐，或两者 的混合物。絮凝剂使用前优选溶解配制成0.1?2% (g/100mL)的水溶液。
[0011] 所述絮凝剂进一步优选聚丙烯酸钠。
[0012] 所述助滤剂的作用是减少滤饼过滤阻力。优选硅藻土。
[0013] 所述助滤剂还优选珍珠岩。
[0014] 本发明与已有技术相比具有以下优点：
[0015] 1、成本低：设备一次性投资低，运行维护费用低；不需要稀释，节约了水资源，也 降低了后续提取操作负荷；也不需要加热，降低了能耗。
[0016] 2、高效率：本发明将发酵液调至极酸条件（pHO. 5-4. 0)，使得菌体表面和蛋白质 充分阳离子化再结合阴离子絮凝剂即可形成明显的絮凝体，且会自动分层。絮凝剂促进 了菌体细胞和/或生物大分子颗粒成团，降低了发酵液粘度，提高了过滤速率，通量达到 100L/h/m 2 左右。
[0017] 3、高产物回收率和蛋白去除率：过滤液菌体去除彻底、澄清度高；ε -聚赖氨酸回 收率大于95% ;蛋白质去除率达到70%以上。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例，对依据本发明技术方案作进一步描述：
[0019] 其中，ε-PL 的测定方法米用 Itzhaki 法（Itzhaki, R. F, Colorimetric method for estimating polylysine and polyarginine. Analytical Biochemistry, 1972:50, 569 - 574);蛋白的测定方法米用 Bradford 法（Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72:248 - 254)。
[0020] 实施例1
[0021] 发酵液含ε -聚赖氨酸30g/L，菌体干重40g/L，pH3. 8,蛋白浓度1. 2g/L。利用浓 盐酸将发酵液pH值调节至0. 5,将浓度为2%的聚丙烯酸钠（分子量500万）溶液缓慢加 入到上述酸化后的发酵液中，并伴随着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到800mg/L，再 继续搅拌10分钟；随后往发酵液中加入〇. 5%硅藻土，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框 压滤机中，压力控制在〇. 〇5MPa进行过滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结 束，用5%发酵液体积的水对滤饼进行冲洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤 速率为90L/h/m 2，ε -PL收率95.5%，蛋白质去除率74. 4%。
[0022] 实施例2
[0023] 发酵液含ε -聚赖氨酸40g/L，菌体干重60g/L，pH4. 0,蛋白浓度2. 2g/L。利用浓 硫酸将发酵液pH值调节至2. 0,将浓度为0. 5 %的聚丙烯酸（分子量1000万）溶液缓慢加 入到上述酸化后的发酵液中，并伴随着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到20mg/L，再继 续搅拌20分钟；随后往发酵液中加入0. 5%珍珠岩，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压 滤机中，压力控制在0. IMPa进行过滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束， 用5 %发酵液体积的水对滤饼进行冲洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率 为100L/h/m2，ε -PL收率96. 3%，蛋白质去除率73. 2%。
[0024] 实施例3
[0025] 发酵液含ε -聚赖氨酸20g/L，菌体干重30g/L，pH3. 5,蛋白浓度1. 2g/L。利用磷 酸将发酵液pH值调节至3. 0,将浓度为1. 0 %的聚丙烯酸钠（分子量1000万）溶液缓慢加 入到上述酸化后的发酵液中，并伴随着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到1200mg/L，再 继续搅拌5分钟；随后往发酵液中加入0. 5%硅藻土，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压 滤机中，压力控制在0. 15MPa进行过滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束， 用5 %发酵液体积的水对滤饼进行冲洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率 为120L/h/m2，ε -PL收率95. 2%，蛋白质去除率72. 5%。
[0026] 实施例4
[0027] 发酵液含ε -聚赖氨酸35g/L，菌体干重45g/L，pH4.0,蛋白浓度1.6g/L。将浓度 为1.5%的聚丙烯酸钠（分子量3000万）溶液缓慢加入到上述酸化后的发酵液中，并伴随 着温和搅拌,直到聚丙烯酸钠终浓度达到600mg/L，再继续搅拌5分钟；随后往发酵液中加 入1.0%硅藻土，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压滤机中，压力控制在0. 15MPa进行过 滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束，用5%发酵液体积的水对滤饼进行冲 洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率为ll〇L/h/m 2, ε-PL收率94. 2%，蛋 白质去除率78. 5%。
[0028] 实施例5
[0029] 发酵液含ε-聚赖氨酸30g/L，菌体干重42g/L，pH0. 5,蛋白浓度1.5g/L。将浓度 为1.5%的聚丙烯酸钠（分子量3000万）溶液缓慢加入到上述酸化后的发酵液中，并伴随 着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到l〇〇〇mg/L，再继续搅拌5分钟；随后往发酵液中加 入1.0%硅藻土，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压滤机中，压力控制在0. 15MPa进行过 滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束，用5%发酵液体积的水对滤饼进行冲 洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率为l〇8L/h/m 2, ε-PL收率92%，蛋白 质去除率78%。
[0030] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种ε-聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法，包括以下步骤：将ε-聚赖氨酸发酵液 pH值调节至pHO. 5-4. 0 ;在搅拌条件下缓慢加入20-1200mg/L絮凝剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括向经絮凝处理的发酵液中加入 0. 5% -1. 0%助滤剂，然后将絮凝好的发酵液压入板框压滤机中进行过滤。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH值调节采用无机酸。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无机酸为盐酸、硫酸或磷酸。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂为高分子有机阴离子絮凝剂。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂是聚丙烯酸或聚丙烯酸盐或 两者的混合物。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂是聚丙烯酸钠。
8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述助滤剂优选硅藻土。
9. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述助滤剂优选珍珠岩。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ε-PL发酵液是链霉菌、丝状真菌或 芽孢杆菌ε-PL发酵液。
【文档编号】C08G69/46GK104193988SQ201410441173
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】陈旭升, 毛忠贵, 甄斌 申请人:江南大学