交叉引用本发明申请要求在美国临时申请，申请号：61/785,538；申请日：2013年3月14日，申请号：61/952,719；申请日：2014年3月13日的优先权。每一个在先申请的所有的表格，附图和权利要作为申请的一部分作为参考。本发明的领域本发明涉及用于制备轭合物的一些新的6-单乙酰吗啡类似物，这些轭合物包含蛋白、多肽和标记物；也涉及包括6-单乙酰吗啡类似物的轭合物，以及它们的合成和使用方法。本发明的背景本发明研究背景的如下论述仅用于帮助读者理解本发明，不被认为是对本发明现有技术的描述或组成。6-单乙酰吗啡(6-MAM，也被称为6-单乙酰吗啡，或6-AM)是三个海洛因活性代谢物中的一个(二乙酰吗啡)，其他是吗啡和吗啡-6-葡糖苷酸。海洛因在体内快速的形成6-AM，接着要么被代谢称为吗啡要么从尿液中被排泄出去。因为对海洛因来说6-AM是特别的代谢物，因此6-AM的识别被认为是使用海洛因的明确的证据。这是很有意义的，因为在尿免疫药物筛选中，测定一般检测吗啡，吗啡是很多合法的和非法的鸦片剂/阿片类药物例如可待因、硫酸吗啡和海洛因的一种代谢物。6-AM在尿液中停留不超过24小时，因此尿液取样必须在最后一次海洛因使用后不久采集，不过6-AM的存在保证了实际使用海洛因的最近的时间为昨天。为了研发对6-AM的结合测定，本领域工作人员必须考虑到样品可能包括鸦片剂/阿片类药物的代谢物。因此，轭合物的免疫原性和标记物被设计到当前的6-AM上，为了对吗啡、吗啡-3-葡糖苷酸、吗啡-6-葡糖苷酸和其他阿片类药物提供具有最小交叉反应性的测定。在制备这些轭合物中使用的类似物也被设计成可以在温和条件下便利的附着到各种蛋白、多肽和标记物上。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一些新的6-AM类似物及它们的合成和使用方法。优选的这些类似物用于提供活性硫醇(-SH)基团，用于与靶标蛋白、多肽或标记物上的适宜的基团偶联提供便利的化学连接键。接下去讨论的目的在于，下文描述了本领域中吗啡可利用的位置编号：因此，6-AM具有如下的结构：本发明的第一部分涉及具有选自(I),(II),(III),或(IV)的常见通式的化合物(或它们的盐)：其中，R1,R3,R4或R5是一个连接化学键，可提供终端功能基团，这些基团选自以下组合：受保护的或未受保护的巯基基团，受保护或未受保护的胺基基团，伯胺–活性基团，巯基-活性基团，光敏基团，羧基活性基团，精氨酸活性基团，和羰基活性基团；每一个Z是独立的可任意替换的C1-4烷基，C1-4烷氧基，N，O，S和芳基，其中，取代物，如果存在时，可以独立的选自一些基团，这些基团可以是直链或直链C1-6烷基，苄基，卤素，三卤甲基,C1-6烷氧基，–NO2,–NH2,–OH,＝O,–COOR’中的R’是H或低价烷基，–CH2OH,和–CONH2，其中优选的Z为O,S,N,NH,CH3,CH2,CH,CHF或CF2，更优选的Z为-C(O)-,-N(H)-or-O-；f每一个Y可以独立的选自由以下结构：其中每一个R2可以被C1-4烷基,C1-4烷氧基,OH,N,O,S,和烷基独立的任意取代，其中取代物，存在时，可以独立的选自下列基团：直链或支链C1-6烷基，苄基，卤素，三卤甲基,C1-6烷氧基，–NO2,–NH2,–OH,＝O,–COOR’中的R’是H或低价烷基，–CH2OH,和–CONH2，其中优选的每一个R2为CH3,CF3,CHF2,CH2F或NH2，并且每一个X是H或同时形成一个共价键。最优选的-Z-Y是---O-P(O)(CH3)2或---O-C(O)-CH3。在一些实施例中，R1,R3,R4,或R5是具有结构Q-J的连接基团，其中Q是饱和的或不饱和的，被取代的或未被取代的，芳香的或脂肪类的0-10个碳或杂原子(N,O,S)的直链或支链的连接器，具有可任选的C(O),S(O)orS(O2)；J是一个功能基团，选自下列基团：被保护的或未被保护的巯基基团，被保护的或未被保护的胺基(aminemoieties)基团，伯胺活性基团，巯基活性基团，光敏基团，羧基活性基团，精氨酸活性基团，和羰基活性基团。在一些优选的实施例中，R1,R3,R4,或R5是具有结构的连接基团，其中：W是C0-4未被取代的烷基；X是任意存在的C(O)；Y是可被任意取代的C0-4烷基或N(H)–C0-6烷基，可任意存在；Z是功能基团，选自下列基团：受保护的或未受保护的巯基基团，受保护的或未受保护的胺基基团，伯胺活性基团，巯基活性基团，光敏基团，羧基活性基团，精氨酸活性基团，和羰基活性基团。对本领域技术人员来说功能基团的选择可以是多种多样的，这依赖于与蛋白、多肽或标记物间交联桥的期望的长度和构成，无论功能基团是游离的或是受保护的形式。在后者的情况下，已知本领域有各种各样的受保护的基团可用作这种功能基团。例如，标准参考书例如格瑞斯和沃茨(GreeneandWuts，PROTECTIVEGROUPSINORGANICSYNTHESIS,3rdedition,JohnWiley&SonsInc.,1999)，该内容在此已被完整的包含在参考文献中。仅举例来说，适当的硫醇保护基团包括硫酯，硫醚，非对称二硫化物和氧硫基(S)。在优选的实施例中，该功能基团是一个5-或6-元环硫代内酯，一个可被任意取代的C1-4烷基硫醇，或一个具有结构的可被任意取代的硫酯，其中R6选自以下基团：可被任意取代的C1-4烷基，C1-4烷氧基，和芳基，其中取代物，存在时，可以独立选自以下基团：直链或支链C1-6烷基，苄基，卤素，三卤甲基,C1-6烷氧基，–NO2,–NH2,–OH,＝O,–COOR’其中R是H或低价烷基，–CH2OH,和–CONH2。在相关方面，本发明涉及一些组分，该组分含有一种或多种由R1，R3或R4提供的终端功能基团与蛋白、多肽、标记物或其他分子共价连接的上述的化合物(或它们的盐)，在本文中被称为“6-AM类似物的轭合物”。在这个部分，本发明涉及一些具有(V)(VI)(VII)或(VIII)中常见通式的化合物(或它们的盐)：其中，R7，R8，R9，或R10是一个化学连接键，P是一个蛋白、多肽、标记物或其他分子，其中R7，R8，R9，或R10与P被共价连接；每一个Z可以独立被C1-4烷基，C1-4烷氧基，N,O,S,和芳基任意取代，其中取代物，存在时，可以独立的选自以下基团：直链或支链C1-6烷基，苄基，卤素，三卤甲基，C1-6烷氧基，–NO2,–NH2,–OH,＝O,–COOR’其中R’是H或低价烷基，–CH2OH,和–CONH2，其中优选的Z是O,S,N,NH,CH3,CH2,CH,CHF或CF2，其中最优选的Z是-C(O)-,-N(H)-或-O-。每一个Y可以独立的选自下列基团：其中，每一个R2可以独立的被C1-4烷基，C1-4烷氧基，N,O,S,和芳基任意取代，其中取代物，存在时，可以独立的选自以下基团：直链或支链C1-6烷基，苄基，卤素，三卤甲基,C1-6烷氧基，–NO2,–NH2,–OH,＝O,–COOR’其中R’是H或低价烷基，–CH2OH,和–CONH2，优选的每一个R2是CH3,CF3,CHF2,CH2F或NH2，并且每一个X是H或同时形成一个共价键。最优选的每一个R2是甲基并且Z是N(H)，这样-Z-Y是在一些实施例中，R7,R8,R9,或R10是一个具有Q-J结构的连接基团，其中Q是一个饱和的或不饱和的，被取代的或未被取代的，芳香的或脂肪类的，具有任意可选的C(O),S(O)或S(O2)的0-10个碳原子或杂原子(N,O,S)的直链的或支链的连接器；并且J是一个功能基团，通过化学连接键轭合到P上，这些化学连接键选自以下基团：巯基，胺基，羧基，精氨酸，羰基。在一些优选的实施例中，R7,R8,R9,或R10是具有结构的连接基团，其中W’是C0-4的未被取代的烷基；X’是可任意存在的C(O)；Y’是可被任意取代的C0-4烷基或N(H)–C0-6烷基，并且可任意存在；并且Z’是一个功能基团选自下列基团：被保护的或未被保护的巯基基团，被保护的或未被保护的胺基基团，伯胺活性基团，巯基活性基团，光敏基团，羧基活性基团，精氨酸活性基团和羰基活性基团。本发明的一些化合物可以直接连接到适宜的靶标蛋白、多肽、标记物或其他分子从而形成一种轭合物，这些轭合物的形成通过靶标分子自然形成的偶联基团或通过添加一个偶联基团到靶标分子上形成。偶联基团的实施例如下文所述，如上文所述把这些偶联基团归并入靶标分子从而轭合到化合物的方法是本领域公知的。本发明的化合物含有一个保护功能基团的情况下，保护基团移除的方法在本领域也是公知的。优选的靶标分子上的偶联基团是马来酰亚胺，其可以根据下列反应式进行连接：其中R-SH是本发明的化合物，含有一个游离的巯醇(可以是游离的巯醇，也可以是去除保护后的被受保护巯醇)，L是化学连接键，P是靶标蛋白、多肽、标记物或其他分子。优选的L是直链的或支链的C1-10的亚烃基，包含0-4个杂原子主干(如未被取代)，从1-4个取代基任选取代，取代基团可独立选自下列基团：直链或支链C1-6烷基，–NO2,–NH2,＝O,卤素,三卤甲基,C1-6烷氧基,–OH,–CH2OH,和–C(O)NH2。在一些实施例中，P是一种蛋白，最优选的是一种抗原蛋白，用一种“半抗原”的免疫原，该抗原蛋白可以提高对本发明的化合物上的一个表位的免疫反应。通用的载体蛋白包括牛血清白蛋白，钥孔虫戚血蓝素，卵白蛋白等。半抗原轭合到载体蛋白上的操作手册可以在《抗原》中找到(ALABORATORYMANUAL,E.HarlowandD.Lane,eds.,ColdSpringHarborLaboratory(ColdSpringHarbor,NY,1988)pp.78-87),该内容被完整的包含在参考文献中。或者，优选的P可以是一种可检测标记物。优选的可检测标记物可以包含一些分子或更大的结构，这些结构本身是可检测的(例如荧光基团，电化学标记物，金属螯合物，乳胶粒子等)，同样的这些分子可以通过产生一种可检测反应产物被间接的检测到(如酶类例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)或通过一种特异的结合分子，这些结合分子本身是可检测的(如生物素、抗生素蛋白、联袂亲和素、地高辛、麦芽糖、寡组氨酸、二硝基苯、苯基砷酸盐、单链DNA,双链DNA等)。下面描述了轭合到这些可检测标记物的实例。特别优选的可检测标记是荧光乳胶粒子。适宜靶标分子并不意味着受限于上文提及的靶标分子的清单。下面描述了更多的实施例。另外本领域已知的适宜的靶标具有更多其他类型，包括肽类激素，治疗性蛋白，抗体，抗体片段，单链可变区片段，小分子，核苷酸，低聚糖，多糖，环状多肽，模拟肽，寡核苷酸适配子和固相介质。当轭合靶标可以与本发明中6-AM的类似物以1:1轭合，个别的靶标也可以包含超过1个轭合位点，因此超过一个本发明的化合物可以轭合到那里。在优选的实施例中，轭合靶标(如蛋白、多肽或标记物)包括至少10个共价结合在那里的6-AM类似物基团，更优选的至少30个，更优选的至少50个，更优选的至少100个。在其他相关部分，本发明涉及所述6-AM的类似物与一种蛋白，多肽，标记物或其他分子形成轭合物的生产和使用方法。这样的方法可以包括使含有一个活性基团(如包含一个游离的巯基)的一种或多种本发明的化合物与含有一个或多个相关的偶联位点的一个或多个靶标分子接触，在一定的条件下，活性基团(一些活性基团)与偶联位点(一些偶联位点)反应形成一个或多个轭合物。这些反应的条件依赖于所选择的活性基团(一些活性基团)，这是本领域技术人员熟知的。典型条件如下所述。这样的方法进一步包括在进行上述的接触步骤前，本发明的一种或多种化合物的被保护活性基团进行去保护步骤，和/或使一种或多种偶联位点与蛋白、多肽、标记物或其他分子接触形成一种合适的轭合物靶标。在后面的实施例中，这种情况可以使用双功能交联剂，该双功能交联剂可以给分子的一个位点提供一个合适的偶联位点，第二个偶联基团用于附着蛋白、多肽、标记物或其他目标分子。多种双功能交联剂对本领域技术人员来说是公知的。考虑到这些6-AM衍生物聚合物的用途，本发明涉及制备抗体的方法。这些方法包括使用一种或多种轭合物为作为免疫原来刺激免疫反应。在一些实施例中，这些方法也可以包括在适当的免疫操作手册指导下实施一种或多种本发明的轭合物，并从动物的体液中分离适当的抗体。制备免疫原、免疫动物、收集抗血清的示例性操作手册如《抗原》所述(ANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL,E.HarlowandD.Lane,eds.,ColdSpringHarborLaboratory(ColdSpringHarbor,NY,1988)pp.55-120,)该文献被完整的收录在参考文献里。或者，本发明所述的6-单乙酰吗啡类似物的轭合物可选择的被用于噬菌体展示方法中，用来筛选表面展现出适当抗体的噬菌体，接着分离这些至少编码适当抗体的可变区域的核苷酸序列。噬菌体展示技术是本领域的技术人员熟知的。这些方法可以用于被免疫的或未被免疫的动物，作为一种核苷酸资源来建立噬菌体展示文库。以这种方式制备的抗体更适宜在受体结合测定中作为治疗分子和/或作为受体来使用。更优选的，这样的抗体在亲和力的作用下与6-AM结合，这种亲和力与对吗啡、吗啡-3-葡糖苷酸，和/或吗啡-6-葡糖苷酸的亲和力相比至少多5个因子，更优选的至少多10个因子，更优选的至少多30个因子，最优选的至少多50个因子或更多。以这种方式制备的抗体可以在免疫测定中被用作特殊的结合试剂，来确定样品中6-AM的浓度。以实例来说，这个方法可以包括使用具有通式的轭合物进行一个竞争性免疫测定，这个通式选自(IV),(V),或(VI)，其中P是一个可检测标记物，这个方法包括用测定信号来确定样品中6-AM的浓度。优选的免疫测定提供了一个来自信号，10μg/mL6-AM产生的信号比10μg/mL的，更优选的1000μg/mL的吗啡，吗啡-3-葡糖苷酸，和/或吗啡-6-葡糖苷酸的信号多至少大5倍，更优选的多至少大10倍，更优选的多至大30个倍，最优选的多至少大50倍或更多。从下文的详细描述、典型实施例和权利要求中可以明显的发现本发明的其他实施例。附图说明图1(A)通过1(E)描述了本发明6-AM类似物的实例。图2和3描述了制备本发明典型6-AM类似物的反应流程。图4描述了制备本发明典型6-AM类似物的反应流程。图5描述了制备本发明典型6-AM类似物的反应流程。图6描述了制备本发明典型6-AM物制备类似的反应流程。图7描述了多个批次的6-AM抗原免疫交联不同浓度的6-AM的测定中所产生的性能曲线。本发明的详细内容本发明部分涉及6-AM类似物和它们的生产和使用方法，特别用于制备包含6-AM类似物的可交联的巯醇来轭合其他分子，并使用这种轭合物来制备检测6-AM的免疫测定中的试剂。本发明的类似物特别适合生产一些在6-AM的受体结合测定中使用的抗体和标记物，该测定用来从吗啡、吗啡-3-葡糖苷酸，吗啡-6-葡糖甘酸和其他类阿片类中来区分6-AM。为了清晰的阐述本发明，下面提供了本发明化合物的术语的定义。这里所述的术语“芳基”指至少一个环具有∏电子共轭结构的可任意取代的芳香基团，包含多达两个共轭或稠环结构。芳基包括碳环、杂环和联芳环基团，所有这些基团都可以被任意取代。优选的芳基可以是可任意取代的苯基，可任意取代的吡啶基，可任意取代的苯并噻喃基(benzothiopyranyl)，可任意取代的咔唑，可任意取代的萘基，可任意取代的四氢奈基(tetrahydronaphthyl)。其中，最优选的“芳基”是一个具有5-6个环原子的碳单环(最优选的为苯基)。芳基或异种芳基Ar基团(在这里所述的交联剂作用下一个环原子被加工成一个亚芳基或异种亚芳基)一般最多可以容纳10个环原子，但是本领域技术人员将会认为具有超过10个环原子的芳基也被包含在本发明的范围内。通过Ar环绕的环系统可以容纳多达4个杂原子，这些杂原子可以独立选自N，S和O。单环芳基包括，但不限于：芳基，噻唑基，呋喃基，吡喃基，2H-吡咯基，噻吩基，咪唑基(imidazoyl),吡唑基(pyrazoyl),氮苯基，吡嗪基，嘧啶基和哒嗪基团。融合二环Ar基团包括，但不限于:苯并噻唑，苯并咪唑，3H-吲哚，吲哚，吲唑基(indazoyl),嘌呤基，喹嗪基(quinolizinyl),异喹啉基，喹啉基，酞嗪基(phthalizinyl),萘啶基(naphthyridinyl),喹唑啉基，噌啉基(cinnolinyl),异噻唑基，喹喔啉基(quinoxalinyl)吲嗪基(indolizinyl)，异吲哚基，卞噻吩基(benzothienyl),苯并呋喃基，异苯并呋喃基和异苯并呋喃基(chromenyl)基团。这里所用的术语“杂原子”指非碳原子，非氢原子，例如N,O和S。芳基也可以被其他化学基团任意取代一个或多个氢原子。优选的取代基包括直链或支链C1-6烷基(如异丙基)，卤素，三卤甲基，烷氧基，NO2,NH2,OH,-COOR’,其中R’是H或低价烷基，CH2OH和CONH2。这里所用的术语“烷基”指包括直链或支链的饱和脂肪族烃。优选的烷基基团具有1-20个碳原子。更优选的，其可以是中等烷基(具有1-10个碳原子)。最优选的，其为低价烷基(具有1-4个碳原子)。烷基基团可以被取代或不被取代。这里所用的术语“烷氧基”基团指同时具-O-的烷基-O-环的烷烃基；优选的烷氧基团指低价烷氧基，最优选的为甲氧基或乙氧基。这里所用的术语“硫代内酯”指一个具有5个或6个环原子的环烃，其中一个是S杂原子，其中杂原子与被＝O取代的碳毗邻。这里所用的术语“硫酯”指一种具有R-S-C(O)-R’结构的有机化合物。这里所用的术语“烷基硫醇”指包含一个-SH基团的烷基基团。硫醇也指“含硫的醇类”和“巯基”。这里所用的术语“抗体”指能与一种抗原或抗原表位特异结合的一种肽或多肽，衍生、仿造或基本上编码自一种免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因，或它们的片段。例如FundamentalImmunology,3rdEdition,W.E.Paul,ed.,RavenPress,N.Y.(1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85-97.术语抗体包括抗原-结合部分，如“抗原结合位点”，(如片段，序列，互补决定区(CDRs))保持结合抗原的能力，包括(i)一个Fab片段，由VL,VH,CL和CH1域组成的单价片段；(ii)一个F(ab’)2片段，一个二价片段，该片段在铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段组成；(iii)一个由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)一个dAb片段，该片段由VH域组成；(vi)一个独立的互补决定区(CDR)。单链抗体也被引用在术语“抗体”中。这里使用的术语“多肽”指由肽键连接的具有氨基酸序列的分子。这个术语包括蛋白，融合蛋白，寡肽，环肽和多肽衍生物。多种抗体和抗体衍生物在上文中被单独讨论过了，但多种抗体和抗体衍生物，就本发明而言，被认为是多肽或衍生物的亚类。术语蛋白指一种多肽，其从原始材料中被分离出来的，或从分离的cDNA中利用重组DNA技术产生的，并且其氨基酸序列的长度至少约200个氨基酸。这里所用的术语“核苷酸”指多聚脱氧核糖核苷酸(包括2’-脱氧-D-核糖或它们的修饰形式)，多聚核糖核苷酸(包括D-核糖或它们的修饰形式)，和其他类型的多聚核苷酸的通式，这里所用的多聚核苷酸具有N-糖苷的嘌呤或嘧啶碱基，或修饰过的嘌呤或嘧啶碱基。这里所用的术语“适配子”指能特异结合和改变靶标分子生物功能的单链或双链脱氧寡核苷酸，寡核糖核苷酸或其修饰过的衍生物。靶标分子被定义为一种蛋白，肽和它们的衍生物。适配子在生理条件下具有结合靶标分子的能力。适配子的作用不同于反义效应，在反应效应中适配体的作用通过与蛋白，肽和它们的衍生物结合而被诱导，在生理条件下与核苷酸互作或结合但不被诱导。这里所用的术语“多糖”指含有由超过10个糖苷连接的单糖残基的分子，其中术语“寡糖”指包含2-10个糖苷键连接的单糖残基的分子。术语“小分子”包括具有分子质量小于约5000道尔顿(Da)的任何分子，优选的约为小于2500道尔顿，更优选的约为小于1000Da，最优选的约为小于500Da。功能基团对于制备可检测标记物抗体的轭合物、抗病毒和其他标记蛋白和核苷酸试剂，化学交联剂是非常有用的工具。这些试剂可以基于以下性质被划分：1.功能基团和化学特性；2.交联键的长度和成分；3.交联键是否相似(同型)或不同(异型)；4.基团是否起化学的或光化学反应；5.试剂是否易分裂的；6.试剂是否是光标记的或用其他标记物标记的。当本发明的化合物提供一种有效的巯基作为一个附着点时，靶标可以被准备提供一个适宜的巯基活性位点。通过巯基(巯醇)偶联的交联试剂可以从很多市售资源获得。马来酰亚胺，烷基和卤代芳烃，和阿尔法-卤酰基(haloacyls)与巯基反应来形成巯醚键，吡啶二硫化物与巯醇反应来产生混合的二硫化物。吡啶二硫化物产物是可分裂的。这种试剂可以具有两种不同功能的，试剂的第二位点可用于修饰轭合靶标来吸收巯醇活性位点。除了巯基醇，活性基团可以被交联剂作为靶标，这些交联剂包括伯胺，醛酮，碳水化合物和羧酸。另外，很多活性基团可以用交联剂非选择性偶联例如光敏苯基叠氮化合物。因此，偶联蛋白需要两个步骤，该蛋白能允许氨基酸修饰偶联到本发明所述的6-单乙酰吗啡的类似物上。适宜的试剂，参考皮尔斯2003-2004应用手册和目录#1600926，该文献被完整的包含在参考文献中。一个末端为有活性的氨基另一个末端为有活性的巯基的交联剂是非常普遍的，如果用异双功能试剂，最不稳定的基团一般最先反应以确保有效的交联避免产生不需要的聚合。很多因素被认为会影响交联剂与靶标的最适摩尔比。根据实际应用，轭合的程度是一个重要的因素。例如，当制备免疫原轭合物时，一般希望高轭合率可以增加抗原的免疫原性。然而，当轭合一种抗体或酶时，一个低至中等程度的轭合是最适宜的从而确保蛋白保持了生物活性。蛋白表面活性基团的数量也被认为是非常重要的因素。如果有很多靶标基团，交联剂与蛋白的低交联率更有用。对于限制数量的潜在靶标，就需要交联剂与蛋白的高交联率。对于小分子质量的蛋白这就意味着每克需要更多交联剂。与特异的互作有关的蛋白的构象变化在互作之前或之后进行的交叉结合研究中被分析。比较了使用不同臂长的交联剂并分析了成功的轭合。当蛋白的构象改变从而受阻碍的氨基酸变的可用于交联时，具有不同活性基团和/或空间臂的交联剂的使用是非常适宜的。具有可变长度的空间臂或可变长度活性末端连接桥的交联剂是可供使用的。最明显桥的属性是具有处理相连基团的空间位阻的能力。因为空间位阻决定了用于交联的潜在活性位点间的距离，不同长度的桥是互作需要考虑的。短空间臂常被用于分子内的交联研究，而分子间交联则青睐包含长空间臂的交联剂。在交联剂中包括聚合物部分(如聚乙二醇(“PEG”)均聚物，据丙二醇均聚物，其他烷基-聚氧化乙烯，双-聚氧化乙烯和共聚物或聚(烯化氧)的块状共聚物)，在某种条件下是有优势的。例如，美国专利5,643,575,5,672,662,5,705,153,5,730,990,5,902,588,和5,932,462；和Topchievaetal.,Bioconjug.Chem.6:380-8,1995。例如，美国专利5,672,662公开了含有一种PEG聚合物部分和一个酯键的双功能交联剂。那些分子据说在水中提供了约10-25分钟的半衰期。设计交联剂包括可能采用的功能基团的选择。功能基团的选择完全依赖于要被交联的物种上可获得的靶标位点。一些物种(如蛋白)可以存在很多可获得的靶位点(ε-氨基的赖氨酸，半胱氨酸的巯基，羧基谷氨酸等)，并且可以根据经验选择特定的功能基团来保存目标的最佳生物属性(如抗体的结合亲和力，酶的催化活性等)。1.通过胺基基团偶联亚胺酸酯和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，“NHS”)酯类一般被作为胺特异的功能基团。NHS酯类与伯胺或二级胺类反应产生稳定的产物。在生理pH情况下偶联是高效的，溶解状态下的NHS酯类交联剂比他们的同类更稳定。同双功能NHS酯类轭合物通常在一步法或两步法反应中用于交联含胺蛋白。原则上初级胺是NHS酯类的靶标。在蛋白的N末端存在可接近的α-氨基基团与NHS酯类反应形成酰胺。然而，因为蛋白上的α-氨基不总是可利用的，因此氨基酸侧链上的反应也是很重要的。当5个氨基酸的侧链具有氮时，仅赖氨酸的ε-氨基基团能与NHS-酯类显著反应。当NHS-酯类交联试剂与伯胺反应时形成一个共价键，释放N-羧基丁二酰亚胺。2.通过巯基基团偶联马来酰亚胺、烷基和卤代芳烃，α-卤酰基(α-haloacyls)和吡啶二硫化物一般被作为特异的巯基功能基团。当反应混合物的pH保持在pH为6.5和7.5之间时，马来酰亚胺基团是特殊的巯基基团。在pH为7时，具有巯基的马来酰亚胺的反应比具有胺类的快1000倍。马来酰亚胺不与酪氨酸，组氨酸或蛋氨酸反应。当不存在足够数量的游离的巯基时，他们常通过现有的二硫键还原产生。3.通过羧基偶联碳化二亚胺与伯胺或酰肼类的羧基偶联，从而形成酰胺或酰腙键。碳化二亚胺不像其他的共轭反应，碳二亚胺和与之偶联的分子之间不形成交联桥；而是在有效的羧基和有效的氨基之间形成一个肽键。蛋白质的羧基末端，以及谷氨酸和天冬氨酸的侧链,可以被作为靶标。在过量交联剂存在的情况下，会发生聚合因为蛋白质同时含有羧基和氨基。没有形成交联桥，酰胺键是同样可以作为一个肽键，所以没有破坏蛋白质的情况下逆转的交联是不可能的。4.无选择性标记物光亲和试剂是一种化学惰性化合物，当该化合物暴露在紫外线或可见光下时就变的有活性。芳基迭氮化物(arylazides)是光亲和试剂，在250-460nm波长下会光解，形成活性的芳基氮烯。这种芳基氮烯会无选择性反应形成共价键。还原剂必须谨慎使用，因为他们可以减少叠氮基。5.特异的羰基交联剂羰基化合物(醛和酮)在pH为5-7时与胺类和酰肼类反应。与酰肼类反应比胺类更快，这对于特异位点的交联来说是非常有用的。羰基化合物不易存在于蛋白质中；然而，用高碘酸钠轻度氧化糖基将会转变邻位羟基为醛或酮。可交联的6-单乙酰吗啡类似物的示例应用1.载体蛋白-半抗原/肽/多肽的轭合物用为免疫原很多公司在免疫学研究领域提供市售产品。有很多交联剂用于生产这些轭合物，最好的选择是依赖存在于半抗原上的活性基团，以及与半抗原载体轭合在注射后成功的成为免疫原的能力。碳化二亚胺是产生肽载体轭合物的不错选择，因为蛋白和肽同时包含几个羧基和伯胺。其他交联剂也能被作为免疫原轭合物。佐剂是天然化合物或合成化合物的混合物，当与抗原一起被注射时，可以增强免疫反应。佐剂用于(1)对本身不具有免疫原性的抗原刺激产生免疫反应，(2)提高免疫反应的强度，(3)优先刺激细胞或体液的免疫反应(即，通过产生抗体对抗疾病)。佐剂主要有四个作用：增强抗原的摄取和定位，延长抗原的释放，激活巨噬细胞和对T、B细胞的刺激。最常用的佐剂分为六类：矿物盐，油乳剂，微生物产品，皂甙，合成产品和细胞激素。佐剂及使用方法在免疫学方法手册中赋予了更广泛的讨论(IMMUNOLOGYMETHODSMANUAL,vol.2,I.Lefkovits,ed.,AcademicPress,SanDiego,CA,1997,ch.13)，该文献已被完整的包含在参考文献中。小分子如6-单乙酰吗啡通常不具有免疫原性，即使在与佐剂一起注射的情况下。为了对这些化合物产生免疫反应，往往需要使它们附着在被称为载体的蛋白质或其他化合物上，这就是免疫原性。被附着到载体蛋白上的小分子抗原称为半抗原。在免疫测定中半抗原也与载体蛋白轭合使用。载体蛋白提供了一种方式，使半抗原附着到固相支持物上如微孔板或硝酸纤维素膜。当附着到琼脂糖凝胶上时可用于半抗原抗体的纯化。它们也可以被用来创造一种能形成大型的抗原抗体复合物的多价抗原。选择载体蛋白时，记住动物会对载体蛋白以及附着的半抗原形成抗体。因此，选择与检测样品不相关的蛋白作为免疫载体蛋白是非常重要的。如果轭和的半抗原同时需要免疫和检测，两种载体蛋白应尽可能不同。这样可以使用抗血清，而不必从抗载体抗体中分离抗半抗原抗体。钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)是一种发现于软体动物的呼吸蛋白。它的大小使得它非常具有免疫原性，其具有大量可用于轭合的赖氨酸残基，使得它成为一种非常有用的半抗原载体如6-单乙酰吗啡。哺乳动物和软体动物间的系统差异增加了免疫原性，减少了抗体对KLH与对哺乳动物中天然存在的蛋白质之间的交叉反应性风险。2.固相固定本发明的类似物和/或轭合物可以被固定在固相基质上，作为亲和载体用于样品分析。同样的，用本发明的单乙酰吗啡类似物和/或轭合物制作或选择的抗体或它们的结合片段也可以被固定在固相基质上。本文中使用的术语“固相”是指本领域的技术人员常用的用来隔绝分子的各种材料，包括固体，半固体，凝胶，薄膜，膜，网格，毡，复合材料，颗粒，纸等。固体相可以是无孔或多孔的。适宜的固相包括那些在固相结合测定中使用的固相或它们的研制产品。例如《免疫分析》第九章(chapter9ofImmunoassay,E.P.DianiandisandT.K.Christopouloseds.,AcademicPress:NewYork,1996,)其被完整的引用在参考文献中。适宜固相的实例包括膜滤器，纤维素纸，玻璃珠(包括聚合物，乳液与顺磁颗粒)，玻璃，硅晶片，微粒，纳米粒子，藤塔(tenta凝胶，阿格罗(agro)凝胶，丙烯酸酯(PEGA)凝胶，凝胶和多孔板。例如：Leonetal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.8:2997,1998；Kessleretal.,Agnew.Chem.Int.Ed.40:165,2001；Smithetal.,J.Comb.Med.1:326,1999；Orainetal.,TetrahedronLett.42:515,2001；Papanikosetal.,J.Am.Chem.Soc.123:2176,2001；Gottschlingetal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.11:2997,2001。上述的那些表面可以被修饰来提供链接位点，例如通过乙酰化(bromoacetylation)，硅烷基化，用硝酸添加氨基，媒介蛋白的附着，树状几何纹和/或星型聚合物。这个列表并不意味着受限与此，本领域的技术人员可以采用任何公知的方法。3.可检测的标记轭合物生物测定需要检测方法，结果定量最常用的方法之一即为轭合一种酶、荧光团或其他可检测标记物到待研究的分子上(例如利用本发明的一种或多种类似物)，这样他们可以被固定从而用对分子有亲和性的受体分子检测。待研究分子的受体(如用本发明类似物或轭合物制作或选择的抗体或它们的结合片段)可有选择性的被轭合到一种酶、荧光团或其他可检测标记物上。酶轭合物是使用的轭合物中最常用的。可检测标记物包括本身可检测的分子(如荧光基团，电化学标记物，金属螯合物等)以及那些通过产生可检测反应产物(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)或通过本身可检测的特殊结合分子(如生物素，地高辛，麦芽糖，低聚组氨酸(oligohistidine)，2,4-二硝基苯，苯基砷酸盐(phenylarsenate)，ssDNA,dsDNA等)间接被检测到的分子。特别优选的可检测标记物是荧光乳剂粒子例如美国专利5,763,189,6,238,931和6,251,687，以及国际出版物WO95/08772所述，这些文献都被完整的引用在参考文献中。这些粒子的轭合实例在下文中会有描述。6-单乙酰吗啡在受体结合测定中的应用本发明中6-单乙酰吗啡类似物和轭合物可以在受体结合测定中方便的使用。受体结合测定包括任何测定，该测定中信号依赖于被分析物与同源受体的特异性结合，包括免疫测定，配体-受体测定和核酸分子杂交测定。被分析物的存在数量一般利用每种标记特异的抗体和特异结合检测来确定的。可以采用任何适宜的免疫测定，例如酶联免疫测定(ELISA)，放射免疫测定(RIAs)，竞争结合测定等。抗体与标记物的特异免疫结合可以直接或间接被检测到。直接标记物包括荧光或发冷光标记物、金属、染料、放射性核素等，被附着到抗体上。间接标记物包括本领域公知的各种酶，例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶等。对于本领域技术人员来说实践受体结合测定的很多方法和技术是所公知的。例如美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524；和5,480,792，上述的每一个专利内容包括所有的表格、图片和权利要求被完整的引用在参考文献中。这些装置和方法可以在各种三明治、竞争或非竞争测定格式中利用可检测性标记的分子和抗体固体介质，来产生与目的被分析物的存在或存在数量有关的信号。本领域的技术人员也承认，机械仪器包括但不限于贝克曼(BeckmanAccess),阿尔伯特(AbbottAxSym),瑞士罗氏(RocheElecSys),戴德贝林层云系统(DadeBehringStratussystems)，是是免疫测定分析仪中能够执行这种免疫测定的仪器。另外可以采用某些方法和装置例如生物传感器和光学免疫测定，来确定被分析物的存在或存在数量，不需要标记的分子，如美国专利5,631,171和5,955,377，专利内容包括所有的表格、图像和权利要求被完整的引用在参考文献中。如这里所述，优选的测定利用培育的抗体抗类似物轭合物(其中抗体被偶联到固相介质或可检测标记物上)，和/或被轭合到一种可检测标记物上的6-单乙酰吗啡类似物，和/或被轭合到固相上的6-单乙酰吗啡类似物。根据本发明，最简单的形式的检测装置，可以包括含有一种受体(一些受体)的固体表面，该受体可以与一种或多种目的被分析物(如6-AM)特异结合。例如一些抗体利用本发明的交联剂可以被固定在各种固体支持物上，例如磁性或色谱矩阵粒子，检测板表面(如微孔威尔斯)，固体基质材料块或膜(例如塑料、尼龙、试纸)等。以类似的方式，检测装置可以包括含有一种或多种固定在那里的6-AM类似物的固体表面。多种被分析物的分析可以在一个检测样品中单独或同时进行。对于标记物的单独或连续的测定，适宜的装置包括临床实验分析仪例如特别有用的物理格式包括具有多个离散的可定位的表面，用于多个不同被分析物的检测。这样的格式包括蛋白微矩阵，或“蛋白芯片”(如)以及某些毛细管装置(如美国专利)。在一些实施例中，每一个离散的表面位置可以包含用来固定一种或多种被分析物(如一种标记物)的抗体。表面可以选择性含有一种或多种被固定在表面离散位置上的离散粒子(如微粒或纳米粒子)，该微粒包含用来固定一种待检测被分析物(如标记物)的抗体。在吗啡支架的A环的1位上6-单乙酰吗啡(6-AM)衍生物的制备合成图如下图2-6所示。微粒合成单乙酰吗啡衍生物6，硫酸吗啡可以被乙酰化来制作二乙酰吗啡，接着通过碘化来产生1-碘化二乙酰吗啡衍生物2。2与丙烯酸叔丁酯Heck偶联产生烯醇3，这个过程可以利用Mg0/MeOH来选择性的还原来产生饱和的二醇4。氧磷化4，接着通过去除芳基氧磷基产生5，然后用酸性条件下去保护来产生6-氧磷基衍生物6(图2)。为了合成6-乙酰胺衍生物13，水合盐酸吗啡可以用卞胺被还原氨化，还原后来产生6-氨基水合吗啡衍生物8。6-氨基化合物被乙酰化，碘化后产生1-碘-6-乙酰胺10。10与丙烯酸叔丁酯Heck偶联产生烯醇11，该烯醇可以用Mg0/MeOH还原来提供饱和的6-乙酰胺12。12酸性去保护提供了6-乙酰胺衍生物13(图3)。为了合成6-二硫化乙酰17，饱和的二醇4可以被乙酰化来提供14，然后用羟胺去除乙酸酚酯后产生15，在酸性条件下去除叔丁酯的保护产生羧酸16。接着羧酸16可以与胱胺偶联来提供6-二硫化乙酰17(图4)。为了合成磺酰胺21，二乙酰吗啡可以被脱甲基产生去甲基-二乙酰吗啡18，接着形成氯化物19。然后氯化物被取代来产生硫代醋酸盐20，接着硫代醋酸盐去保护形成磺酰胺21(图5)。为了合成季盐22，二乙酰吗啡1可以用2-溴代乙酰-HCTL烷基化(图6)。五水合硫酸吗啡五水合硫酸吗啡和盐酸二氢吗啡酮来自光谱化学公司。1H核磁共振波谱通过NuMega实验室于500赫兹用二甲基亚砜D6(来自安瓶)或CDCl3进行。高效液相色谱采用配置了沃特斯X-桥接器(C18,3.5μm,3.0x50μm)或费舍尔热(FisherThermoHypercarb)柱(5.0um,4.6x100mm)的安捷伦1200机器上进行分析。对于高效液相色谱，溶剂A(95％H2O/5％CH3CN/0.1％TFA)，溶剂B是(95％CH3CN/5％H2O/0.1％TFA)可以如本文所述使用。高效液相色谱要么运行6分钟要么运行15分钟。对于运行6分钟：0分钟,5％B,0-5分钟,渐变至100％B,5-6分钟,渐变至5％B；对于运行15分钟：0分钟0％B,0-12分钟,渐变至100％B,12-14分钟100％B,14-15分钟,渐变至0％B。LC/MS可以用装配有2996型光电二极管阵列检测器，一系列3100MS和沃特斯X-Bridge-C18柱，3.5um,2.1x50mm的沃特斯e2795系列LC进行分析。对于LC/MS,溶剂A(95％H2O/5％CH3CN/0.1％甲酸)和溶剂B(95％CH3CN/5％H2O/0.1％甲酸)可以如这里所述使用。高效液相色谱运行5分钟：0分钟0％B,0-3.5分钟,梯度至100％B,3.5-4.8分钟100％B,4.8to4.9分钟梯度至0％B,5.0分钟,0％B。二乙酰吗啡(1)：五水合硫酸吗啡(1g/1.32mmol五水合硫酸吗啡/2.64mmol吗啡)被悬浮在CH2Cl2(10mL)，接着添加NEt3(2.0mL/14mmol)，吡啶(3mL)和无水醋酸(2.4mL/25.4mmol)。生成的悬浮液在室温搅拌1小时，在这段时间所有的硫酸吗啡溶解。然后溶液在室温搅拌14小时。这段时间后，另外添加无水醋酸(200μL/2.1mmol)，溶液在40℃加热6小时。然后冷却至室温，添加甲醇(7mL)，在减压去除溶剂前，生成的溶液于室温搅拌1小时。剩余的残留物被分入分液漏斗中的乙酸乙酯(90mL)和饱和NaHCO3(45mL)间，晃动双相混合液至最低量的气体排出。有机相用饱和碳酸氢钠(20毫升)和盐水(20毫升)洗涤，用硫酸镁干燥。旋转蒸发溶剂，产生的浅褐色残留物在真空泵中放置过夜，获得二乙酰吗啡(905毫克/70％产出率)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)6.77(d,J＝8.5Hz,1H),6.63(d,J＝8.0Hz,1H),5.57(m,1H),5.48(m,1H),5.11(m,1H),5.08(m,1H)；LC/MS370(M+H+)。1-碘代二乙酰吗啡(2)：碘代丁二酰亚胺(NIS)(427mg/1.9mmol)被逐步添加到0.05MH2SO4(15mL)中的1(460mg/1.25mmol)溶液中，生成的溶液在逐步添加碘代丁二酰亚胺(NIS)(93mg/0.4mmol)前于室温搅拌3小时。然后反应在室温搅拌3小时，这段时间后，LC/MS指示反应结束。接着反应被转移到含有30mL乙酸乙酯的分液漏斗上，反应容器用乙酸乙酯完全清洗。然后添加饱和的NaHCO3(20mL)，晃动分液漏斗，分层，水层用乙酸乙酯(2x15mL)萃取。混合的有机相用2％的亚硫酸钠(2x10ml)和盐水(1x10ml)清洗，用硫酸镁干燥，减压去除溶剂。粗提物用ISCO(24g柱子,CH2Cl2中0-10％的甲醇)纯化产生黄色固体纯产物(618mg/94％产出率)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.27(s,1H),5.53(app.q,2H),5.14(m,1H),5.06(d,J＝6.5Hz,1H)；LC/MS496(M+H+)。添加无水DMF(25mL)到一个含有2(1.19g/2.4mmol)的玻璃小瓶中，溶液用氩气喷雾5分钟，接着添加双三苯基磷二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2)(0.17g/0.24mmol)，丙烯酸叔丁酯(1.7mL/11.7mmol)和NEt3(1.3mL/9.4mmol)。生成的溶液在90℃加热6小时，然后冷却至室温。加入乙酸乙酯(50mL)，溶液被转移到分液漏斗上。有机相用饱和的NaHCO3(1x15mL)水溶液清洗，水层用乙酸乙酯(2x15mL)反萃取。混合的有机相用盐水(1x15mL)洗涤，硫酸镁干燥，低压条件下去除溶剂。粗提物用ISCO(24g柱子,CH2Cl2中0-10％的甲醇)纯化产生黄色固体的烯醇3(795mg/67％产出率)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.62(d,J＝16Hz,1H),7.35(s,1H),6.27(d,J＝16Hz,1H),5.52(app.q,2H),5.14(m,1H),5.10(d,J＝7Hz,1H),1.47(s,9H)；LC/MS496(M+H+)。烯醇3(828mg/1.67mmol)用甲醇溶解(12mL,Sigma-Aldrich,无水的)，接着添加镁屑(280mg/11.5mmol)，生成的溶液在室温搅拌2小时，在这期间所有的镁溶解。另外添加镁屑(50mg/2.1mmol)，反应溶液被搅拌2小时。然后减压去除溶剂从而产生一种黑褐色固体，该黑褐色固体溶解在10mLCHCl3中(有必要用超声助溶)溶液被转移到500mL的分液漏斗中。反应玻璃小瓶用CHCl3(3x10mL)洗涤，添加20mLCHCl3到分液漏斗中，接着添加15mL盐水。一单加入盐水，就形成乳液。额外的30mLCHCl3被加入漏斗中，通过排出有机相到1L的锥形瓶中悬浮液被分离开。剩余的水层用CHCl3(6x35mL)萃取，混合的有机相与37g硫酸钠搅拌过夜干燥。过夜搅拌后，有机相是灰暗的。溶液用海藻土过滤。海藻土用CHCl3(3x40mL)洗涤，溶剂被旋转蒸发获得非晶形固体4(230mg/33％产出率)，该非晶形固体不需要进一步纯化即在下一个步骤中使用。LC/MS496(M+H+)。二甲基氧磷氯被逐步加入250mL烘干的圆底烧瓶中，接着添加吡啶(无水，5mL)，生成的溶液在逐步加入四唑(16mL的3％质量溶度溶于CH3CN)前冰浴30分钟冷却至0℃。生成的溶液在加入相同温度的溶解在吡啶(无水，5mL)中的二醇(镁还原材料粗提物4)前，于0℃搅拌10分钟。溶液于0℃搅拌10分钟，接着去掉冰浴，室温放置2小时。这段时间后，LC/MS显示反应结束，仅观察到大部分二氧磷基(diphosphinyl)产物。然后减压去除吡啶溶剂(仍有吡啶残留)。去除大部分吡啶后，添加30mL饱和碳酸氢钠，接着加入15mL甲醇。生成的溶液于室温搅拌48小时。溶液被转移到250mL分液漏斗中，反应烧瓶用CH2Cl2(2x15mL)洗涤。添加20mLCH2Cl2到分液漏斗中，接着加入10mL盐水。缓慢晃动漏斗，分离有机相。水相用CH2Cl2(3x20mL)萃取，混合的有机相用硫酸镁干燥，减压去除溶剂，产物用24g硅胶柱(100％CH2Cl2至80％CH2Cl2:20％CH2Cl2:MeOH:浓缩的NH4OH(8:2:0.001))通过ISCO纯化得到5(176mg/65％来自粗提物4)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)8.81(s,1H),6.32(s,1H),5.55(d,J＝10Hz,1H),5.38(d,J＝10Hz,1H),4.83(m,1H),4.77(d,J＝5Hz,1H),1.55-1.44(dd,J＝15,40Hz,6H),1.37(s,9H)；LC/MS491(M+H+)。叔丁酯5(171mg/0.35mmol)被溶于CH2Cl2(3mL)，接着加入TFA:CH2Cl2(3mL:1mL)。生成的溶液于室温搅拌2小时，接着减压去除溶剂。然后残留物在真空下放置2小时。然后加入1.5mLCH2Cl2。接着添加溶于乙醚的盐酸(450mL)。旋转蒸发溶剂，生成的固体用CH2Cl2(1x3mL)和CH3CN(2x3mL)旋转蒸发，接着过夜抽真空获得米色固体6(159mg/99％产出率)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)9.10(s,1H),6.44(s,1H),5.69(d,J＝10Hz,1H),5.42(d,J＝10Hz,1H),4.95(d,J＝10Hz,1H),4.86(m,1H),1.57-1.46(dd,J＝15,40Hz,6H)；31PNMR(125MHz,CD3OD)60.47；LC/MS434(M+H+游离碱)。盐酸二氢吗啡酮(469mg/1.5mmol)被加入烘干的具有磁力搅拌转子的烧瓶中，接着使盐酸二氢吗啡酮悬浮在二氯乙烷(无水，12mL)中。往获得的悬浮液中加入苄胺(192L/1.8mmol)和三乙酰氧基氢化钠(592mg/2.8mmol)。获得的悬浮液在氩气下过夜搅拌。然后悬浮液被转移到分液漏斗中，反应瓶用CH2Cl2(3x10mL)洗涤。饱和的碳酸氢钠(10mL)被加入分液漏斗中，晃动内容物。溶液分层，水层用CH2Cl2(3x10mL)萃取。混合的有机相用盐水(1x5mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥。过滤去除硫酸镁，减压去除溶剂获得粗提物，粗提物用ISCO(12g柱子,溶于CH2Cl2的0-10％甲醇)纯化获得7(484mg/88％)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)8.8(s,1H),6.54(d,J＝7.5Hz),6.44(d,J＝8.0Hz,1H),4.67(d,J＝4.1Hz,1H),3.78(m,2H)；LC/MS377(M+H+)。苄基保护胺8(508mg/1.35mmol)被溶于甲醇(10毫升)，接着用氩气鼓吹排气10分钟。然后加入Pd/C(102mg)和甲酸铵(483mg/7.7mmol)，获得的溶液于70℃搅拌1.5个小时。然后溶液用硅藻土过滤，减压去除溶剂。获得的粗提物过夜抽真空。粗提物未进一步纯化即在下一步中被分析使用。1HNMR(500MHz,CDCl3)6.67(d,J＝8.0Hz,1H),6.53(d,J＝8Hz,1H),4.63(d,J＝4.0Hz,1H)；LC/MS287(M+H+)。胺8在氩气条件下被溶于CH2Cl2(无水,20mL)，然后于室温加入无水醋酸(433L/4.58mmol)和NEt3(979L/7.0mmol)。获得的溶液在氩气下室温搅拌过夜。这段时间后，反应被转移到分液漏斗中，反应烧瓶用CH2Cl2(3x10mL)洗涤。额外的CH2Cl2(25mL)被添加到分液漏斗中，接着加入5％无水碳酸氢钠(15mL)。晃动漏斗，分层。水相用CH2Cl2(2x25mL)萃取。然后混合的有机相用水和盐水(1x10mL每次)清洗，用硫酸镁干燥。过滤有机相，减压去除溶剂。获得的溶液用ISCO(0to10％甲醇含有0.1％的氨水,24g柱子)纯化获得白色纯产物(595mg/80％)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.30(d,J＝7.5Hz,1H),6.84(d,J＝8.0Hz,1H),6.67(d,J＝8.0Hz,1H),4.63(d,J＝4.0Hz,1H),3.94(m,1H)；LC/MS371(M+H+)。6-乙酰胺9溶于100mMTFA(35mL)水溶液中，然后逐步加入NIS(230mg/1.02mmol)，获得的溶液室温搅拌2小时。这段时间后，额外添加NIS(50mg/0.22mmol)，溶液室温搅拌2小时。然后反应被转移到分液漏斗中，加入CH2Cl2(50mL)，然后加入5％碳酸氢钠水溶液(15mL)。晃动漏斗，分层。然后水相用CH2Cl2(3x25mL)萃取，接着混合的有机相用2％亚硫酸氢钠(2x10mL)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，接着过滤减压去除溶剂产生粗提物。粗产物用ISCO(24g柱子,0-10％溶于CH2Cl2的甲醇)纯化产生黄色固体10(396mg/81％产出率)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.39(d,J＝7.5Hz,1H),7.35(s,1H),4.66(d,J＝4.0Hz,1H),3.97(m,1H)；LC/MS497(M+H+)。DMF(无水，11mL)加入含有碘化物10(380mg/0.76mmol)的小瓶中，在加入双(三苯基膦)二氯化钯(II)(Pd(PPh3)2Cl2)(54mg/0.08mmol)、叔丁丙烯酸盐(0.53mL/3.65mmol)和NEt3(0.42mL/3.0mmol)前，溶液用氩气喷雾5分钟。获得的溶液90℃加热6小时，然后冷却至室温。然后反应被转移到一个分液漏斗中，反应瓶用CHCl3(10mL)清洗。另外添加CHCl3(20mL)到分液漏斗中，接着加入5％碳酸氢钠(10mL)。晃动漏斗，分层。然后水相用CHCl3(2x15mL)萃取，然后混合的有机相在用硫酸镁干燥、过滤、减压去除溶剂前用盐水(1x10mL)洗涤。粗提物用ISCO(24g柱子,0-10％溶于CH2Cl2的甲醇)纯化产生橘黄色泡沫11(357mg/92％)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.67(d,J＝15.0Hz,1H),7.45(s,1H),7.40(d,J＝5Hz,1H),6.30(d,J＝15.0Hz,1H),4.70(d,J＝5Hz,1H),3.98(m,1H),1.47(s,9H)；LC/MS498(M+H+)。烯醇11(217mg/0.44mmol)在氩气条件下溶于40mL汤姆森瓶中的甲醇(无水，11毫升)中，接着逐步加入镁屑(108mg/4.44mmol,130℃烘干2小时,然后在吸湿器中冷却)。生成的溶液在氩气下室温搅拌5小时，接着加入镁屑(20mg/0.08mmol)，然后室温搅拌2小时。这段时间后，减压去除溶剂，接着添加CHCl3(10mL)和盐水(10mL)。生成的溶液用沙过滤，首先用CHCl3(50mL)清洗，然后用CHCl3:甲醇(6:4,200mL)清洗。滤液被放置到分液漏斗中，分离水相和有机相。水相用CHCl3(2x15mL)萃取，和混合有机相用硫酸镁干燥、过滤，减压去除溶剂。粗提物用ISCO(0-10％甲醇+溶于CH2Cl2中的浓缩的0.1％氨水)纯化获得12.1HNMR(500MHz,DMSOD6)8.95(s,1H),7.50(d,J＝7.5Hz,1H),6.50(s,1H),4.57(m,1H),3.94(m,1H),1.36(s,9H)；LC/MS457(M+H+).CH2Cl2(6mL)被加入酯12(200mg/0.44mmol)中。生成的悬浮液用超声处理，接种加入TFA:CH2Cl2(3mL:1.5mL)溶液，5分钟后灰暗的(Cloudy)溶液变均匀。然后灰暗的(Cloudy)溶液在室温搅拌1.5小时，减压去除溶剂，残留物抽真空4小时。CH2Cl2(2mL)被加入残留物中，加入溶于乙醚的盐酸(1M溶液,550uL)。减压去除溶剂，残留物与CH2Cl2(2x5mL)一起旋转蒸发。产物13未经进一步纯化即进行分析和使用。1HNMR(500MHz,DMSOD6)9.12(s,1H),7.52(d,J＝7.5Hz,1H),6.55(s,1H),4.63(d,J＝4.0Hz,1H),3.94(m,1H)；LC/MS401(M+H+of游离碱)。无水醋酸(21μL/0.21mmol)，NEt3(17μL/0.12mmol)和DMAP(1prill)被加入溶于CH2Cl2(无水，2mL)的粗提物二醇4(13mg/0.031mmol)的溶液中，获得的溶液在室温搅拌过夜。然后溶液倒入乙酸乙酯(10mL)中，有机相用饱和的碳酸氢钠和盐水(1x5mL每次)洗涤。有机相用硫酸镁干燥、过滤，减压去除溶剂。粗提物通过预制TLC(9:1CHCl3:甲醇)纯化获得非晶状固体14(4mg/20％产出率)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)6.58(s,1H),5.49(app.q,2H),5.09(m,1H),4.99(d,J＝6.5Hz,1H),1.35(s,9H)；LC/MS498(M+H+).逐步加入羟胺(35mg/0.50mmol)后，双醋酸酯14(75mg/0.17mmol)被加入50mMNaPi,pH7.5(2mL):甲醇(2mL)的溶液中。获得的溶液室温搅拌4小时，接着减压去除甲醇。剩余的水溶液用乙酸乙酯(3x8mL)萃取，混合的有机相用盐水(1x5mL)洗涤，用硫酸镁干燥，减压去除溶剂。产生的残留物用预制TLC(9:1CHCl3:MeOH)纯化产生白色固体15(67mg/85％).1HNMR(500MHz,DMSOD6)9.01(s,1H),6.38(s,1H),5.59(d,J＝9Hz,1H),5.46(d,J＝10Hz,1H),5.12(m,1H),4.98(d,J＝5Hz,1H)；LC/MS456(M+H+)。加入预先混合的1.5mLCH2Cl2和1.5mL三氟乙酸(TFA)后，6-乙酰原始材料(58mg/0.13mmol)被溶解在1.5mL的CH2Cl2中。生成的溶液室温搅拌1小时，然后减压去除溶剂，残留物过夜抽真空，产物16未经进一步纯化即在下一步骤被使用(粗产出率:75mg/120％).LC/MS400(M+H+的游离碱)向溶于CH2Cl2:DMF(2mL:0.8mL)中的羧酸16溶液中加入盐酸胱胺(2.3mg/0.01mmol)，HATU(10mg/0.024mmol)和DIPEA(14μL/0.08mmol)。对混合液进行超声处理直到所有的固体溶解，然后室温搅拌过夜。这段时间后，减压去除溶剂，生成的溶液抽真空4小时来去除残留的DMF。获得的残留物用预制的TLC(iPrOH:氨水:水10:2:1)纯化获得白色固体17(8mg/86％产出率)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)9.10(s,1H),8.03(t,J＝5Hz,1H),6.40(s,1H),5.64(d,J＝10Hz,1H),5.47(d,J＝9.5Hz,1H),5.15(m,1H),5.03(d,J＝6Hz,1H),2.68(t,J＝9.5Hz,2H),2.41(t,J＝7Hz,2H)；LC/MS913(M–H)。室温加入甲苯(6mL)，碳酸钾(182mg/1.84mmol)和三氯乙基氯甲酸酯(0.36mL/2.64mmol)后，二乙烯吗啡(1,242mg/0.66mmol)被加入装有磁力搅拌转子的烘干的烧瓶中。然后获得的悬浮液在120℃回流20小时。这段时间后，LC/MS指示初始材料处理好了。然后溶液冷却至室温，添加额外的三氯乙基氯甲酸酯(0.20mL/1.47mmol)，溶液在120℃回流8小时。这段时间后，如LC/MS监测的反应结束。然后过滤去除碳酸钾，减压去除甲苯。THF(0.20mL)和90％醋酸(0.105mL)被加入生成的残留物中，悬浮液于室温搅拌6小时，然后如LC/MS监测的反应结束。溶液用移液器从大量的固体锌上分离，用粗滤器滤纸过滤到分液漏斗。滤纸用异丙醇(5mL)、CHCl3(40mL)和水(20mL)清洗。水层用氯化钠饱和，接着逐滴加入50％的羟胺水溶液直到溶液的pH值达到约7(pH试纸)。然后定时晃动漏斗促使18被萃取到有机相中。然后分离CHCl3，用50％羟胺水溶液调整溶液的pH值为约9之前逐步加入新的CHCl3(20mL)。调整pH期间定期晃动分液漏斗。分离有机相，获得的水溶液用CHCl3(3x15mL)萃取。混合的有机相用硫酸镁干燥，减压去除溶剂产生的黄色油是粗产物(233mg/100％粗产出率)；LC/MS356(M+H+)。粗产物未经进一步提纯即在下一步骤中使用。诺帝乙酰吗啡(Nordiacetylmorphine)(18)(65mg/0.18mmol)被溶于在无水CH2Cl2(3mL)中，溶液冷却到0℃，接着在0℃加入DIPEA(0.063mL/0.36mmol)和3-氯丙烷磺酰氯(0.024mL/0.20mmol)。反应在0℃搅拌1小时，然后恢复到室温搅拌过夜。接着加入4毫升水和10毫升乙酸乙酯。分层后，水相用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，混合的有机相用水(1x5mL)和盐水(1x5mL)清洗，硫酸镁干燥，加压去除溶剂。粗产物用预制TLC(1:2己烷:乙酸乙酯)纯化产生非晶状固体19(40mg/44％产出率)。1HNMR(500MHz,CDCl3)6.82(d,J＝8.2Hz,1H),6.62(d,J＝8.2Hz,1H),5.71(d,J＝11.4Hz,1H),5.42(d,J＝10.3Hz,1H),3.71(t,J＝5.9Hz,2H),2.28(s,3H),2.14(s,3H)；LC/MS495(M-H)。加入硫代乙酸钾(148mg/1.30mmol)后，氯化物19(128mg/0.26mmol)被溶解在4毫升无水DMF中，溶液于90℃加热5小时。反应冷却到室温，加入15毫升乙酸乙酯，然后溶液被转移到分液漏斗中。有机相用水(1x5mL)和盐水(2x5mL)清洗，硫酸镁干燥，减压去除溶剂产生粗产物，该粗产物用ISCO(20:1己烷:乙酸乙酯至5:1己烷:乙酸乙酯)纯化获得无定形固体硫代醋酸盐20(85mg/62％产出率)。加入100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)后，硫代醋酸盐20被溶解在CH3OH/THF(2mL:0.6mL)中。然后加入盐酸羟胺15毫克，生成的溶液于室温搅拌过夜。小瓶中的内容物被转移到分液漏斗中，加入10毫升乙酸乙酯和5毫升水，晃动漏斗。分层，水层用乙酸乙酯(1x5mL)萃取。混合的有机相用盐水(1x5mL)洗涤，硫酸镁干燥，加压去除溶剂。粗提物用预制HPLC纯化，获得纯产物为二硫化物衍生物21(LC/MS)(2.6mg/10％产出率)。通过在DMSO:磷酸钠缓冲液(pH7.5)(400uLDMSO:440uL50mMNaPi)中溶解二硫化物获得游离硫醇21，接着逐步加入TCEP(2.2mg/0.008mmol)。产生的溶液室温搅拌30分钟获得21。LC/MS452(M-H)。二乙酰吗啡1(10mg,0.03mmol)溶解在1毫升乙腈中。向混合物中加入2-溴代-N-乙酰-HCTL(16mg,0.067mmol)。反应混合物于加热至60℃过夜。接着反应混合物冷却至室温。然后混合物用硅胶薄层色谱板纯化，用10％甲醇/DCM洗脱获得3.6毫克白色粉末22(22％)。1HNMR(DMSO-d6)δ9.14(1H,d),6.88(1H,d),6.71(1H,d),5.65(1H,d),5.53(1H,d)；LC/MS528(M+)。化学轭合：6-单乙酰吗啡轭合物的制备具有一个可以与马来酰亚胺或卤乙酰基或部分卤素乙酰胺基(haloacetamido)反应的巯基的连接基团的6-单乙酰吗啡衍生物23：可以被用于制备轭合物到乳胶固体基质和KLH上，如下所述。牛血清白蛋白(“BSA”)和聚苯乙烯乳胶颗粒(界面动力学(InterfacialDynamics))在含有1-10％固体的1-10毫克/毫升BSA乳胶悬浮液的25mM柠檬酸盐缓冲液中，pH约为4，于25℃孵育30分钟。然后溶液用150mM磷酸钾/30mM硼酸钾调整至pH约中性，于25℃另外孵育2小时。悬浮液在中性pH下通过离心和重悬浮于50mM磷酸钾/10mM硼酸钾/150mM氯化钠洗涤三次。如美国专利6887952描述的N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺官能聚(乙二醇)交联剂用去离子水溶解至5-500mg/mL，被添加到含1-10％固体的BSA-乳胶粒子中。具有BSA-乳胶粒子的交联剂在室温下孵育2小时。过量的交联剂通过离心并重悬在PBS的目前为马来酰亚胺-功官能化BSA-胶乳颗粒中去除。衍生物(4-8mg)被溶解在0.8毫升DMF水溶液(70:30v/v)和200μL1M的氢氧化钾中，室温孵育10分钟。过量的碱用磷酸/盐酸缓冲液中和至pH7。存在0.1mMEDTA的情况下，马来酰亚胺-功官能化BSA-胶乳颗粒在被加入含有6-AM衍生物的溶液中，混合物于室温孵育过夜。加入氢氧化钾使pH保持在7.0。反应停止分两步。首先添加0.2mMβ-巯基乙醇于室温孵育30分钟，然后添加6mMN-(2-羟乙基)马来酰亚胺，室温再孵育30分钟。轭合乳胶颗粒的6-AM衍生物通过离心和在PBS中重悬浮纯化。钥孔血蓝蛋白(KLH，试剂盒#374817，50mg/mL溶于甘油)通过40mlGH25柱去除甘油，柱子用0.1M磷酸钾，0.1M硼酸，0.15M氯化钠缓冲液pH7.5平衡。加入1.5摩尔倍过量的N-乙基马来酰亚胺，混合物于室温孵育30分钟。涡旋时加入来自蒸馏水中的50mM母液的200摩尔倍过量的硫代SMCC(皮尔斯#22322)。涡流持续30秒，随后室温下孵育10分钟。涡旋时加入来自乙腈的80mM母液的100摩尔倍过量的SMCC(皮尔斯#22360),加入1M氢氧化钾使pH值保持在7.2和7.4之间。混合物在室温下搅拌90分钟。然后用0.1M磷酸钾、0.02M的硼酸盐和0.15M氯化钠缓冲液，pH为7.0平衡的GH25柱凝胶过滤纯化。6-AM衍生物(4-8mg)被溶解在0.8毫升的DMF水溶液(70:30v/v)和200μL1M的氢氧化钾中，室温孵育10分钟。过量的碱用磷酸/盐酸缓冲盐中和至pH为7.然后2摩尔倍过量的衍生物(基于在特定批次KLH-SMCC中的SMCC浓度)被加入KLH-SMCC中，混合物于室温搅拌90分钟。轭合物在PBS中被彻底透析进行纯化。抗6-单乙酰吗啡(6-AM)抗体的制备用KLH轭合衍生物免疫之后，通常如美国专利6,057,098所述的构建噬菌体展示抗体文库，用生物素轭合的24和磁性链霉亲和素乳胶富集。抗体噬菌体文库用24筛选，转化到表达质粒载体上，然后电转化细菌细胞。用25/26和27同时进行阴性筛选，筛选去掉与不想要表位结合的抗体。每一个抗体文库的细菌细胞在培养皿上划线来产生菌落。这些菌落，由单克隆抗体编码，被接种在96孔板中单独的培养基中。液体培养基培养过夜，用于产生冷冻细胞母液。冷冻细胞母液被用于复制96孔板培养物，接着是微克数量级的可溶状态的单克隆抗体的表达和纯化。用选择一种抗体与6-AM进行竞争性测定，该抗体与临床相关浓度的吗啡、吗啡-3葡糖苷酸或吗啡-6-葡糖苷酸表现为无交叉反应性。抗体抗6-单乙酰吗啡(6AM)及其他海洛因代谢物的交叉反应性的评价对海洛因代谢物和其他常见结构有关的鸦片类药物的交叉反应性可以用本文所述的抗体评估。用例3中的抗体构建免疫测定，配置进行竞争型免疫测定，在测定中本发明的类似化合物与其他相关化合物比较了对6-单乙酰吗啡的交叉反应性。标记的6-单乙酰吗啡轭合物被制备用作可检测种类。多份10ng/mL标记的6-单乙酰吗啡，在有本发明抗体竞争性化合物存在的情况下一起培养，竞争化合物的互作程度是由检测信号的减少量决定的，与仅存在6-单乙酰吗啡的情况相比。结构如表1所示。数据说明抗体对6-单乙酰吗啡具有高特异性。很多竞争性种类比单乙酰吗啡过量100000至1倍，没有可检测的交叉反应性；当6-单乙酰可待因与6-单乙酰吗啡为30:1过量时仅有3％的交叉反应性。数据清晰的说明本发明抗体对6-单乙酰吗啡具有特异性。实例接下去的实例用于说明本发明。这些实例绝不意味着限制本发明的范围。实例1：6-单乙酰吗啡(6AM)的衍生物的位置在吗啡支架中的A环的1位。合成方案如下图2-6所示。为了合成6-氧磷基衍生物6，硫酸吗啡被乙酰化来制作二乙酰吗啡，接着通过碘化产生1-碘-二乙酰吗啡衍生物2。2与丙烯酸叔丁酯Heck偶联产生烯醇3，该烯醇可用Mg0/MeOH选择性还原产生饱和的二醇4。4磷羧化，接着去除芳基氧磷基产生5，其在酸性条件下去保护产生6-氧磷基衍生物6(图2)。为了合成6-乙酰胺衍生物13，氢化吗啡盐酸盐(hydromorphinehydrochloride)用卞胺还原胺化，然后还原产生6-氨基氢化吗啡衍生物8。6-氨基化合物被乙酰化，然后碘化产生1-碘-6-乙酰胺10。10与丙烯酸叔丁酯Heck偶联产生烯醇11，烯醇11用Mg0/MeOH还原产生饱和的6-乙酰胺12。12酸性去保护获得6-乙酰胺衍生物13(图3)。为了合成6-乙酰二硫化物17，饱和的二醇4被乙酰化产生14，然后通过用羟胺去除酚醛树脂乙酸盐获得15，在酸性条件下去除叔丁酯的保护产生羧酸16。然后羧酸16与胱胺偶联产生6-乙酰二硫化物17(图4)。为了合成磺酰胺21，二乙酰吗啡脱甲基为去甲基二乙酰吗啡18，接着形成氯化物19。氯化物被取代形成硫代乙酸盐20，该硫代乙酸盐去保护形成磺酰胺21(图5)。为了合成季盐22，二乙酰吗啡1用2-溴-N-乙酰-HCTL烷基化(图6)。常用方法所有的原材料和溶剂均来自市售供应商除非另有说明。五水合硫酸吗啡和二氢吗啡酮来自光谱化学公司。1H核磁共振波谱在NuMega实验室中用500赫兹用二甲基亚砜D6(来自安瓶)或CDCl3获得。高效液相色谱采用配置了沃特斯X-桥接器(C18,3.5μm,3.0x50μm)或费舍尔热(FisherThermoHypercarb)柱(5.0um,4.6x100mm)的安捷伦1200型仪器上进行。对于高效液相色谱，溶剂A是95％H2O/5％CH3CN/0.1％TFA，溶剂B是95％CH3CN/5％H2O/0.1％TFA。高效液相色谱要么运行6分钟要么运行15分钟。对于运行6分钟：0分钟,5％B,0-5分钟,渐变至100％B,5-6分钟,渐变至5％B；对于运行15分钟：0分钟0％B,0-12分钟,渐变至100％B,12-14分钟100％B,14-15分钟,渐变至0％B。LC/MS在沃特斯e2795系列LC上进行，该机器配置有2996型光电二极管阵列检测器、一系列3100MS和沃特斯X-桥接器-C18柱，3.5um,2.1x50mm。对于LC/MS，溶剂A是95％H2O/5％CH3CN/0.1％甲酸；溶剂B是95％CH3CN/5％H2O/0.1％甲酸。高效液相色谱运行5分钟：0分钟0％B,0-3.5分钟,渐变至100％B,3.5-4.8分钟100％B,4.8至4.9分钟渐变至0％B,5.0分钟,0％B。合成程序二乙酰吗啡(1)：五水合硫酸吗啡(1g/1.32mmol五水合硫酸吗啡/2.64mmol吗啡)被悬浮在CH2Cl2(10mL)中，随后加入NEt3(2.0mL/14mmol)、吡啶(3mL)和无水醋酸(2.4mL/25.4mmol)。获得的悬浮液室温搅拌1小时，期间所有的硫酸吗啡溶剂。溶液于室温搅拌14小时。这段时间之后，另外添加无水醋酸(200μL/2.1mmol)，溶液于40℃加热6小时。然后溶液冷却至室温，加入7毫升甲醇，生成的溶液减压去除溶剂前于室温搅拌1小时。剩余的残留物被分入分液漏斗中的乙酸乙酯(90mL)和饱和的碳酸氢钠(45mL)间，摇晃两相混合物直到最小量的气体被排出。有机相用饱和的碳酸氢钠(20mL)和盐水(20mL)洗涤，用硫酸镁干燥。溶剂旋转蒸发，产生的淡棕色残留物过夜抽真空获得二乙酰吗啡(905mg/70％产出率).1HNMR(500MHz,DMSOD6)6.77(d,J＝8.5Hz,1H),6.63(d,J＝8.0Hz,1H),5.57(m,1H),5.48(m,1H),5.11(m,1H),5.08(m,1H)；LC/MS370(M+H+)。1-碘二乙酰吗啡(2)：碘代丁二酰亚胺(NIS)(427mg/1.9mmol)被逐步加入溶于0.05MH2SO4(15mL)的1溶液(460mg/1.25mmol)，在逐步加入NIS(93mg/0.4mmol)前，生成的溶液于室温搅拌3小时。然后反应于室温搅拌3小时，这段时间后，LC/MS指示反应结束。然后反应被转移到含有30毫升乙酸乙酯的分液漏斗中，反应容器用乙酸乙酯彻底清洗。接着加入饱和的碳酸氢钠(20mL)，晃动分液漏斗。分层，水相用乙酸乙酯(2x15mL)萃取。混合的有机相用2％的亚硫酸氢钠(2x10mL)和盐水(1x10ml)清洗，用硫酸镁干燥，减压去除溶剂。粗产物用ISCO(24g柱,溶于CH2Cl2的0-10％的甲醇)纯化产生黄色固体纯产物(618mg/94％产出率).1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.27(s,1H),5.53(app.q,2H),5.14(m,1H),5.06(d,J＝6.5Hz,1H)；LC/MS496(M+H+)。无水DMF(25mL)被加入含有2(1.19g/2.4mmol)的小瓶，溶液用氩气喷雾5分钟，然后添加双(三苯基膦)二氯化钯(II)(Pd(PPh3)2Cl2)(0.17g/0.24mmol)、丙烯酸叔丁酯(1.7mL/11.7mmol)和NEt3(1.3mL/9.4mmol)。生成的溶液于90℃加热6小时，然后冷却至室温。加入乙酸乙酯(50mL)，溶液被转移到分液漏斗中。有机相用饱和的碳酸氢钠(1x15mL)水溶液清洗，水层用乙酸乙酯(2x15mL)反萃取。混合的有机相用盐水(1x15mL)清洗，硫酸镁干燥，减压去除溶剂。粗产物用ISCO(24g柱,溶于CH2Cl2中的0-10％的甲醇)纯化获得黄色固体为烯醇3(795mg/67％产出率).1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.62(d,J＝16Hz,1H),7.35(s,1H),6.27(d,J＝16Hz,1H),5.52(app.q,2H),5.14(m,1H),5.10(d,J＝7Hz,1H),1.47(s,9H)；LC/MS496(M+H+)。烯醇3(828mg/1.67mmol)溶于甲醇(12mL,Sigma-Aldrich,无水)，接着加入镁屑(280mg/11.5mmol)，获得的溶液于室温搅拌2小时，这段时间后所有的镁溶解。另外添加镁屑(50mg/2.1mmol)，反应被搅拌2小时。然后减压去除溶剂产生黑褐色固体，该固体溶于10毫升CHCl3(有必要用超声助溶)，溶液被转移到500毫升的分液漏斗中。反应瓶用CHCl3(3x10mL)清洗，20毫升CHCl3被加入分液漏斗中，然后加入15毫升盐水。一旦加入盐水后形成乳液。另外添加30毫升CHCl3到漏斗中，通过排出有机相到1升的锥形烧瓶中，悬浮液被分开。剩余的水层用CHCl3(6x35mL)萃取，混合的有机相通过与37克硫酸钠一起过夜搅拌干燥。过夜搅拌后，有机相变灰暗。溶液用硅藻土过滤。硅藻土用CHCl3(3x40mL)洗涤，溶剂被旋转蒸发获得非晶状固体4(230mg/33％产出率)，该固体不经进一步纯化即在下一步骤中被使用。LC/MS414(M+H+)。二甲基氧磷氯化物被逐步加入到一个烘干的250毫升的圆底烧瓶中，接着加入吡啶(无水，5毫升)，生成的溶液在逐步加入四唑(16mL，质量百分比为3％，溶于CH3CN)前冰浴30分钟冷却至0℃。生成的溶液在逐步加入相同温度的溶于吡啶(无水，5毫升)的二醇(即未加工的镁的还原材料4)溶液前于0℃搅拌10分钟。溶液于0℃搅拌10分钟，接着去除冰浴，加热至室温2小时。这段时间后，LC/MS指示反应结束，只有大多数二氧磷基(diphosphinyl)产物被观察到。然后减压去除吡啶溶剂(存在吡啶残留)。去除大多数吡啶后，加入30毫升饱和的碳酸氢钠，接着加入15毫升甲醇。生成的溶液于室温搅拌48小时。溶液被转移到250毫升的分液漏斗中，反应烧瓶用CH2Cl2(2x15mL)清洗。20毫升CH2Cl2被加入分液漏斗中，接着加入10毫升盐水。轻柔的转动漏斗，有机相被分离出来。水层用CH2Cl2(3x20mL)萃取，混合的有机相用硫酸镁干燥，减压去除溶剂，产物用24克硅胶柱(100％CH2Cl2至80％CH2Cl2:20％CH2Cl2:MeOH:浓缩的NH4OH(8:2:0.001)通过ISCO纯化获得5(176mg/65％来自粗提物4).1HNMR(500MHz,DMSOD6)8.81(s,1H),6.32(s,1H),5.55(d,J＝10Hz,1H),5.38(d,J＝10Hz,1H),4.83(m,1H),4.77(d,J＝5Hz,1H),1.55-1.44(dd,J＝15,40Hz,6H),1.37(s,9H)；LC/MS491(M+H+)。添加TFA:CH2Cl2(3mL:1mL)后，叔丁酯5(171mg/0.35mmol)被加入CH2Cl2(3mL)中。生成的溶液于室温搅拌2小时，接着减压去除溶剂。然后残留物抽真空2小时。抽真空后，加入1.5毫升CH2Cl2，然后加入溶于乙醚(450uL)的盐酸。溶剂被旋转蒸发，获得的固体与CH2Cl2(1x3mL)和CH3CN(2x3mL)一起旋转蒸发，然后过夜抽真空获得灰白色固体6(159mg/99％产出率).1HNMR(500MHz,DMSOD6)9.10(s,1H),6.44(s,1H),5.69(d,J＝10Hz,1H),5.42(d,J＝10Hz,1H),4.95(d,J＝10Hz,1H),4.86(m,1H),1.57-1.46(dd,J＝15,40Hz,6H)；31PNMR(125MHz,CD3OD)60.47；LC/MS434(M+H+of游离碱)。二氢吗啡酮盐酸(469mg/1.5mmol)被悬浮在1,2-二氯乙烷(无水，12mL)中，然后被加入装有磁转子的烘干的烧瓶中。向生成的悬浮液中加入卞胺(192L/1.8mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(sodiumtriacetoxyborohydride)(592mg/2.8mmol)。生成的悬浮液在氩气下过夜搅拌。然后悬浮液被转移到分液漏斗中，反应瓶用CH2Cl2(3x10mL)清洗。饱和的碳酸氢钠(10mL)被加入分液漏斗中，晃动内容物。分层，水层用CH2Cl2(3x10mL)萃取。混合的有机相用盐水(1x5mL)清洗，然后用硫酸镁干燥。过滤去除硫酸镁。减压去除溶剂获得粗产物，粗产物通过ISCO(12g柱子,0-10％溶于CH2Cl2的甲醇)纯化获得7(484mg/88％).1HNMR(500MHz,DMSOD6)8.8(s,1H),6.54(d,J＝7.5Hz),6.44(d,J＝8.0Hz,1H),4.67(d,J＝4.1Hz,1H),3.78(m,2H)；LC/MS377(M+H+)。氩气鼓吹排气10分钟后，苄基保护胺8(508mg/1.35mmol)被溶于甲醇(10mL)。然后加入Pd/C(102mg)和甲酸铵(483mg/7.7mmol)，获得的溶液于70℃搅拌1.5小时。然后用硅藻土过滤溶液，减压去除溶剂。生成的粗产物过夜抽真空。粗产物不经过继续纯化即在下一步骤被分析使用。室温加入无水醋酸(433L/4.58mmol)和NEt3(979L/7.0mmol)后，胺8在氩气下被溶于CH2Cl2(无水,20mL)。获得的溶液在氩气下室温过夜搅拌。搅拌后，反应被转移到分液漏斗中，反应烧瓶用CH2Cl2(3x10mL)清洗。另外25毫升CH2Cl2被加入分液漏斗中，然后加入15毫升5％的无水碳酸氢钠。晃动漏斗，分层。水层用CH2Cl2(2x25mL)萃取。然后混合的有机相用水和盐水(1x10mL每一次)洗涤，并用硫酸镁干燥。接着过滤有机相，减压去除溶剂。获得的固体通过ISCO(0至10％甲醇含有0.1％浓缩的NH4OH,24g柱子)纯化获得白色固体纯产物(595mg/80％).1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.30(d,J＝7.5Hz,1H),6.84(d,J＝8.0Hz,1H),6.67(d,J＝8.0Hz,1H),4.63(d,J＝4.0Hz,1H),3.94(m,1H)；LC/MS371(M+H+)。逐步加入NIS(230mg/1.02mmol)后，6-乙酰胺9溶于35毫升100mMTFA水溶液中，获得的溶液于室温搅拌2小时。搅拌后，另外添加NIS(50mg/0.22mmol)，溶液于室温搅拌2小时，然后反应被转移到分液漏斗中，加入50毫升CH2Cl2，然后加入5％碳酸氢钠水溶液。晃动漏斗，分层。然后水层用CH2Cl2(3x25mL)萃取，混合的有机相用2％亚硫酸氢钠(2x10mL)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，然后过滤，减压去除溶剂产生粗产物。粗产物通过ISCO纯化(24g柱子,溶于CH2Cl2的0-10％的甲醇)获得黄色固体10(396mg/81％产出率).1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.39(d,J＝7.5Hz,1H),7.35(s,1H),4.66(d,J＝4.0Hz,1H),3.97(m,1H)；LC/MS497(M+H+)。11毫升无水DMF被加入含有碘化物10(380mg/0.76mmol)的瓶中，溶液在加入双(三苯基膦)二氯化钯(II)(Pd(PPh3)2Cl2)(54mg/0.08mmol)、叔丁基丙烯酸(0.53mL/3.65mmol)和NEt3(0.42mL/3.0mmol)前用氩气喷雾5分钟。获得的溶液于90℃加热6小时，然后冷却至室温。然后反应被转移到分液漏斗中，反应瓶用CHCl3(10，mL)清洗。另外加入20毫升CHCl3到分液漏斗中，然后加入5％的碳酸氢钠(10mL)晃动漏斗，分层。水相用CHCl3(2x15mL)萃取，混合的有机相用硫酸镁干燥、过滤和减压去除溶剂前用盐水(1x10mL)清洗。粗产物通过ISCO(24g柱子,0至10％甲醇溶于CH2Cl2)获得橘黄色泡沫11(357mg/92％).1HNMR(500MHz,DMSOD6)7.67(d,J＝15.0Hz,1H),7.45(s,1H),7.40(d,J＝5Hz,1H),6.30(d,J＝15.0Hz,1H),4.70(d,J＝5Hz,1H),3.98(m,1H),1.47(s,9H)；LC/MS498(M+H+).在40毫升汤姆森瓶中，烯醇11(217mg/0.44mmol)在氩气下被溶解在11毫升无水甲醇中，接着逐步加入镁屑(108mg/4.44mmol,130℃烘干2小时,然后在吸湿器中冷却)。生成的溶液在氩气条件下室温搅拌5小时，再加入镁屑(20mg/0.08mmol)，然后于室温搅拌2小时。这段时间后，减压去除溶剂，接着加入CHCl3(10mL)和盐水(10mL)。生成的乳液用砂过滤，首先用CHCl3(50mL)洗涤，然后用CHCl3:MeOH(6:4,200mL)洗涤。滤液被放置到分液漏斗中，水相和有机相被分离开来。水相用CHCl3(2x15mL)萃取，混合的有机相用硫酸镁干燥，过滤，减压去除溶剂。粗产物通过ISCO(0-10％甲醇+CH2Cl2中0.1％浓缩的氨水)纯化获得12。1HNMR(500MHz,DMSOD6)8.95(s,1H),7.50(d,J＝7.5Hz,1H),6.50(s,1H),4.57(m,1H),3.94(m,1H),1.36(s,9H)；LC/MS457(M+H+)。CH2Cl2(6mL)被加入酯12(200mg/0.44mmol)中。加入TFA:CH2Cl2(3mL:1.5mL)溶液，对生成的悬浮液进行超声处理，加入后5分钟悬浮液变灰暗随后变均匀。然后灰暗的溶液于室温搅拌1.5小时。减压去除溶剂，残留物被抽真空4小时。加入溶于乙醚的盐酸(1M溶液,550uL)后，添加2毫升CH2Cl2到残留物中。减压去除溶剂，残留物用CH2Cl2(2x5mL)旋转蒸发。产物13不进一步纯化即被分析使用。1HNMR(500MHz,DMSOD6)9.12(s,1H),7.52(d,J＝7.5Hz,1H),6.55(s,1H),4.63(d,J＝4.0Hz,1H),3.94(m,1H)；LC/MS401(M+H+of游离碱)。向溶于2毫升无水CH2Cl2的粗制二醇4(13mg/0.031mmol)溶液中加入无水醋酸(21μL/0.21mmol),NEt3(17μL/0.12mmol)和DMAP(1个晶粒)，生成的溶液于室温过夜搅拌。然后在溶液中倒入10毫升乙酸乙酯，有机相用饱和的碳酸氢钠和盐水(1x5mL每次)清洗。有机相用硫酸镁干燥、过滤，减压去除溶剂。粗产物通过预制制TLC(9:1CHCl3:MeOH)纯化获得非晶状固体14(4mg/20％产出率).1HNMR(500MHz,DMSOD6)6.58(s,1H),5.49(app.q,2H),5.09(m,1H),4.99(d,J＝6.5Hz,1H),1.35(s,9H)；LC/MS498(M+H+)。逐步加入羟胺(35mg/0.50mmol)后，二醋酸盐14(75mg/0.17mmol)被加入50mMNaPi,pH7.5(2mL):MeOH(2mL)的溶液中。减压去除甲醇后，获得溶液于室温搅拌4小时。剩余的水溶液用乙酸乙酯(3x8mL)萃取，混合的有机相用盐水(1x5mL)清洗，硫酸镁干燥，减压去除溶剂。生成的溶液通过预制TLC(9:1CHCl3:MeOH)纯化获得白色固体15(67mg/85％)。1HNMR(500MHz,DMSOD6)9.01(s,1H),6.38(s,1H),5.59(d,J＝9Hz,1H),5.46(d,J＝10Hz,1H),5.12(m,1H),4.98(d,J＝5Hz,1H)；LC/MS456(M+H+)。加入预先混合的1.5mL的CH2Cl2:1.5mLtrifluoroaceticacid(TFA)溶液后，6-乙酰原材料(58mg/0.13mmol)被溶于1.5毫升CH2Cl2中。生成的溶液于室温搅拌1小时。搅拌后减压去除溶剂，剩余的残留物过夜抽真空。产物16不进一步纯化即在下一步骤中使用(粗产出率:75mg/120％).LC/MS400(M+H+游离碱)。向溶于CH2Cl2:DMF(2mL:0.8mL)中的羧酸16(8mg/0.020mmol)溶液中加入胱胺盐酸(2.3mg/0.01mmol),HATU(10mg/0.024mmol)和DIPEA(14μL/0.08mmol)。对混合液进行超声处理，直到所有的固体溶解，然后室温搅拌过夜。这段时间后，减压去除溶剂，生成的残留物抽真空4小时去除残留的DMF。生成的残留物用预制的TLC(iPrOH:NH4OH:H2O10:2:1)纯化获得白色固体17(8mg/86％产出率).1HNMR(500MHz,DMSOD6)9.10(s,1H),8.03(t,J＝5Hz,1H),6.40(s,1H),5.64(d,J＝10Hz,1H),5.47(d,J＝9.5Hz,1H),5.15(m,1H),5.03(d,J＝6Hz,1H),2.68(t,J＝9.5Hz,2H),2.41(t,J＝7Hz,2H)；LC/MS913(M–H)。室温加入6毫升甲苯，碳酸钾(182mg/1.84mmol)和三氯乙基氯甲酸酯(0.36mL/2.64mmol)后，二乙酰吗啡(1,242mg/0.66mmol)被加入装有磁转子的烘干的烧瓶中。然后生成的悬浮液于120℃回流20小时。这段时间之后，LC/MS指示原材料有剩余。溶液冷却至室温，另外加入三氯乙基氯甲酸酯(trichloroethylchloroformate)(0.20mL/1.47mmol)，溶液于120℃回流8小时。这段时间后，如LC/MS监测的那样反应结束。然后过滤去除碳酸钾，减压去除甲苯。向生成的残留物中加入THF(0.20mL)和90％醋酸(0.105mL)，悬浮液于室温搅拌6小时，这段时间之后，如LC/MS监测的那样反应结束。溶液用移液器从大多数的固体锌中分离出来，用粗滤器滤纸过滤到分页漏斗中，滤纸用异丙醇(5mL)、CHCl3(40mL)和水(20mL)清洗。水层用氯化钠饱和，然后逐滴加入50％NH2OH水溶液直到溶液的pH达到约7(pH试纸)。然后定期晃动漏斗促进18被萃取到有机相中。然后分离CHCl3，用50％NH2OH水溶液调整溶液的pH约为9前，加入一份新的CHCl3(20mL)。在定期调整pH的过程中，晃动分液漏斗。分离有机相，生成的水溶液用CHCl3(3x15mL)萃取。混合的有机层。用硫酸镁干燥，减压去除溶剂产生的粗产物为黄色油(233mg/100％粗产出率)；LC/MS356(M+H+)。粗产物不进一步纯化即在下一步骤中使用。诺帝乙酰吗啡(Nordiacetylmorphine)(18)(65mg/0.18mmol)溶于无水CH2Cl2(3mL)中，溶液冷却至0℃，然后在0℃加入DIPEA(0.063mL/0.36mmol)和3-氯丙烷磺酰氯(0.024mL/0.20mmol)。反应在0℃搅拌1小时，然后加热至室温过夜搅拌。加入水(4mL)和乙酸乙酯(10mL)。分层，水层用乙酸乙酯(2x5mL)萃取。混合的有机层用水(1x5mL)和盐水(1x5mL)洗涤，硫酸镁干燥，减压去除溶剂。粗产物通过预制的TLC(1:2已烷:乙酸乙酯)纯化获得非晶形固体19(40mg/44％产出率).1HNMR(500MHz,CDCl3)6.82(d,J＝8.2Hz,1H),6.62(d,J＝8.2Hz,1H),5.71(d,J＝11.4Hz,1H),5.42(d,J＝10.3Hz,1H),3.71(t,J＝5.9Hz,2H),2.28(s,3H),2.14(s,3H)；LC/MS495(M-H).加入硫代乙酸盐(148mg/1.30mmol)后，氯化物19(128mg/0.26mmol)溶解到无水DMF(4mL)中，溶液于90℃加热5小时。反应冷却到室温，加入乙酸乙酯(15mL)，溶液被转移到分液漏斗中。有机相用H2O(1x5mL)和盐水(2x5mL)洗涤，硫酸镁干燥，减压去除溶剂产生粗产物，该粗产物用ISCO(20:1己烷:乙酸乙酯至5:1己烷:乙酸乙酯)纯化获得非晶形固体硫代乙酸盐20(85mg/62％产出率).1HNMR(500MHz,CDCl3)6.81(d,J＝9.6Hz,1H),6.61(d,J＝8.3Hz,1H),5.71(d,J＝10.0Hz,1H),5.42(d,J＝10.1Hz,1H),3.06(t,J＝7.1Hz,2H),2.36(s,3H),2.28(s,3H)；LC/MS534(M-H)。加入100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)后，硫代乙酸盐20(29mg/0.054mmol)被溶于CH3OH/THF(2mL:0.6mL)。然后加入15毫克盐水羟胺，生成的溶液于室温搅拌过夜，瓶中的内容物被转移到分液漏斗中，加入乙酸乙酯(10mL)和水(5mL)，晃动漏斗。分层，水层用乙酸乙酯(1x5mL)萃取。混合的有机层用盐水(1x5mL)洗涤，硫酸镁干燥，减压去除溶剂。粗产物用预制的HPLC纯化获得的纯产物为21的二硫化物衍生物(LC/MS)(2.6mg/10％产出率)。LC/MS452(M-H).通过使二硫化物溶解在DMSO:磷酸钠缓冲液(pH7.5)(400uLDMSO:440uL50mMNaPi)中获得游离的硫醇21，然后逐渐加入TCEP(2.2mg/0.008mmol)。生成的溶液于室温搅拌30分钟获得21。LC/MS452(M-H).二乙酰吗啡1(10mg,0.03mmol)溶解在1毫升乙腈中，向混合物中加入2-溴代-N-乙酰-HCTL(16mg,0.067mmol)。然后反应混合物加热至60℃过夜。然后反应混合物冷却至室温。混合物用硅胶薄层色谱板纯化，用10％MeOH/DCM洗脱获得3.6mg(22％)的白色粉末22.1HNMR(DMSO-d6)δ9.14(1H,d),6.88(1H,d),6.71(1H,d),5.65(1H,d),5.53(1H,d)；LC/MS528(M+)。实施例子2。轭合物6-AM衍生物23具有一个连接基团，该连接基团包含能与马来酰亚胺或乙酰卤素或乙酰氨基卤素基团起反应的巯基基团。6-AM衍生物23被用于制备如下文所述连接到乳胶固相和KLH上的轭合物。在含1-10毫克BSA的1-10％固体每升乳胶悬浮液的25mM柠檬酸缓冲液中，pH约为4，牛血清白蛋白(“BSA”)和聚丙乙烯乳胶颗粒(界面动力学(InterfacialDynamics))于25℃孵育30分钟。接着溶液被150mM磷酸钾/30mM硼酸钾调整为约中性pH，于25℃再孵育2小时。悬浮液通过离心然后用约中性pH的50mM磷酸钾/10mM硼酸钾/150mM氯化钠重悬浮清洗3次。美国专利6887952所描述的5-500毫克/毫升溶于去离子水中的N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺官能聚(乙二醇)的交联剂被加入含1-10％固体的BSA-乳胶粒子中。该交联剂和BSA-乳胶粒子在室温下孵育2小时。过量的交联剂通过离心并重悬在PBS的目前为马来酰亚胺-功官能化BSA-胶乳颗粒中去除。衍生物(4-8毫克)被溶解在0.8毫升DMF水溶液(70:30V/V)和200μL1M氢氧化钾中，室温孵育10分钟。然后用磷酸盐/盐酸缓冲液中和过量的碱至PH值7。存在0.1mMEDTA的情况下，马来酰亚胺-官能化BSA乳胶粒子被添加到包含6-AM衍生物的溶液中，混合物于室温下孵育过夜。加入氢氧化钾使pH值保持在7左右。2个步骤后反应被停止。首先加入0.2mMβ-巯基乙醇，在室温下培养30分钟，然后加入6mMN-(羟乙基)马来酰亚胺并在室温下再孵育30分钟。6-AM衍生物轭合乳胶粒子通过离心并用PBS重悬浮被纯化。钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH，Calbiochem#374817，于50mg/mL甘油中)通过一个40mlGH25柱子去除甘油，该柱子用0.1M磷酸钾，0.1M硼酸，0.15M氯化钠缓冲液，pH7.5平衡。加入1.5摩尔倍过量的N-乙基马来酰亚胺，混合物于室温下孵育30分钟。涡旋时加入来自蒸馏水中50mM母液的200摩尔倍过量的硫代-SMCC(皮尔斯#22322)。涡流持续30秒，接着室温下孵育10分钟。涡旋时加入来自乙腈中80mM母液的100摩尔倍过量的SMCC(皮尔斯#22360)。加入1MKOH使pH值保持在7.2和7.4之间。将混合物在室温下搅拌90分钟。90分钟后孵育，KLH-SMCC用GH25柱凝胶过滤纯化，柱子用0.1M磷酸钾，0.02M硼酸盐，0.15M氯化钠缓冲液，pH值7.0平衡。6-AM衍生物(4-8毫克)被溶解在0.8毫升DMF水溶液(70:30V/V)和200μL1MKOH中，室温孵育10分钟。用磷酸盐/盐酸缓冲液中和过量的碱至PH值为7。然后，2摩尔倍过量的衍生物(基于某一批次KLH-SMCC中SMCC的浓度)被添加到KLH-SMCC中，混合物在室温下搅拌90分钟。结合物在PBS中被详尽的透析纯化。例3.抗体用KLH共轭衍生物免疫后，如美国专利6057098所述构建噬菌体抗体库并用轭合生物素的24和磁性链霉亲和素乳胶富集。抗体噬菌体文库用24筛选，被转化到一个质粒表达载体中并电转化进入细菌细胞。用25，26和27同时进行阴性选择来去掉与不想要的表位连接的抗体。来自每个抗体库的细菌细胞在琼脂上划线产生菌落。这些克隆，编码一些单克隆抗体，用于接种96孔板中单孔中的培养基。液体培养物被过夜培养，并用来产生冻存细胞母液。这些冻存细胞母液被用来复制96孔板培养物，接着是微克数量级的可溶状态的单克隆抗体的表达和纯化。用选定的一种抗体与6-AM的进行竞争性测定，该抗体与临床相关浓度的吗啡、吗啡-3葡糖苷酸或吗啡-6-葡糖苷酸表现为无交叉反应性。例4.交叉反应性如例3所述的抗体评价对海洛因代谢物和常见结构相关的阿片类药物的交叉反应性。使用例3的抗体构建免疫测定法，配制其在竞争模式免疫方式中进行，在竞争免疫测定中，本发明的类似化合物与其他相关化合物比较对6-单乙酰吗啡的交叉反应性。标记的单乙酰吗啡类似物被用作可检测种类。多份10ng/mL标记的6-单乙酰吗啡，在有本发明抗体竞争性化合物存在的情况下一起培养，竞争化合物的互作程度是由检测信号的减少量决定的，通过与仅存在6-单乙酰吗啡的情况相比。结果如表1所示。数据说明抗体对单乙酰吗啡的高特异性。当采用的很多竞争性种类比单乙酰吗啡过量100000至1倍时，没有检测到交叉反应性；当6-单乙酰可待因与6-单乙酰吗啡为30:1过量时仅有3％的交叉反应性。数据清晰的说明本发明抗体对6-单乙酰吗啡的特异性。图7中显示的数据表明了几种6-单乙酰吗啡轭合物的行为，当与本发明的抗体共培养时，在6-单乙酰吗啡的浓度增加时，信号的减少说明6-单乙酰吗啡轭合物中的抗体已被天然的6-单乙酰吗啡取代。表1.本发明已经详细描述和举例说明使得本领域技术人员可以制作和使用本发明，各种可选方案，修订和改进明显都没有背离本发明的精髓和范围。本领域的技术人员很容易理解，本发明很适合于执行目标任务，并获得所提及的结果和优点，以及它们所固有的优点。此处提供的实例是优选实施例的代表，是示例性的，并且不意味着作为本发明的范围限制。那些本领域中熟练的技术人员将会进行一些修改和其他用途。这些修改都包含在本发明的精神中并被定义在权利要求的范围内。对本领域熟练的技术人员来说，在不背离本发明的范围和精神的情况下，对本发明公开的内容进行不同的替换和修改显然是非常容易的。本说明书中所提及的所有专利和出版物均表明本发明涉及的水平是本领域普通技术的水平。所有的专利和出版物均以相同的程度被引用在参考文献中，如同每一个出版物被特别的单独的说明被引用在参考文献中。本发明实例的描述可以在缺乏任何本文没有特别公开的元素或一些元素，限制或一些限制时适当地被实践。因此，举例来说，在每一个实例中，“包括”、“基本上”和“组成”的任何一个术语可以用其他两个术语来替换。本文采用的术语和表达方式是用来描述而不是限制，并不意味着使用这样的术语和表达式会排除任何所示功能和它们的描述或部分的等同物，可以承认在本发明权利要求的范围内各种修改都是可能的。因此，可以被理解，尽管本发明公开了优选的实施例和可选的功能，此处披露的修改和变化的概念可能会被诉诸于那些本领域熟练的技术人员，并认为这种修改和变化被认为是在本发明的范围内被定义为附加的权利要求。其他实施例在下列权利要求中被陈述。