作为用于靶向癌症治疗的细胞毒性药物递送系统的抗-RON单克隆抗体的制作方法与工艺

发明的技术领域总的来说，本发明涉及单克隆抗体领域，更具体地，涉及作为用于靶向癌症治疗的细胞毒性药物递送系统的抗-RON单克隆抗体。发明背景在不限制本发明的范围的情况下，就RON(recepteurd’originenantais)描述其背景。由于其在90年代早期被发现，RON在癌症生物学中的致病作用已在各种遗传、生化和生物模型中被广泛地研究。来自体外和体内实验的临床前证据已显示，在不同类型的上皮癌中，RON信号传导以可变的水平整合到细胞生长和侵入机制中。此外，特别是以蛋白质过表达和致癌变体的生成为特征的异常RON表达在源自结肠、乳腺和胰腺组织的癌症中起重要作用。异常RON激活调节侵入性细胞的生长并促进恶性肿瘤的发展。鉴于这些发现，通过小分子和治疗性抗体靶向RON信号传导处在深入的研究中，为未来临床验证奠定了基础。目前，已经评价了各种临床前实验。也进行了使用小分子抑制剂和治疗性抗体的临床试验。RON受体酪氨酸激酶是潜在的药物靶点。各种类型的肿瘤，包括乳腺癌和胰腺癌显示异常的RON表达，其特征在于过表达、同工型生成和组成性激活。特异性抗体结合到癌细胞表面上的RON并导致RON内化。该过程对递送用于癌症治疗的细胞毒性药物是有效的。本发明人已经就RON在肿瘤发生中的作用发表文章，即Wang等人，“OncogenesisofRONreceptortyrosinekinase:amoleculartargetformalignantepithelialcancers”，ActaPharmacologicaSinica(2006)27，641–650，其是第一篇指出并且证明使用单克隆抗体以抑制RON和肿瘤发生的RON受体的靶向潜力的出版物。Wang等人还发表了关于RON的作用的稿件，题为“RONReceptorTyrosineKinaseasaTargetforDeliveryofChemodrugsbyAntibodyDirectedPathwayforCancerCellCytotoxicity”，Mol.Pharmaceutics，2010，7(2)，pp.386–397，其中独特的抗-RON抗体与前述包含载药的PEG的脂质体结合使用，其显示体内抗肿瘤发生的作用。在授予Pereira等人的题为“Inhibitionofmacrophage-stimulatingproteinreceptor(RON)andmethodsoftreatmentthereof”的第8,133,489号美国专利中教导了另一种RON靶向分子。简言之，所述公开内容涉及特异性针对巨噬细胞刺激蛋白质受体(MSP-R或RON)的抗体或其片段，包括人抗体，其抑制RON激活。还提供了抑制RON的方法，特别是RON抗体治疗疾病如癌症的用途。Pereira,D.S.等人还发表了“Therapeuticimplicationsofahumanneutralizingantibodytothemacrophage-stimulatingproteinreceptortyrosinekinase(RON),ac-METfamilymember”，CancerResearch，Volume66，Issue18，15September2006，Pages9162-9170。该出版物讨论了抗-RON抗体体内抗肿瘤异种移植的有效性，其中抗-RON抗体通过噬菌体展示制备。Pereira等人还提交了第20090246205号美国公开专利申请，题为“Inhibitionofmacrophage-stimulatingproteinreceptor(ron)”，其涉及用于治疗哺乳动物的肿瘤和其他疾病的方法，包括给予特异性针对巨噬细胞刺激蛋白质受体(“MSP-R”或“RON”)的抗体。据说还公开了抑制RON激活的包括特异性针对RON的抗体或抗体片段，包括人抗体的组合物。Whalen等人提交了题为抗-RON抗体(Anti-RONantibodies)的第20120027773号美国公开专利申请，据说其教导了结合并抑制人RON(Recepteurd'OrigineNantais)激活的单克隆抗体。据说该抗体区域用于治疗与RON的活化相关的某些形式的癌症。Huet等人提交了第20090226442号美国公开专利申请，题为“RONantibodiesandusesthereof”。简言之，据说该申请教导了结合到RON(MST1R)的抗体及其用途。具体地，在癌症的诊断和治疗中，该抗体抑制RON-介导的促存活和肿瘤增殖途径，和其变体、片段及衍生物。还教导了阻断配体MSP结合到RON的能力的抗体，以及该抗体的片段、变体和衍生物。本发明还包括编码以上抗体或其片段、变体或衍生物的多核苷酸，以及包括该多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还包括使用本发明的抗体诊断和治疗癌症的方法。虽然结合RON的抗体是本领域已知的，但仍然需要可以用作治疗剂的改进的RON抗体。发明概述在一个实施方案中，本发明包括结合人RON的分离的单克隆抗体，其包括选自Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4或Zt/f2的单克隆抗体。在一个方面，所述单克隆抗体包括插入到人和人源化框架序列之间的互补决定区(CDR)序列。在另一个方面，所述单克隆抗体包括插入到还包括人种系框架序列的人和人源化框架序列之间的CDR序列。在另一个方面，所述单克隆抗体包括插入到人和人源化框架序列之间的CDR序列，其中所述框架序列在27、30、48、67或78位氨基酸处包括至少一个替换，其中氨基酸编号基于Kabat。在另一个方面，所述单克隆抗体与细胞毒性剂组合，以使抗体靶向RON表达蛋白并且RON-单克隆抗体和细胞毒性剂内化到细胞中。在另一个方面，所述单克隆抗体与细胞毒性剂结合，以使所述抗体靶向RON表达蛋白并且RON-单克隆抗体和细胞毒性剂内化到细胞中。在一个方面，所述氨基酸是SEQIDNO:22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中的至少一个。在一个方面，抗体使SEQIDNO:22、24、26、28、30中的至少一个与SEQIDNO:32、34、36、38和40的中至少一个配对。在一个方面，核酸是SEQIDNO:21、23、25、27、29、21、33、35、37和39中的至少一个。本发明的又一个方面包括分离的核酸，其包括编码单克隆抗体的免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区中的至少一个的核苷酸序列，所述单克隆抗体选自Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4或Zt/f2。在另一个实施方案中，本发明还包括表达载体，所述表达载体包括表达至少一种单克隆抗体的核酸，所述单克隆抗体选自Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4或Zt/f2。又一个实施方案包括杂交瘤细胞，其选自表达结合到人RON的抗体的Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4或Zt/f2杂交瘤细胞。本发明的另一个实施方案包括生产包括免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的方法，所述方法包括：在使宿主细胞表达包括免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使上述杂交瘤细胞生长；和纯化包括免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽。本发明的另一个实施方案包括生产结合人RON的抗体或该抗体的抗原结合片段的方法，所述方法包括：在使宿主细胞表达包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使权利要求9的宿主细胞生长，从而生产抗体或该抗体的抗原结合片段；和纯化抗体或该抗体的抗原结合片段。本发明的另一个实施方案包括结合人RON的分离的抗体，其包括与选自单克隆抗体的重链和轻链的序列具有至少95％的同源性的免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述单克隆抗体选自Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4或Zt/f2。在一个方面，免疫球蛋白重链可变区包括选自Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4或Zt/f2的单克隆抗体的CDRH1；CDRH2；和CDRH3；和免疫球蛋白轻链可变区包括：选自Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4或Zt/f2的单克隆抗体的CDRL1；CDRL2；和CDRL3。在另一个方面，CDR序列插入到人和人源化框架序列之间。在另一个方面，CDR序列插入到还包括人种系框架序列的人和人源化框架序列之间。在另一个方面，CDR序列插入到人和人源化框架序列之间，其中所述框架序列在27、30、48、67或78位氨基酸处包括至少一个替换，其中氨基酸编号基于Kabat。本发明的又一个实施方案包括抑制或减少肿瘤细胞增殖的方法，其包括将所述细胞暴露到有效量的权利要求1所述的抗体以抑制或减少肿瘤细胞的增殖。在另一个实施方案中，本发明包括抑制或减少哺乳动物中的肿瘤生长的方法，所述方法包括将哺乳动物暴露到有效量的权利要求1所述的抗体以抑制或减少肿瘤的增殖。另一个实施方案包括进行临床试验以评价候选药物的方法，所述候选药物被认为在治疗与RON过表达、低表达、激酶活性下调、RON转录本降解或RON降解中的至少一种相关的疾病病症中有用，所述方法包括：a)测量来自一组患者的疑似具有与RON有关的疾病的组织的RON；b)将候选药物给予第一亚组的患者，以及将安慰剂给予第二亚组的患者；c)在给予候选药物或安慰剂后重复步骤a)；和d)确定与第二亚组的患者中发生的任何减少相比，候选药物是否在统计学上显著地减少具有RON-相关的疾病病症的细胞的数量，其中在统计学上显著的减少表明候选药物在治疗所述疾病状态中有用。在一个方面，候选药物是包括选自Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4或Zt/f2的重链或轻链中的至少一种的抗体。本发明的另一个实施方案包括结合人RON的分离的抗体，其包括与选自以下的氨基酸序列具有至少95％的同源性的免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区：重链：SEQIDNO.:2或4；和轻链：SEQIDNO.:6或8。在一个方面，免疫球蛋白重链可变区包括：CDRH1，其包括选自SEQIDNO.:9或15的氨基酸序列；CDRH2，其包括SEQIDNO.:10或16的氨基酸序列；CDRH3，其包括SEQIDNO.:11或17的氨基酸序列；和免疫球蛋白轻链可变区包括：CDRL1，其包括SEQIDNO.:12或18的氨基酸序列；CDRL2，其包括SEQIDNO.:13或19的氨基酸序列；和CDRL3，其包括SEQIDNO.:14或20的氨基酸序列。在另一个方面，CDR序列插入到人和人源化框架序列之间。在另一个方面，CDR序列插入到还包括人种系框架序列的人和人源化框架序列之间。在另一个方面，CDR序列插入到人和人源化框架序列之间，其中所述框架序列在27、30、48、67或78位氨基酸处包括至少一个替换，其中所述氨基酸编号基于Kabat。本发明的另一个实施方案包括分离的核酸，其包括编码以下至少一个的核苷酸序列：免疫球蛋白重链可变区SEQIDNO.:1或3；或轻链可变区SEQIDNO.:5或7。本发明的另一个实施方案包括表达载体，其包括来自以下的核酸：重链可变区SEQIDNO.:1或3；或轻链可变区SEQIDNO.:5或7。本发明的另一个实施方案包括宿主细胞，其包括包含以下的表达载体：重链可变区SEQIDNO.:1或3；或轻链可变区SEQIDNO.:5或7。本发明的另一个实施方案包括生产包括免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的方法，所述方法包括(a)在使宿主细胞表达包括免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使权利要求9的宿主细胞生长；和(b)纯化包括免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽。本发明的另一个实施方案包括生产结合人RON的抗体或该抗体的抗原结合片段的方法，所述方法包括：(a)在使宿主细胞表达包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使权利要求29的宿主细胞生长，从而生产抗体或该抗体的抗原结合片段；和(b)纯化抗体或该抗体的抗原结合片段。本发明的另一个实施方案包括结合人RON的分离的抗体，其包括与选自以下的序列具有至少98％的同源性的免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区：重链：SEQIDNO.:2或4；和轻链：SEQIDNO.:6或8。在一个方面，免疫球蛋白重链可变区包括：CDRH1，其包括选自SEQIDNO.:9或15的氨基酸序列；CDRH2，其包括SEQIDNO.:10或16的氨基酸序列；CDRH3，其包括SEQIDNO.:11或17的氨基酸序列；和免疫球蛋白轻链可变区包括：CDRL1，其包括SEQIDNO.:12或18的氨基酸序列；CDRL2，其包括SEQIDNO.:13或19的氨基酸序列；和CDRL3，其包括SEQIDNO.:14或20的氨基酸序列。在另一个方面，CDR序列插入到人和人源化框架序列之间。在另一个方面，CDR序列插入到还包括人种系框架序列的人和人源化框架序列之间。在另一个方面，CDR序列插入到人和人源化框架序列之间，其中框架序列在27、30、48、67或78位氨基酸处包括至少一个替换，其中所述氨基酸编号基于Kabat。本发明的另一个实施方案包括抑制或减少肿瘤细胞的增殖的方法，其包括将细胞暴露到有效量的权利要求27所述的抗体以抑制或减少肿瘤细胞的增殖。本发明的另一个实施方案包括抑制或减少哺乳动物中的肿瘤生长的方法，所述方法包括将哺乳动物暴露到有效量的权利要求27所述的抗体以抑制或减少肿瘤的增殖。本发明的另一个实施方案包括治疗人类患者的癌症的方法，所述方法包括给予需要其的哺乳动物有效量的权利要求27所述的抗体。本发明的另一个实施方案包括评价候选药物的方法，所述候选药物被认为在治疗与RON过表达、低表达、激酶活性下调、RON转录本降解或RON降解中的至少一种相关的疾病病症中有用，所述方法包括：a)测量来自一组患者的疑似具有与RON有关的疾病的组织的RON；b)将候选药物给予第一亚组的患者，以及将安慰剂给予第二亚组的患者；c)在给予候选药物或安慰剂后重复步骤a)；和d)确定与第二亚组的患者中发生的任何减少相比，候选药物是否在统计学上显著地减少具有RON-相关的疾病病症的细胞的数量，其中在统计学上显著的减少表明候选药物在治疗所述疾病状态中有用。在一个方面，候选药物为包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的抗体，所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区与选自重链：SEQIDNO.:2或4和轻链：SEQIDNO.:6或8的序列具有至少98％的同源性；或候选药物为包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的抗体，所述免疫球蛋白重链可变区包括：CDRH1，其包括选自SEQIDNO.:9或15的氨基酸序列；CDRH2，其包括SEQIDNO.:10或16的氨基酸序列；CDRH3，其包括SEQIDNO.:11或17的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区包括：CDRL1，其包括SEQIDNO.:12或18的氨基酸序列；CDRL2，其包括SEQIDNO.:13或19的氨基酸序列；和CDRL3，其包括SEQIDNO.:14或20的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明包括分离的核酸，其与包括选自以下至少一种的序列的核酸具有至少95％的序列一致性：SEQIDNO:22、24、26、28、30、32、34、36、38和40。在另一个实施方案中，本发明包括宿主细胞，所述宿主细胞包含分离的核酸，所述分离的核酸与包括选自以下至少一种的序列的核酸具有至少95％、96、97、98、99或100％的序列一致性：SEQIDNO:22、24、26、28、30、32、34、36、38和40。在另一个实施方案中，本发明包括表达载体，所述表达载体包含分离的核酸，所述分离的核酸与包括选自以下至少一种的序列的核酸具有至少95％、96、97、98、99或100％的序列一致性：SEQIDNO:22、24、26、28、30、32、34、36、38和40。附图说明为了更加完全地理解本发明的特征和优点，现在参照本发明的详细描述以及附图，其中：图1A至1C显示了抗-RONADCZt/g4-DM1的生成和表征。Zt/g4-DM1结构的示意图：Zt/g4是具有对RONsema结构域(18)特异性的小鼠mAb。DM1通过抗体分子中的赖氨酸残基，借助非还原性硫醚键(SMCC)缀合到Zt/g4。图1B：缀合到Zt/g4的DM1的数量的HIC分析：具有不同数量的DM1(0至8)的个体Zt/g4-DM1被标记为P0至P8。图1C：Zt/g4-DM1的稳定性。将Zt/g4-DM1保持在37℃下30天。显示了使用平均DAR在不同时间点分析的样品。图2A至2F显示了在CRC细胞中通过Zt/g4-DM1的RON内吞作用的结合和诱导。图2A：不同CRC细胞系的RON表达水平：在4℃下在PBS中的五种CRC细胞系(1×106个细胞/ml)与5μg/mlZt/g4孵育60min。同位素匹配的小鼠IgG用作对照。使用如材料和方法中详述的来自DAKO(Carpentaria,CA)的试剂，通过免疫荧光分析定量确定细胞表面RON。图2B：Zt/g4-DM1结合到人CRC细胞系：HCT116、HT29和SW620细胞(1×105个细胞)与5μgZt/g4-DM1或Zt/c1-DM1一起孵育。游离的Zt/g4和Zt/c1用作对照。通过流式细胞分析确定来自单个样品的荧光强度。图2C：细胞表面RON的动态减少：在37℃下，使用5μg/ml的Zt/g4-DM1处理HCT116、HT29和SW620细胞(每个培养皿1×106个细胞)，在不同时间点收集，使用酸缓冲液洗涤以消除细胞表面结合的IgG，然后与1μg/mL的抗-RONmAb2F2一起孵育。使用FITC-偶联的抗-小鼠IgG，通过流式细胞仪分析免疫荧光。来自在4℃下使用Zt/g4-DM1或Zt/c1-DM1处理的细胞的免疫荧光被设定为100％。内化效率计算为达到50％细胞表面RON减少所需的时间。图2D：通过蛋白质印迹分析RON减少：在简化条件下，在8％SDS-PAGE中分离来自使用5μg/ml的Zt/g4或Zt/g4-DM1处理不同时间的细胞的细胞蛋白质(每道50μg)，并转移到膜。通过兔抗-RON抗体接着是增强的化学发光试剂检测RON。再探测相同的膜，肌动蛋白作为负载对照。图2E：RON表达的定量测量：通过密度计分析确定单个RON-β链的强度。内化效率计算为达到50％RON减少所需的时间。图2F：细胞质RON的免疫荧光定位：在4℃或37℃下使用5μg/ml的Zt/g4-DM1或Zt/c1-DM1处理HT29细胞(每室1×105个细胞)6h，接着使用FITC-偶联的抗小鼠IgG处理。在细胞固定后，使用配备有荧光装置的BK70Olympus显微镜检测免疫荧光。LAMP1用作蛋白质的细胞质定位的标志物。DAPI用于将核DNA染色；图3A至3D显示Zt/g4-DM1对CRC细胞周期、存活和死亡的影响。图3A：细胞周期的变化：在37℃下使用5μg/ml的Zt/g4-DM1处理三种CRC细胞系(每培养皿1×106个细胞)不同时间，收集，使用碘化丙啶染色，然后如前所述地通过流式细胞仪分析(32)。图3B：细胞活力的降低：使用不同量的Zt/g4-DM1处理三种CRC细胞系(在96孔板中，每孔5000个细胞，一式三份)24、48和72h。通过MTS分析确定细胞活力。图3C：增加的细胞死亡：使用不同量的Zt/g4-DM1处理细胞72h。在OlympusBK-41倒置显微镜下观察到形态学变化并拍照。提供了显示细胞死亡的图像。图3D：通过台盼蓝拒染法确定细胞死亡百分比。使用GraphPadPrism6软件计算在72h下来自单个组的细胞活力或死亡的IC50值。本文显示的结果来自三个具有类似结果的实验之一；图4A至4C显示了单剂量Zt/g4-DM1对源于CRC细胞的肿瘤的治疗性作用。无胸腺裸鼠(每组五只小鼠)皮下接种5×106HCT116、HT29和SW620细胞，接着通过尾静脉注射20mg/kgZt/g4-DM1。图4A：通过测量平均光子强度来确定来自HT29-luc2或HCT116-luc2细胞的肿瘤生长(左图)。通过测量肿瘤体积来监测SW620来源的肿瘤生长(图4B)(右图)。图4C：提供了在第16天使用光子发射或卡尺测量的肿瘤图像。从最小到最大的比例设置为每秒300至35,000个光子。抑制百分比由平均光子发射(对于HT29和HCT116细胞)或肿瘤体积(对于SW620细胞)计算。图4D：在第28天称量来自不同组的单个肿瘤。抑制百分比通过下式计算：(来自Zt/g4-DM1处理过的组的平均肿瘤重量/来自对照小鼠的平均肿瘤重量)×100％；图5A至5F显示了不同剂量的Zt/g4-DM1对肿瘤生长和RON表达的评价。图5A：在HT29细胞诱导的肿瘤中测试多剂量的Zt/g4-DM1对肿瘤生长的影响。每隔四天使用不同剂量的Zt/g4-DM1处理荷瘤小鼠，总共注射五次通过平均生物发光强度确定肿瘤生长。图5B：在第31天使用GraphPadPrism6软件计算基于来自单个组的平均生物发光强度的IC50值。图5C：显示了在第31天来自每个组的单个肿瘤的生物发光图像。抑制百分比由平均光子发射计算。从最小到最大的比色刻度尺设置为每秒300至35,000个光子。图5D：收集来自不同组的单个肿瘤并分别在第31、35和43天称量。如图4C详述计算抑制百分比。图5E：在第31天处理来自对照和被15mg/kgZt/g4-DM1-处理的小鼠的HT29细胞来源的异种移植肿瘤的样品，用于组织学检查。通过H&E染色的分析显示在Zt/g4-DM1处理的肿瘤中细胞在不同的区域中死亡，而在对照样品中没有。图5F：来自对照和15mg/kgZt/g4-DM1-处理的小鼠的肿瘤样品中的RON表达的蛋白质印迹分析。进行密度测定分析以确定RON表达的水平；图6A至6C显示Zt/g4-DM1在体内的毒性。在Zt/g4-DM1处理期间，每隔四天测量体重。图6A：通过每隔四天以1、3、7、10、15mg/kg给予Zt/g4-DM1，总共注射5次确定多剂量的Zt/g4-DM1对小鼠体重的影响。称量小鼠并监测总共31天。图6B：使用负荷HT29、HCT116或SW620来源的肿瘤的小鼠确定单剂量的Zt/g4在20mg/kg下对小鼠体重的影响。监测体重直到28天。图6C：通过以20、40和60mg/kg对Balb/c小鼠尾静脉注射来分析高剂量的Zt/G4-DM对小鼠体重的影响。小鼠在第21天被进行安乐死。在所有情况下，在Zt/g4-DM1注射前小鼠的平均体重为19.8±3.6克(每组5只小鼠)并设定为100％；图7显示了本发明的单克隆抗体的用途的示意图；图8是显示在胰腺癌细胞系中Zt/g4-DM1诱导细胞表面RON减少的图表；图9显示在胰腺癌细胞中Zt/g4-DM1-诱导细胞内RON定位；图10A至11D是显示Zt/g4-DM1对胰腺癌细胞周期、活力和细胞凋亡死亡的影响的图表；图11A至11C是显示Zt/g4-DM1与不同化疗剂组合的协同活性的图表；图11D包括显示Zt/g4-MMAE与吉西他滨组合的协同活性和人胰腺癌细胞的活力的图表；和图11E显示的图表示出了Zt/g4-MMAE与奥沙利铂组合的协同活性和人胰腺癌细胞的活力；图12是显示根据等效线图法的Zt/g4-DM1和化疗剂之间的协同作用的图表；和图13是显示单剂量的Zt/g4-DM1对人PDAC的异种移植物生长的治疗性作用的图表。发明描述虽然在下文详细讨论了本发明的各种实施方案的形成和使用，但应理解的是，本发明提供可以在多处具体上下文中体现的许多可适用的发明构思。本文讨论的具体实施方案仅说明形成和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。为了便于理解本发明，下文定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明相关领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一(a)”、“一(an)”、“该(the)”不意在仅指代单数实体，而是包括可以用具体实例来说明的一大类。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但其使用不限制本发明，除了在权利要求中所概述的。本发明人已经开发了许多在临床前模型中显示生物和治疗作用的抗-RONmAb。与化学剂缀合的抗-RONmAb有效递送细胞毒性药物以靶向杀死癌细胞。知晓MSP-RON信号传导系统可以提供对RON-介导的肿瘤发病机理的理解，而且还导致新型策略的发展，以靶向RON或以另外的方式使用RON用于有效的癌症治疗。本文公开的抗体可以用于治疗各种形式的癌症，例如，非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和头颈癌。将癌细胞暴露到治疗有效量的抗体以抑制或减少癌细胞的增殖。在一些实施方案中，抗体抑制至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的癌细胞增殖。关于核苷酸的术语“基本上如SEQIDNO.(#)所示的序列”、“类似于……的序列”、“核苷酸序列”和类似术语是指基本上对应于本文如SEQIDNO.:1所确定的序列的任何部分的序列。这些术语是指合成以及天然来源的分子，并且包括具有生物、免疫、实验或其他功能等同活性的序列，例如有关通过核酸片段杂交或编码所有或部分抗-RON抗体的能力的。当然，这些术语意在包括在这样的序列中由其线性顺序规定的信息。术语“同源性”是指两个核酸互补的程度。可以有部分或完全同源性。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的序列杂交到靶核酸的序列，并且使用功能性术语“基本上同源”来指代。杂交度或杂交程度可以使用杂交或其他分析(如竞争性PCR分析)检查，并且如本领域技术人员已知的，意在包括甚至在低严格度下的具体相互作用。“与SEQIDNO:#的抗-RON抗体基本上同源的”寡核苷酸序列在本文中被定义为当与具有100bp或更大的长度的序列相比时，显示与SEQIDNO:#的序列的一致性大于或等于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的寡核苷酸序列。一般地，将使用保守氨基酸替换将序列调整在所列举的百分比内。保守氨基酸替换是本领域熟知的。术语“基因”用来指功能性蛋白质、多肽或肽的编码单元。如本领域技术人员将理解的，该功能术语包括至少部分基因组序列、cDNA序列，或其片段或组合，以及基因产物，包括可能被人工改变的那些。纯化的基因、核酸、蛋白质等用来指被鉴定并与其通常相关的至少一种混杂的(contaminating)核酸或蛋白质分离的这些实体。术语“载体”是指将一个或多个DNA片段从一个细胞转移到另一个的一个或多个核酸分子。载体可以进一步被定义为设计成传播具体序列的载体，或被定义为包括操作性地连接到具体序列的启动子的表达载体，或设计成导致这样的启动子被引入的载体。载体可以以独立于宿主细胞染色体的状态存在，或可以整合到宿主细胞染色体中。术语“宿主细胞”、“重组细胞”或“重组宿主”是指已经被工程化以包含核酸片段或改变的片段的细胞，不论是古菌、原核或真核细胞。因此，工程化的或重组细胞与不包含重组引入的基因的天然存在的细胞有区别。术语“融合蛋白”是指由包含至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂交蛋白质。例如，融合蛋白可以包括与结合亲和基质的多肽融合的第一和第二多肽的至少部分。术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体制剂，以及含有显示亲本抗体分子的免疫结合特性的杂交抗体、改变的抗体、F(ab')2片段、F(ab)片段、Fv片段、单结构域抗体、嵌合抗体、人源化抗体和其功能片段的制剂。术语“单克隆抗体”是指具有同源性抗体群的抗体组合物。该术语不受限于抗体的种类或来源，也不意在被其制备方式限制。该术语包括显示亲本单克隆抗体分子的免疫结合特性的全免疫球蛋白以及片段如Fab、F(ab')2、Fv和其他片段。在本发明的情况下，已经开发了许多杂交瘤，其与RON具有独特的结合特性，例如，其触发RON的特异性内化进入RON表达细胞，例如癌细胞中。如本文所使用，杂交瘤和其产生的抗体使用相同的名称，因此，杂交瘤细胞Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4、Zt/f2分别产生：单克隆抗体Zt/g4-DM1、Zt/c1-DM1、Zt/64、3F12、B9、1G4、Zt/f2。制备单克隆抗体的方法在本领域中是已知的。适合的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(如油滴或脂质体)和灭活的病毒颗粒。这样的载体为本领域普通技术人员所熟知。此外，抗原可以缀合到细菌类毒素，如来自白喉、破伤风、霍乱等的类毒素，以提高其免疫原性。单克隆抗体一般使用Kohler和Milstein，Nature(1975)256:495-497或其修订版制备。通常，使小鼠、仓鼠或大鼠免疫。将脾和/或大淋巴结移出并分离成单个细胞。随后诱导B细胞和/或分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤(通常是不表达内源性抗体重链和/或轻链的细胞)，并且在例如选择性培养基(例如，次黄嘌呤、氨喋呤、胸苷培养基，“HAT”)中培养。通过有限稀释法得到的杂交瘤铺平板并且分析特异性结合到RON的抗体的产生。随后在体外(例如，在组织培养瓶或空心纤维反应器)或在体内(例如，作为小鼠中的腹水)培养选定的分泌单克隆抗体的杂交瘤。术语“抗体片段”是指抗体的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等。无论结构如何，抗体片段与被完整抗体所识别的相同抗原结合。例如，抗-RON单克隆抗体片段与RON的表位结合。术语“抗体片段”是指与特异性抗原结合的合成或基因工程化的多肽，如包括(多个)轻链可变区的多肽，包括重链和轻链的可变区的“Fv”片段，其中轻链和重链可变区通过连接肽连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白质”)和包括模拟高变区的氨基酸残基的最小识别单位。术语Fab'在本文中被定义为包括异源二聚体的多肽，所述异源二聚体为抗体重链的可变结构域和第一恒定结构域加上抗体轻链的可变结构域和恒定结构域加上在重链CH1结构域的羧基末端的至少一个另外的氨基酸残基，包括一个或多个半胱氨酸残基。F(ab')2抗体片段是由(多个)共价键连接的Fab'抗体片段对。Fab'重链可以包括铰链区。这可以是任何希望的铰链氨基酸序列。供选择地，铰链可以被完全忽略以有利于单半胱氨酸残基或短(约1-10个残基)的包含半胱氨酸的多肽。在某些应用中，使用常见的天然存在的抗体铰链序列(半胱氨酸接着两个脯氨酸和随后的另一个半胱氨酸)；该序列在人IgG1分子的铰链中被发现(E.A.Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest3rdedition(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，1987))。在其他实施方案中，从另一个期望的抗体种类或同种型中选择铰链区。在本发明的某些优选的实施方案中，Fab'的CH1的C-末端融合到序列CysXX。X优选为Ala，但是其可以是任何其他残基，如Arg、Asp或Pro。可以删除一个或两个X氨基酸残基。“铰链区”是在天然免疫球蛋白或其任何序列变体中位于CH1和CH2之间的氨基酸序列。将使用其他免疫球蛋白的类似区域，但将理解的是铰链区的尺寸和序列可以大范围变化。例如，人IgG1的铰链区仅为约10个残基，而人IgG3的铰链区为约60个残基。术语Fv被定义为不包含恒定结构域的共价或非共价连接的重链和轻链异源二聚体。术语Fv-SH或Fab'-SH在本文中被定义为具有半胱氨酰游离巯基的Fv或Fab'多肽。游离巯基在铰链区中，其中通常参与链间结合的轻链和重链半胱氨酸残基以其天然形式存在。在本发明的最优选的实施方案中，Fab'-SH多肽组合物不含异质解蛋白降解片段并且基本上(大于约90摩尔％)不含Fab'片段，其中重链和轻链已经被还原或以另外的方式被衍生化从而不以其天然状态存在，例如通过形成异常二硫化物或巯基加成产物。术语“嵌合抗体”是指重组蛋白质，其包含源自啮齿类抗体的可变结构域和互补决定区，而抗体分子的剩余部分源自人源抗体。术语“人源化抗体”是指能够结合到预定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，并且其包括基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的FR区域和基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的互补决定区(CDR)或工程化以结合于预先选择的抗原的序列。人源化抗体通常被称为使用重链、轻链或两者的可变区中的CDR“镶嵌”抗体。如本文所讨论的，考虑了抗体或免疫球蛋白多肽的氨基酸序列中的微小变化，例如，假如氨基酸序列的变化与重链和/或轻链可变结构域的人框架区保持至少75％，更优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的同源性。具体地，在本发明中，如果人源化抗体与人可变结构域的非-CDR部分和恒定结构域保持至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性，则认为人源化抗体是完全人源化的。氨基酸序列中的某些变化被视为保守氨基酸替换。保守替换是在具有相似侧链的氨基酸之间的那些。氨基酸一般被分为以下类别：(1)非极性：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；(2)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；(3)碱性：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；和(4)极性：赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。另外的氨基酸类别包括：丝氨酸和苏氨酸是脂族羟基类别；天冬酰胺和谷氨酰胺是包含酰胺基类别；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂族类别；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族类别。因此，可合理预期的是单一的亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸替代、天冬氨酸被谷氨酸替代、苏氨酸被丝氨酸替代或氨基酸被结构相关的氨基酸类似地替代将不会对得到的分子的结合或特性具有重大影响，尤其是如果替代不涉及框架区内的氨基酸时。氨基酸变化是否产生功能肽通过分析多肽衍生物的具体活性容易地确定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以容易地由本领域普通技术人员制备，并且可以是氨基和羧基末端结构域的替换。结构和功能结构域还可以通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据(如本文所示)和/或序列数据库来确定。计算机化的比较方法可以用于鉴定在具有已知结构和/或功能的其他蛋白质中出现的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。一般地，保守氨基酸替换将基本上不会改变亲本序列的结构特征(例如，替换氨基酸不应倾向于破坏在亲本序列中出现的螺旋或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。术语“细胞”和“细胞培养物”互换地用来指主要但不总是在单细胞悬液或附着到平板或组织的细胞，并且包括其子代。术语“转化株”和“转化细胞”包括原代主体细胞和由其衍生的培养物，而不考虑传代数。还应理解由于有意或无意的突变，所有子代的DNA含量可能不精确地相同。包括在原始转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的突变子代。不同的名称将根据上下文变得明确。术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物，并且可互换使用。术语“内源的”是指其来源来自细胞内的物质。内源性物质通过细胞的代谢活性产生。然而，内源性物质仍可以由操纵细胞代谢产生，以例如使细胞表达编码该物质的基因。术语“外源的”是指其来源在细胞外部的物质。然而，外源性物质可以通过本领域技术人员已知的各种代谢或诱导方式中的任何一种被细胞内化。术语“基因”用来指功能性蛋白质、多肽或肽的编码单元。如本领域技术人员所理解的，该功能术语包括基因组序列、cDNA序列，或其片段和组合，以及基因产物，包括已经人工改变的那些。纯化的基因、核酸、蛋白质等用来指被鉴定的并且与其通常相关的至少一种混杂的核酸或蛋白质分离的这些实体。如本文所使用的术语“序列”用来指核苷酸或氨基酸，无论是天然的或人工的，例如修饰的核酸或氨基酸。当描述“转录的核酸”时，那些序列区域的位置邻近在5'和3'端上的编码区，以使脱氧核糖核苷酸序列对应于所包括的蛋白质的全长mRNA的长度。术语“基因”包括cDNA和基因的基因组形式。基因可以产生由初级RNA转录本的差异剪接生成的多种RNA。作为相同基因的剪接变体的cDNA将包含序列一致性或完全同源性的区域(表示相同外显子或相同外显子的部分在两个cDNA上的存在)和完全非同一性的区域(例如，表示外显子“A”在cDNAI上存在，而其中cDNA2包含外显子“B”)。由于两个cDNA包含序列一致性的区域，他们均将杂交到源自整个基因或包含在两个cDNA上发现的序列的基因的部分的探针；因此两个剪接变体基本与这样的探针同源以及彼此同源。术语“载体(vector)”用来指将(多个)DNA片段从一个细胞转移到另一个的核酸分子。术语“载体(vehicle)”有时与“载体(vector)”互换使用。如本文使用的术语“载体”还包括涉及包含期望的编码序列和适当的核酸序列的重组DNA分子的表达载体，所述适当的核酸序列是在具体宿主生物体中操作性地连接的编码序列表达所必需的。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选的)和核糖体结合位点，通常与其他序列一起。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多腺苷酸化信号。术语“药学上可接受的”是指适合用于人和/或动物而没有过度的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)，与合理的利益/风险比相称的组分。术语“安全和有效量”是指当以本发明的方式使用时，足以产生期望的治疗应答而没有过度的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)，与合理的利益/风险比相称的组分的量。“治疗有效量”是指有效地产生期望的治疗应答的本发明的化合物的量。例如，有效延迟癌症，肉瘤或淋巴瘤的生长，或导致癌症，肉瘤或淋巴瘤缩小或不转移的有效量。具体的安全和有效量或治疗有效量将根据这样的因素变化，所述因素如被治疗的具体病症，患者的身体状态，被治疗的哺乳动物的类型，治疗的持续时间，同时进行的疗法的性质(如果有的话)，以及采用的具体制剂以及化合物或其衍生物的结构。术语“药学上可接受的盐”是指用于制备化合物的酸或碱盐的盐。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，碱性残基如胺的矿物酸或有机酸盐；酸性残基如苯酚的碱性盐或有机盐。优选地，使用有机或无机酸制备盐。这些优选的酸盐为氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐等。优选的酚盐是碱土金属盐，钠、钾或锂盐。术语“药学载体”是指用于将抗-RON抗体、其片段和/或抗体药物缀合物(ADC)、化合物递送到动物或人的药学上可接受的溶剂、助悬剂或溶媒。载体可以是液体或固体，并且依据所考虑的计划给予方式选择。脂质体也是药学载体。术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括癌和肉瘤。癌症的实例为脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤。RON受体酪氨酸激酶是潜在的药物靶点。各种类型的肿瘤，包括乳腺和胰腺癌，显示异常的RON表达，其特征为过表达、同工型生成和组成性激活。特异性抗体结合到癌细胞表面上的RON并引起RON内化。该过程对于递送用于癌症治疗的细胞毒性药物是有效的。使用本发明可以将抗体药物缀合物(ADC)制成缀合物或融合蛋白。本发明人最近开发了一组抗-RON单克隆抗体(mAb)并证明抗-RONmAb作为潜在癌症治疗的药物递送方法很有效。通过使用先进的化学接头将毒性大的化学物直接缀合于致癌基因特异性抗体来产生ADC。适用于化学缀合于抗体的治疗剂不是常规的抗癌化学剂。相反地，其为不能直接注入患者体内的毒性大的物质。目前用于抗体化学缀合的药物是单甲基澳瑞他汀E、美登素衍生物等。在2011年七月，FDA批准了本妥昔单抗维多汀(brentuximabvedotin)，其为靶向CD30阳性淋巴瘤的ADC，用于白血病治疗。另一种ADC是与美登素衍生物缀合的曲妥单抗，用于晚期乳腺癌。RON受体酪氨酸激酶由于其在癌组织中高水平的表达，是已验证的用于癌症治疗的药物靶点。目前，靶向RON的小分子和治疗性抗体处在临床前试验和临床试验中。然而，得到的结果表明由于肿瘤细胞对RON信号转导缺乏强依赖性，治疗作用是中等的。因此，开发靶向RON的新型策略是急需的。本发明包括准备用于药物缀合、临床前功效研究、体内毒理学评价、ADC分布体内分析和靶向癌症谱的许多抗-RONmAb。本发明人认为通过建立该独特的抗-RONADC平台，将帮助我们在Amarillo创建创业型生物技术公司，并促进与制药公司的合作/许可以开发用于癌症治疗的RON靶向的ADC。本发明人已开发了许多独特的抗-RONmAb，其特异性识别RON细胞外结构域/结构上的不同表位。本发明人已经证明这些mAb迅速引起RON内化，实现有效的药物摄取。这些特征使我们的抗-RONmAb处在ADC开发的独特形势。此外，本发明人已使用这些抗体证实在各种类型的人类癌症中异常的RON表达。这些研究使我们鉴定一组作为RON-介导的肿瘤发生的临床靶点的人类癌症。具有RON过表达的三种主要的癌症为结肠直肠癌、乳腺癌和胰腺癌。因此，在我们的抗-RON-引导的ADC中的成功将具有显著和广泛的市场应用。此外，异常的RON表达还在红白血病、霍奇金淋巴瘤和某些B细胞来源的淋巴瘤中观察到，这为抗-RONADC的用途增添了另外的临床市场。累积的证据表明小分子抑制剂或治疗性抗体的靶向RON抑制在各种体内动物肿瘤异种移植模型中仅实现中等的抗肿瘤作用。详细的分析显示这主要是由于肿瘤细胞对RON信号传导缺乏强依赖性。此外，肿瘤细胞形成供选择的信号传导途径以补偿RON-介导的细胞生长的抑制。然而，单独靶向RON可能不总是足以控制肿瘤生长和显示临床意义。此外，特别紧迫的是开发新型策略以靶向或以其他方式使用RON用于有效的癌症治疗。RON在结肠、乳腺和胰腺癌细胞中过表达，但在相应的正常上皮细胞中保持最低水平。这表明RON特异性抗体可以用于携带细胞毒性药物以靶向杀死表达RON的癌细胞并改善治疗指数。为了证明该构思，本发明人已经开发了一组RON特异性单克隆抗体并将它们与化学剂缀合以杀死癌细胞。本发明人已经测试了三种类型的癌细胞，包括常规的结肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞，在缺氧条件下的癌细胞和癌干细胞。来自这些研究的结果表明抗-RONmAb可以在癌细胞中诱导强的和快速的RON内化，并且有效地递送用于细胞毒性的化学剂。抗-RONmAb和治疗特性。本发明人已经生产了许多对人RON特异的单克隆抗体，其已经通过免疫组织化学(IHC)染色测量癌组织中的RON表达并测试其在体外和体内肿瘤模型中的抗癌活性被验证。对RON细胞外结构域特异的mAb多于20种并测试了其生物化学和生物特性。三种类型的抗-RONmAb：使用晚期活细胞免疫方法，本发明能够产生仅对RON细胞外结构域特异的mAb。使用流式细胞仪结合生物分析，本发明人表征了我们的抗-RONmAb的特异性和敏感性。目前，这些抗-RONmAb已经显示对人RON高度敏感和特异。这是基于直接结合、ELISA、IHC、蛋白质印迹和其他生物化学和生物分析。此外，基于其结合到RON时的活性，本发明人能够将抗-RONmAb分为三类。(1)结合到RON并引起瞬态RON磷酸化的抗体。该类型抗-RONmAb被认为是激动型抗体。代表为Zt/g4、Zt/c1、Zt/c9、Zt/f1和Zt/H12。(2)抗-RONmAb是结合到RON但不激活RON的那些。典型的实例为Zt/g9和Zt/c8。(3)抗-RONmAb是结合于RON并抑制RON激活和信号传导的那些。一个实例是Zt/f2。本发明人认为该类型的mAb具有治疗潜力。激动型抗-RONmAb诱导快速的RON内吞作用。在抗-RONmAb的表征过程中，本发明人发现激动型抗-RONmAb，如Zt/g4和Zt/c1在癌细胞中结合于RON并引起快速和大量的细胞表面RON内化(被称为抗体诱导的受体内吞作用的过程)。该作用是高效的，在以10μg/ml/1×106个癌细胞添加抗-RONmAbZt/g4后，在24h内，几乎所有细胞表面RON被内化。更有趣地，该内吞作用将干扰细胞内的RON合成，导致在培养物中的癌细胞中的RON表达缺失高达72h。本发明人使用各种生化/生物分析证明Zt/g4诱导的RON磷酸化是RON内吞作用所需要的。不能导致RON激活的Fab片段不能诱导RON内吞作用。鉴于这些发现，本发明人得出抗-RONmAb-诱导的RON内吞作用可以用作靶向药物递送的药学手段的结论。用于增强癌细胞杀灭的化学剂的抗-RONmAb引导的递送。为了证明用于有效的药物递送的抗体引导的RON内吞作用，本发明人使用被称为隐形免疫脂质体的先进免疫脂质体技术来制备负载阿霉素的Zt/g4或Zt/c1-免疫脂质体(Zt/g4-Dox-IL或Zt/c1-Dox-IL)。本发明人使用各种对照证明Zt/g4或Zt/c1-dox-IL特异性结合到表达RON的癌细胞并引起快速的RON的内吞作用，其导致阿霉素递送到癌细胞的细胞质中。与对游离药物耐药的细胞相比，细胞毒性功效显著提高。此外，本发明人测试了在三种不同的条件下癌细胞中的Zt/g4或Zt/c1-Dox-IL的治疗指数，所述条件包括常氧、低氧和干细胞特性。最后，本发明人在不同类型的癌细胞，如结肠、乳腺和胰腺癌细胞中使用Zt/g4或Zt/c1-Dox-IL，在测试的所有细胞系中显示了提高的细胞毒性活性。因此，我们的结果证明了使用抗-RONmAb递送细胞毒性剂有效地提高了常见化学剂的抗癌功效。此外，这些观察为用于潜在的临床应用的ADC的开发奠定了基础。抗-RONmAbZt/f2是直接抑制体内肿瘤生长的治疗性抗体。Zt/f2是对人RON及其致癌变体如RON160具有高度特异性和敏感性的小鼠IgG2amAb(ED50＝2.3nmol/L)。受体结合研究显示Zt/f2与位于由在RONβ-链细胞外序列中的外显子11编码的49个氨基酸序列中的(多个)表位相互作用。该序列在调节RON成熟和磷酸化中是关键的。Zt/f2不与配体巨噬细胞刺激蛋白质竞争结合到RON；然而，其介入有效地诱导了RON内化，这使RON表达减少并破坏下游信号传导激活。这些生物化学特征为在动物模型中使用Zt/f2抑制肿瘤生长提供细胞基础。重复给予Balb/c小鼠作为单一药剂的Zt/f2导致由表达致癌RON160的转化的NIH-3T3细胞引起的肿瘤生长的部分抑制。在无胸腺裸鼠中的结肠癌HT-29细胞介导的肿瘤生长也在Zt/f2处理后减弱。在两种情况下，实现了通过肿瘤体积测量的～50％的肿瘤生长的抑制。此外，Zt/f2与5-氟尿嘧啶组合显示对HT-29细胞介导的体内肿瘤生长的抑制作用增强了～80％。本发明人通过动物模型中的结肠癌细胞得出Zt/f2是潜在的治疗性mAb，其能够抑制RON-介导的肿瘤发生的结论。Zt/f2在体内与化学剂5-氟尿嘧啶组合的抑制作用将代表用于未来结肠癌治疗的新型策略。抗-RONmAbADC的生物治疗平台。可以建立基于抗-RONmAb的生物治疗平台，其促进我们独特的抗-RONmAb的开发和许可给制药和生物技术公司，以开发用于临床应用的抗-RONADC。组分：基于抗-RONmAb的治疗性平台可以包括一种或多种以下组分：(1)改进的活细胞免疫技术：该技术使用过表达RON的活细胞及其变体作为免疫原，以确保杂交瘤产生仅识别RON细胞外结构域的抗-RON特异性抗体。进一步的改进将包括RON细胞外结构域的结构分析，其应有助于我们生产具有改进的RON内吞作用活性的抗体。(2)抗-RONmAb人源化技术：将选择的抗-RONmAb人源化用于未来的ADC开发。本发明人将进行抗-RONmAbmRNA的分离和序列分析。可以使用商业上可得的方法将独特的抗原结合序列接枝到人IgG1中。(3)抗体表征技术：本发明人已经生产多于二十种的抗-RONmAb，其需要针对其作为ADC适合的抗-RONmAb的潜力而被充分表征。一系列标准化分析/方法可以用于表征这些抗-RONmAb并确定其用于潜在的ADC开发的状态。分析的实例包括：结合结构域/区域和特异性，结合灵敏度和亲和力，RON内吞作用的诱导能力，和药物摄取功效。(4)抗-RonmAb生产/表征/概述。本发明人还可以使用抗体用于标准化程序的另外的开发和实施，所述程序用于使用过表达RON和RON变体的活细胞免疫。目的是选择用于生产具有高特异性、敏感性，并且能够诱导自动RON内吞作用的抗-RONmAb用于药物递送的最佳结构域/区域。此外，本发明人还能够程序化分析/方法以加速表征和概述程序，以选择用于人源化和另外的ADC开发的抗-RONmAb。(5)抗-RONmAb的人源化和临床前评价。对于抗-RONmAb的人源化，选择的抗-RONmAb，如Zt/f2和Zt/g4的mRNA序列可以用于鉴定另外的抗原结合序列。用于序列接枝以生成人源化抗-RONmAbZt/f1和Zt/g4的最佳区域的选择可以与表征/概述联合使用，使用本发明人的标准化分析/方法来评价抗体特异性和敏感性。可以在各种临床前模型中评价药物缀合的抗-RONmAb的治疗功效。ADC是用于靶向癌症治疗的第二代治疗剂，由于在化学连接技术中的成功其已经在过去数年中快速发展。癌症的第一代治疗性抗体的有限的功效强烈呼吁有效的癌症治疗的新型策略。目前，多于二十种的ADC在进行临床试验，具有有希望的结果。RON是有效的药物靶点。本发明人已产生多于二十种的抗-RONmAb用于直接的癌症治疗，并使用其用于药物递送。抗-RON抗体Zt/g4-药物美登木素生物碱缀合(抗-RONADC)作为用于靶向直肠结肠癌治疗的新型治疗剂的功效。受体酪氨酸激酶RON在上皮肿瘤发生和用于癌症治疗的药物靶点中是关键的。这里我们报导了用于靶向结肠直肠癌(CRC)治疗的新型抗-RON抗体Zt/g4-美登木素生物碱(DM1)缀合物的开发和治疗功效。单克隆抗体Zt/g4(IgG1a/κ)通过硫醚键缀合到DM1以形成Zt/g4-DM1，其中药物-抗体比例为4:1。在体外测试表达不同水平的RON的CRC细胞系以确定Zt/g4-DM1-诱导的RON内吞作用、细胞周期停滞和细胞毒性。在小鼠异种移植CRC肿瘤模型中评价Zt/g4-DM1在体内的功效。Zt/g4-DM1快速诱导RON内吞作用，细胞周期停滞在G2/M期，细胞活力降低，并在72小时内导致大量细胞死亡。在小鼠异种移植CRC模型中，在20mg/kg体重的单一剂量下，Zt/g4-DM1使CRC细胞-介导的肿瘤生长有效延迟多达20天。在包括五次注射方案的多剂量范围研究中，Zt/g4-DM1在7、10和15mg/kg体重的剂量下，抑制超过90％的肿瘤生长。实现50％的肿瘤抑制的最小剂量为～5.0mg/kg。制备的Zt/g4-DM1在37℃下稳定多达30天。在60mg/kg下，Zt/g4-DM1在体内具有中等的毒性，小鼠体重平均降低12％。发现Zt/g4-DM1在小鼠异种移植模型中在CRC细胞来源的肿瘤生长的靶向抑制中非常有效。该工作为未来用于RON-靶向CRC治疗的人源化Zt/g4-DM1的开发提供了基础。异常RON表达是导致上皮肿瘤发生的致病因素。然而，靶向RON用于癌症治疗的治疗性抗体或酪氨酸激酶抑制剂已经显示非常有限的功效。因此，需要开发具有改进的功效的RON-靶向治疗剂。本文描述了用于靶向癌症治疗的呈抗-RON抗体Zt/g4-药物美登木素生物碱缀合物(Zt/g4-DM1)形式的新型治疗剂。发现Zt/g4-DM1保持其诱导RON内吞作用的内在活性，导致细胞周期停滞，细胞活力降低和大量细胞死亡。在小鼠异种移植肿瘤模型中，Zt/g4-DM1对结肠直肠癌细胞来源的肿瘤显示强功效和长持续时间的作用，具有有利的安全特性。因此，靶向CRC治疗可以被抗-RON抗体-药物缀合物显著地改进，其对各种类型的癌症的治疗具有广泛的意义。在这层意义上，Zt/g4-DM1代表新型抗体-药物缀合物。RON受体酪氨酸激酶是MET原癌基因家族的成员(1，2)，其已经与上皮肿瘤发生(3)关联。RON的过表达存在于各种原发性肿瘤中，包括结肠直肠癌、乳腺癌和胰腺癌(4-10)。在结肠直肠癌(CRC)中，RON在多于50％的病例中过表达(4，5)。异常RON表达还导致致癌的和构成性活性RON变体，如RONΔ160的生成(3，5)。这些异常的结果是激活促进CRC细胞生长、侵袭和化学耐药性的各种细胞内信号传导途径(3)。RON在CRC中的过表达在预测患者的生存和临床结果中还具有预后价值(11)。因此，异常RON表达是CRC细胞中的致病特征，其促进致瘤表型和恶性进展(3-5，11-13)。高频率的CRCRON过表达和CRC细胞对用于生长的RON信号传导的依赖性为靶向RON用于治疗提供了基本原理。靶向RON和MET的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)如福瑞替尼(foretinib)(14)、BMS-777607(15)和MK-2461(16)目前在进行临床试验中(www.clinicaltrials.gov)。对RON特异的治疗性单克隆抗体(TMA)如IMC-41A10、纳奈妥单抗(临床试验ID:NCT01119456)和Zt/f2已在临床前模型中进行评价(17，18)。结果表明RON的靶向抑制在动物模型中对结肠、乳腺和胰腺癌细胞介导的肿瘤具有治疗性作用(17-19)。然而，功效仅限于约40-50％(17-19)。还未观察到肿瘤生长被单一RON-靶向的TKI或TMA完全抑制(14-19)。因此，急需开发和提高RON靶向治疗的功效。一个提高功效的非常有吸引力的策略是靶向RON用于细胞毒性药物递送。首先，RON在癌细胞中优先表达，在相应的正常上皮细胞中表达最低(4-10)。此外，RON在成纤维细胞、内皮细胞和血白细胞中不表达(1、4、7、20)。这样的表达模式对于实现具有可管理的安全特性的最大药物递送是关键的。其次，RON-特异性单克隆抗体(mAb)如Zt/g4和Zt/f2快速诱导癌细胞的RON内化(21-24)。该过程需要受体内吞作用所必需的瞬态RON磷酸化(21-24)。最后，抗-RONmAb-引导的药物递送针对癌细胞发挥增强的细胞毒性，这已在实验性CRC治疗中被证明(21-24)。考虑到用在用于靶向癌症治疗的抗体-药物缀合物(ADC)中的先进技术(25)，抗-RONADC的发展是用于RON-靶向治疗的有希望的策略。该方法还应克服在TKI-或TMA-靶向治疗中的缺点，即依赖用于癌细胞的生长和存活的RON信号传导。本研究评价了用于CRC治疗的新型抗-RONADC。发现RON-引导的呈ADC形式的高效药物的递送有效抑制小鼠异种移植CRC模型中的肿瘤生长。ADC是靶点特异性抗体、高效化合物、通用化学接头和可控的药物有效载荷的组合。抗-RONADC的开发提供了评价RON-靶向治疗的功效的合理的方法。为此目的，本发明人选择了小鼠mAbZt/g4，其对作为药物载体的RON细胞外序列具有高度特异性。Zt/g4通过非还原性硫醚键缀合到被称为DM1的美登木素生物碱(24)。使用体外和体内模型评价抗-RONZt/g4ADC的功效。细胞系和试剂：CRC细胞系DLD1、LoVo、HCT116、HT29和SW620来自美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCellCulture,Manassas,VA)并在2010年使用细胞发生验证。表达萤火虫萤光素酶基因-2的HT29-luc2和HCT116-luc2细胞来自PerkinElmer(Waltham,MA)并在2011年使用DNA描述和细胞发生验证。针对RONC-末端肽的小鼠抗-RONmAbZt/g4、Zt/c1和兔IgG抗体如前所述使用(2)。异硫氰酸荧光素(FITC)或罗丹明标记的山羊抗-小鼠IgG来自JacksonImmunoResearch(WestGrove,PA)。美登木素生物碱(DM1)和N-琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺基甲基]-环己基甲酸酯(SMCC)来自Concortis(SanDiego,CA)。抗-RONmAb与DM1通过硫醚键缀合：缀合根据方案进行，以实现4:1的药物-抗体比例(DAR)(26、29、30)。简言之，10mg/ml的Zt/g4与10mMSMCC-DM1在缀合缓冲液中混合以形成Zt/g4-SMCC-DM1(称为Zt/g4-DM1)。抗-RONmAbZt/c1还与SMCC-DM1缀合以形成Zt/c1-DM1。如上所述地，我们还通过使正常小鼠IgG(CmIgG)与SMCC-DM1缀合以形成CmIgG-DM1来制备对照ADC。使用PC10SephadexG25柱纯化所有缀合物，通过0.22μM滤器灭菌，并在4℃下储存。Zt/g4-DM1缀合及其稳定性的分析：使用与TSK丁基-NPR4.6×3,5柱偶联的VarianProstar210QuaternaryHPLC系统，通过疏水作用色谱(HIC)证实DM1与Zt/g4的缀合(TosohBiosciences(Prussia,PA))(31)。平均DAR由DAR物质的积分区域计算。该方法还用于确定Zt/g4-DM1在37℃下的稳定性。细胞表面RON表达的分析：使用来自DAKO(Carpentaria,CA)的试剂，通过免疫荧光分析定量确定细胞表面RON。使用Zt/g4以饱和浓度处理细胞(在PBS中每ml1×106个细胞)，接着与珠和羊F(ab')2F0479平行孵育。在建立校正曲线后，随后通过内插法按照制造商的说明确定在细胞表面上的RON受体的数量。RON表达的蛋白质印迹分析：在简化条件下，在8％SDS-PAGE中分离细胞蛋白质(每种样品50μg)。RON表达的蛋白质印迹如前所述进行(2)。还使用抗-肌动蛋白抗体重新探测膜以确保相等的样品负载。内化的RON的检测：以每孔1×105个细胞将在6-孔板中的细胞经5μg/mlZt/g4或Zt/g4-DM1处理不同时间，接着通过与FITC或罗丹明偶联的山羊抗-小鼠IgG处理。核DNA使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。如前所述地，在配备有DUS/荧光装置的OlympusBK71显微镜下观察免疫荧光(32)。细胞活力和死亡分析：通过MTT分析确定Zt/g4-DM1处理72h后的细胞活力(22)。通过台盼蓝拒染分析确定活或死细胞。从三个单独的孔对总共900细胞进行计数以得到死亡细胞的百分比。细胞周期的分析：在37℃下，将HT29、HCT116和SW620细胞(每个培养皿1×106个细胞)与5μg/mlZt/g4-DM1一起孵育24h，使用碘化丙啶标记，随后通过Accuri流式细胞仪分析。如前所述地，通过测量的DNA含量确定细胞周期变化(32)。小鼠异种移植CRC模型和抗-RONADC治疗：所有小鼠研究由机构动物保护委员会(institutionalanimalcarecommittee)批准。如前所述，在6周龄的雌性无胸腺裸鼠(Taconic,Cranbury,NJ)右侧腹的皮下空间注射5×106个HT29-Luc2、HCT116-luc2或SW620细胞(18，33)。将小鼠随机分成不同组(每组五只小鼠)。当所有肿瘤达到～1×107的平均生物发光(对于HT29-和HCT116-luc2细胞)或～100mm3的平均肿瘤体积(对于SW620细胞)时，开始处理。单剂量组接受0.1mlPBS中的20mg/kgZt/g4-DM1的尾静脉注射，接着观察28天。通过使用Zt/g4-DM1以1、3、7、10和15mg/kg每隔四天处理小鼠，总共注射五次进行多剂量研究。每隔四天使用CaliperIVIS成像系统(PerkinElmer)测量来自单个肿瘤的生物发光。根据下式测量来自SW620来源的肿瘤的肿瘤体积：V＝pi/6×1.58×(长度×宽度)3/2(18，33)。当肿瘤体积超过2000mm3或如果肿瘤变为坏死或溃疡而穿过皮肤，对动物进行安乐死。体内毒性研究：在Balb/C小鼠中(每个剂量四只小鼠)，通过以20、40和60mg/kg体重单次尾静脉注射Zt/g4-DM1确定使用最大耐受剂量的急性毒性。在携带HT29肿瘤异种移植物的无胸腺裸鼠中评价与不同治疗剂量相关的毒性(每个剂量五只小鼠)。观察小鼠约30天。通过观察小鼠行为、体重减轻和存活评估毒性。统计学分析：使用GraphPadPrism6软件进行统计学分析。结果显示为平均±SD。使用Studentt检验比较对照和实验组之间的数据。p<0.05的统计学上的差异被视为显著的。抗-RONADCZt/g4-DM1的表征：由于其在各种癌细胞中诱导RON内化的能力，将Zt/g4被选为先导ADC候选物(数据未显示)(21-23，28)。Zt/g4仅识别人RON而不识别小鼠RON同源物(28)并且其自身在体内没有肿瘤激动作用(18)。Zt/g4-DM1的结构显示在图1A中。使用实现4:1的平均DAR的条件，将总共250mgZt/g4缀合到DM1。我们对该比例的选择是基于公开的对曲妥株单抗-emtansine(T-DM1)的观察，其中一个IgG分子偶联四个DM1分子实现最大治疗功效(26，27)。HIC分析显示Zt/g4-DM1的平均DAR为3.724(图1B)。还由缀合物的积分面积确定具有不同DAR的缀合物的百分比(图1B和数据未显示)。占39.05％的主峰为峰4，具有4:1的DAR。使用5:1、4:1、3:1和2:1的DAR制备的Zt/g4-DM1占大于92％的总缀合物。Zt/c1-DM1和CmIg-DM1的DAR分别为3.91和4.01。通过在37℃下在体外孵育缀合物30天确定Zt/g4-DM1的稳定性。通过来自不同时间点的HIC测量DAR变化。Zt/g4-DM1在37℃下似乎稳定多达30天(图1C和数据未显示)。在第30天，其具有3.484的平均DAR，其表示从第0天的3.724的DAR仅减少6.4％。主要变化似乎分别是峰4和峰5，对于峰4从39.05％降低至32.72％，以及对于峰5从25.39％降低至20.06％。因此，制备的Zt/g4-DM1具有适合的DAR，并且在37℃下相对稳定。Zt/g4-DM1对CRC细胞诱导RON内吞作用的影响：我们选择表达可变水平的RON的CRC细胞系LoVo、DLD1、HT29、HCT116和SW620作为细胞模型(5，13)。在HT29、HCT116和SW620细胞中RON信号传导涉及生长、存活和侵袭(数据未显示)。在CRC细胞表面上表达的RON受体的数量通过基于荧光的定量方法来确定(图2A)。在单个CRC细胞的表面上经计算的RON分子分别为：对于HT29为18,793±278，对于HCT116为15,005±115.62，以及对于SW620细胞为11,265±2,006。DLD1具有每个细胞约4,480±347的特异性结合位点。在LoVo细胞中未观察到特异性结合。通过流式细胞分析确定Zt/g4-DM1与RON的结合能力。发现在被测试的所有三个CRC细胞系中，在游离Zt/g4和Zt/g4-DM1之间没有结合强度差异(图2B)。因此，缀合未破坏Zt/g4的结合能力。研究了Zt/g4-DM1-诱导的RON内吞作用，其为将DM1递送到CRC细胞中所必需的过程。在所有三个测试的CRC细胞系中，Zt/g4-DM1以时间依赖性方式引起细胞表面RON的渐进式减少(图2C)。在48小时处理后低于20％的RON保持在细胞表面上。Zt/g4-DM1诱导50％的RON减少(内化功效)所需的时间对于HCT116、HT29和SW620细胞分别为12.26h、11.02h和12.30h。相比之下，Zt/c1-DM1-诱导的50％的RON减少所需的时间在HCT116、HT29和SW620中分别为19.11h、19.41h和18.65h。因此，Zt/g4-DM1在诱导RON内吞作用中更有效和更强力。进行蛋白质印迹以证实Zt/g4-DM1对RON表达的作用(图2D)。在所有三个被测试的CRC细胞系中，前体-RON和成熟RON(由RON-β链表示)都渐进性地减少。Zt/g4-DM1有效地降低成熟RON表达，其驻留在细胞表面。在Zt/g4-DM1处理后36h，检测到少于20％的RON-β链。成熟RON的动态减少在三个细胞系中非常不同(图2E)。然而，Zt/g4-DM1诱导的RON减少的模式与游离Zt/g4-诱导的RON减少的模式相当，表明缀合未破坏Zt/g4-DM1诱导RON内吞作用的能力。使用HT29细胞作为模型，通过细胞质RON的免疫荧光分析证实Zt/g4-DM1-诱导的RON内吞作用(图2F)。将针对溶酶体相关的膜蛋白质1(LAMP1)染色的细胞用作内化的RON的共定位的标记物。在4℃下，在细胞表面上检测到RON。在Zt/g4-DM1处理后，在37℃下，发生内化的RON的细胞内定位。此外，细胞质RON与HT29细胞中的LAMP1共定位，表明内化的RON驻留在溶酶体内。相比之下，RON内吞作用在使用CmIgG-DM1处理的细胞中最少。RON与LAMP1的共定位在这些细胞中未观察到。因此，来自图2的结果显示Zt/g4-DM1在CRC细胞诱导RON内吞作用中有效。Zt/g4-DM1对CRC细胞周期、生长和死亡的作用：DM1作用于微管以引起细胞周期在G2/M期停滞，接着细胞死亡(29，34，35)。DM1的Zt/g4细胞内递送导致细胞周期变化。早在添加Zt/g4-DM1后3h就观察到细胞周期状况的变化，特征为在G0/G1期中的显著降低，在S期中的降低，以及在G2/M期中的急剧升高(图3A)。这些变化存在于所有三个被测试的CRC细胞系中。细胞周期的定量测量在24h时变化(数据未显示)。与来自Zt/g4-DM1处理的细胞的那些相比，CmIgG-DM1处理对细胞周期具有最小的影响。因此，Zt/g4-靶向的DM1的递送影响CRC细胞中的细胞周期。确定了Zt/g4-DM1对细胞活力的影响。CRC细胞对游离DM1的敏感性(数据未显示)的IC50值对于HCT116为4.1nM，对于HT29为4.4nM，以及对于SW620细胞为3.2nM，其表明对DM1的高敏感性。使用Zt/g4-DM1处理细胞。观察到细胞活力以时间和剂量依赖性方式显著降低(图3B)。在72h的Zt/g4-DM1的IC50值分别对于HT29为1.64μg/ml，对于HCT116为2.16μg/ml，以及对于SW620细胞为4.03μg/ml。Zt/c1-DM1的作用相对弱，IC50值分别对于HT29为6.26μg/ml，对于HCT116为4.64μg/ml，以及对于SW620细胞为4.36μg/ml。Zt/g4-DM1和Zt/c1-DM1两者对RON-阴性LoVo细胞不具有作用。DLD1细胞显示细胞活力轻微降低，IC50值为20.36μg/ml(数据未显示)。这显示抗-RONADC在表达低水平的RON的CRC细胞中无效(每个细胞在5,000个位点以下)。每个细胞具有不同数量的RON受体的四个CRC细胞系的Zt/g4-DM1功效的比较(数据未显示)。因此，Zt/g4-DM1比Zt/c1-DM1更有效地降低表达高水平RON的CRC细胞的活力。形态学观察表明细胞暴露到Zt/g4-DM1后72h，大量细胞死亡(图3C)。在使用7.5mg/mlZt/g4-DM1处理细胞后72h，观察到多于50％的细胞死亡(图3D)。在测试的所有三个CRC细胞系中，IC50值范围为5-7μg/ml。我们还在Zt/g4-DM1的存在下孵育每孔1×104个CRC细胞后72h对活细胞进行计数。Zt/g4-DM1处理导致活细胞数量显著降低(数据未显示)。因此，Zt/g4-DM1不仅导致细胞周期停滞和细胞活力降低，而且降低活细胞数量并诱导大量CRC细胞死亡。小鼠异种移植肿瘤模型中的Zt/g4-DM1的治疗活性。本发明人首先确定了单剂量的Zt/g4-DM1在20mg/kg体重下对源自HCT116、HT29和SW620细胞的肿瘤的功效。HCT116-luc2和HT29-luc2细胞的肿瘤生长通过从肿瘤细胞发射的生物发光来测量。由肿瘤体积评价SW620-介导的肿瘤(18，34)。单剂量的Zt/g4-DM1在20mg/kg下足以延迟三个CRC细胞系引起的肿瘤生长(图4A和4B)。该时间依赖性抑制是统计学上显著的。在图4C中显示在第16天获得的肿瘤的图像。在HT29和HCT116肿瘤模型两者中实现了通过平均生物发光强度测量的多于95％的抑制。在携带SW620肿瘤的小鼠中观察到类似的结果。在该情况下，记录了平均82％的肿瘤体积的抑制(图4C)。在第20天和之后观察到肿瘤再生长。从第24至第28天观察到加速期(图4A和4B)。已知的是小鼠IgG1在体内具有～6天的半衰期(36)。因此，这些结果显示，需要在体内将Zt/g4-DM1保持在约5mg/ml下以延迟肿瘤生长(数据未显示)。然而，通过在第28天测量平均肿瘤重量，仍然发现在单剂量研究中观察到肿瘤生长的显著延迟。抑制率分别对于HT29为50.98％，对于HCT116为58.0％，以及对于SW620肿瘤为61.9％(图4D)。因此，单剂量的20mg/kg的Zt/g4-DM1是有效的，并显示对所有三个CRC细胞系引发的肿瘤生长的抑制的持久活性。选择HT29-Luc2异种移植肿瘤模型用于剂量范围研究。使用不同剂量的Zt/g4-DM1注射小鼠，每隔四天一次，总共注射五次。Zt/g4-DM1在1或3mg/kg下显示肿瘤生长没有抑制(图5A)。在第三次注射后，在使用7mg/kgZt/g4-DM1处理的小鼠中观察到显著抑制。在该情况下，从第19到43天获得了由平均光子发射计算的多于80％的抑制。功效在使用10和15mg/kgZt/g4-DM1处理的小鼠中更加显著。在两种情况下，肿瘤生长在第二次注射后急剧延迟。在整个治疗期间，在两个剂量下重复注射使肿瘤生长保持在最低水平。通过分析第31天的平均光子，该多剂量研究的IC50剂量为5.01mg/kg体重(图5B)。在图5C中显示在第31天来自不同群组的肿瘤的图像。在使用Zt/g4-DM1以7、10和15mg/kg处理的小鼠中，抑制为剂量依赖性方式。与对照小鼠相比，在使用10和15mg/kg的Zt/g4-DM1处理的小鼠中实现了多于95％的抑制(图5C)。在第31天比较来自对照小鼠和使用15mg/kgZt/g4-DM1处理的小鼠的平均肿瘤重量，以确定抑制率。在平均肿瘤重量下观察到90％的抑制(图5D)。在第33天(对于1和3mg/kg群组)和第43天(对于7和10mg/kg群组)收集肿瘤，并与来自对照组的肿瘤比较。对于使用7和10mg/kgZt/g4-DM1处理的小鼠仍然观察到显著抑制。因此，在分别具有35、50和75mg的总剂量的7、10、15mg/kgQ4天×5的方案下，Zt/g4-DM1在小鼠异种移植模型中非常有效地延迟HT29细胞-介导的肿瘤生长。为了确定在异种移植肿瘤中是否发生细胞死亡，处理在第31天从对照和15mg/kg-处理的小鼠收集的HT29细胞来源的肿瘤样品用于组织学分析。通过H&E染色的分析显示在所有Zt/g4-DM1-处理的肿瘤中的不同区域中的细胞死亡，而在对照样品中没有(图5E)。肿瘤团中的死亡面积的平均百分比为65％±7.4。使用来自肿瘤样品的细胞溶解产物的蛋白质印迹分析还显示在Zt/g4-DM1处理的肿瘤中的RON表达(16.44％±5.75)与在对照样品中的RON表达(100％±15.56)相比急剧下降(图5F)。因此，在CRC异种移植肿瘤中Zt/g4-DM1导致细胞死亡，其与过表达RON的CRC细胞的消除相关。Zt/g4-DM1对小鼠的毒性作用。使用两种不同类型的小鼠进行三次研究以研究Zt/g4-DM1对动物行为和体重的影响。第一个研究解决了多剂量的Zt/g4-DM1的影响。使用1、3、5、7、10、15mg/kg的Zt/g4-DM1注射无胸腺裸鼠五次，并每隔四天监测总共31天的时间段。所有小鼠在整个观察期期间行为正常。研究组的平均体重与对照小鼠的平均体重相当，没有差异(图6A)。第二个研究观察了单剂量的Zt/g4-DM1在20mg/kg下在携带源自HT29、HCT116和SW620细胞的肿瘤的裸鼠中的影响。观察到行为或体重没有变化(图6B)。第三个研究涉及在Balb/c小鼠中单剂量注射20、40和60mg/kg的Zt/g4-DM1，监测24天(图6C)。在给予60mg/kgZt/g4-DM1的小鼠中观察到中度不适。此外，在60mg/kgZt/g4-DM1注射后，在前四天观察到体重约6％的中度降低。虽然来自该组的小鼠平均体重在观察期期间缓慢恢复，但总平均值仍然低于对照小鼠的总平均值，在第24天与对照小鼠的总平均值相比具有19％的差异。因此，在多剂量方案下的Zt/g4-DM1似乎是良好耐受的。然而，单剂量的Zt/g4-DM1在60mg/kg下显示对小鼠行为和体重的毒性作用。本发明人开发了抗-RONADCZt/g4-DM1用于靶向癌症治疗。本文显示在与DM1缀合后Zt/g4-DM1保持其对RON的特异性。在37℃下缀合物是稳定的，DM1与抗体的解离最小。Zt/g4-DM1与CRC细胞结合导致细胞表面RON的快速内吞作用。内化的Zt/g4-DM1导致细胞周期停滞在G2/M期，接着是细胞活力降低和大量细胞死亡。来自小鼠异种移植肿瘤模型的研究证实在20mg/kg下单剂量的Zt/g4-DM1足以抑制肿瘤生长，具有多达20天的持久作用。多剂量范围研究进一步证实了分别以35、50和75mg的总剂量，在7、10、15mg/kg下，每4天×5的治疗方案在肿瘤生长抑制中显示了强功效。此外，我们显示Zt/g4-DM1在高达40mg/kg的剂量下对小鼠行为或体重没有毒性作用。因此，Zt/g4-DM1是对RON-靶向癌症治疗具有增强的功效的新型生物治疗剂。在下文中描述Zt/g4的人源化。在适宜的DAR下通过硫醚键将Zt/g4缀合到DM1(25-27)。与之前的报道一致(26，27，29)，Zt/g4-DM1具有有利的缀合特性。大多数缀合物具有2:1至5:1的DAR，主峰在4:1处。这样的特性是使用硫醚键技术的ADC的通常模式(31)。Zt/g4-DM1是相对稳定的。在37℃下孵育Zt/g4-DM130天导致在DM1的DAR中仅有6.5％的降低。该数据与之前的报道一致，显示了通过硫醚键与DM1缀合的抗体在各种条件下在体外和体内都是高度稳定的(31，33)。虽然Zt/g4-DM1在体内条件下的稳定性未直接确定，但预期由于类似的缀合方法，该缀合物具有类似的稳定性特性(31，33)。使用在20mg/kg下的单剂量的Zt/g4-DM1的体内研究的功效支持该预期。在该情况下，单次注射足以抑制肿瘤生长差不多三周，意味着Zt/g4-DM1在体内相对稳定以施加持久的影响。明显地，硫醚键的使用为人源化Zt/g4-DM1的未来开发提供了实践基础。基于其一些独特的特征，将Zt/g4选择为DM1缀合的先导候选物。Zt/g4是对RON高度特异性和敏感性的mAb，并识别RONsema结构域中的表位(28)。Zt/g4与RON的结合导致快速和有效的RON内化过程。内化的RON与LAMP1共定位，表明内吞作用可以通过网格蛋白依赖性途径介导(37)。显著地，在添加Zt/g4-DM1后48h内，多于80％的细胞表面RON内化。在HT29细胞表达每个细胞～18,800RON个分子的情况下，其换算为在48h中内化的15,000个RON受体。这等于在单个细胞内有足以导致细胞周期停滞的60,000个DM1分子。注意到在三个CRC细胞系中RON内化的动力学在添加Zt/g4-DM1后非常不同，表明内吞作用的速率在调节Zt/g4-DM1的功效中的重要性。明显地，Zt/g4-诱导的RON内吞作用促进DM1的细胞内递送以发挥细胞毒性活性。此外，在表达RON的CRC细胞中Zt/g4没有激动活性(18)。通过Zt/g4递送的DM1的作用清楚地显示在CRC细胞中。首先，通过流式细胞分析显示DM1的递送导致细胞周期在G2/M期停滞，其为破坏微管动力学的DM1的特征(35)。早在添加Zt/g4-DM1后3h观察到该作用，其特征在于G1期的渐进性降低和G2/M期的细胞积累。其次，观察到DM1的靶向递送渐进性地降低细胞活力。在被测试的三个CRC细胞系中实现了处理后72h多于80％的细胞活力降低。最后，记载了在Zt/g4-DM1-处理的CRC细胞中大量细胞以剂量依赖方式死亡，其IC50值为5至7μg/mlZt/g4-DM1。该迹象表明DM1有效地由Zt/g4通过靶向途径递送，其导致细胞周期停滞、活力降低和细胞死亡。来自小鼠异种移植CRC模型的结果证明Zt/g4-DM1非常有效地抑制了肿瘤生长。该结论由使用两个治疗方案的小鼠模型支持。使用20mg/kgZt/g4-DM1的单剂量治疗被设计成确定该剂量是否足以抑制肿瘤生长，以及如果这样，该作用将持续多久。事实上，20mg/kg的Zt/g4-DM1非常有效地延迟异种移植肿瘤生长，具有几乎两周的持久作用。已知小鼠IgG1在体内具有～6天的半衰期(36)。给予20mg/kgZt/g4-DM1能够在24天内在四个半衰周期中监测其功效。获得的结果证实了Zt/g4-DM1的功效持续多达12天，没有肿瘤再生长的迹象(从第4天到第16天，如图4A所示)。通过计算，抑制肿瘤生长所需的体内Zt/g4-DM1的量为约5mg/kg(数据未显示)。换言之，5mg/kgZt/g4-DM1的剂量维持肿瘤生长和抑制之间的平衡。设计多剂量范围研究以确定抑制异种移植肿瘤生长所需的最小剂量。在具有35mg/kg的总剂量的Q4天×5的方案中，7mg/kg的Zt/g4-DM1实现了显著抑制。在类似的方案中，高达10和15mg/kg的Zt/g4-DM1的升高导致优异的治疗指数。在两种情况下，Zt/g4-DM1的总量分别为50和75mg/kg。这些结果显示5.01mg/kg的IC50值(根据重复的Zt/g4-DM1给药和估算的抗体半衰期计算)，其与来自单剂量研究的5mg/kg的估算值一致。因此，来自多剂量方案的结果可以用于确定人源化Zt/g4-DM1的最佳治疗方案。在两种类型的小鼠中的毒性特征的分析表明Zt/g4-DM1在治疗剂量下相对安全，对动物的行为和体重具有最小的影响。由于Zt/g4不识别小鼠RON，因此观察的低毒性表明Zt/g4-DM1缀合物在体内的非常有限的解离。然而，在60mg/kg下的单剂量Zt/g4-DM1对小鼠有负面影响，其由在整个研究期期间平均6％至19％的体重降低突显。这表明在给予多剂量的Zt/g4-DM1过程中，体内积累的Zt/g4-DM1不应超过60mg/kg限制。该剂量限制应为未来人源化Zt/g4-DM1在人类受试者中使用的有价值的参照。图7显示了本发明的单克隆抗体的用途的示意图，其中本发明的各种抗-RON单克隆抗体以高亲和力结合RON并导致表达RON的癌细胞的内吞作用，其中抗-RON抗体携带结合到本发明的抗-RON单克隆抗体(多个抗-RON单克隆抗体)的细胞毒性药物，其可以例如共价连接到抗-RON单克隆抗体，并且其还可以包括接头(例如，连接肽，化学接头等)以形成抗体药物缀合物(ADC)。ADC结合靶细胞，并且ADC的抗体部分引发ADC的癌细胞内化，细胞毒性药物在靶细胞中释放，导致癌细胞死亡。表1总结了Zt/g4-DM1和Zt/c1-DM1对人直肠结肠癌HT-29细胞的细胞毒性效应抗-RONmAb-DM1IC50值(μg/mL)IC50值(nM)Zt/g4-DM11.258.32Zt/c1-DM14.4329.51Zt/c1-DM1-15.0833.89对人RON特异的小鼠单克隆抗体Zt/f2：Zt/F2结合序列和氨基酸。重链：包括可变区的DNA序列(429bp)(剩余序列包括恒定区，其可以使用本领域熟知的方法和序列制成融合蛋白，例如制备人源化抗体的人恒定区和框架区)。在以下序列中，框架区为粗体的，并且核酸和氨基酸序列的互补决定区(CDR)均为有下划线的。前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4:ATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTCTTCCTGATTTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCACTACATTAATCCTAGCACTGGTTATATTGAGTACAATCAGAACTTCAAGGACTCCCCCTCTCATTATTACGGTAGTAGGTACGGATATTTCGATGTC(SEQIDNO.:1)重链：氨基酸序列(143AA)。在以下序列中，框架区为粗体的，并且核酸和氨基酸序列的互补决定区(CDR)均为有下划线的。前导序列--CDR1--CDR2--CDR3-MERHWIFLFLISVTAGVHSGYTFTSYWMHYINPSTGYIEYNQNFKDSPSHYYGSRYGYFDV(SEQIDNO.:2)轻链：DNA序列(384bp)。在以下序列中，框架区为粗体的，并且核酸和氨基酸序列的互补决定区(CDR)均为有下划线的。前导序列--CDR1--CDR2--CDR3-ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGAAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACGCCACATCCAACCTGGCTTCTCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACGGACG(SEQIDNO.:3)轻链：氨基酸序列(128AA)。在以下序列中，框架区为粗体的，并且核酸和氨基酸序列的互补决定区(CDR)均为有下划线的。前导序列--CDR1--CDR2--CDR3-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGRASSSVSYMHATSNLASQQWSSNPRT(SEQIDNO.:4)对人RON特异的小鼠单克隆抗体Zt/g4：Zt/g4结合序列和氨基酸。重链：DNA序列(414bp)。在以下序列中，框架区为粗体的，并且核酸和氨基酸序列的互补决定区(CDR)均为有下划线的。前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4:ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTCACAGGGGTCAATTCAGGCTTCAACATTATAGACACCTATATACACAGGATTGACCCTGCGGATGGTAATAGAAAATCTGACCCGAAGTTCCAGGTCGGGTACGGTAACCTCAATGCTATGGACTCC(SEQIDNO.:5)重链：氨基酸序列(138AA)。在以下序列中，框架区为粗体的，并且核酸和氨基酸序列的互补决定区(CDR)均为有下划线的。前导序列--CDR1--CDR2--CDR3-MKCSWVIFFLMAVVTGVNSGFNIIDTYIHWVNQKPDQGLEWIGRIDPADGNRKSDPKFQVGYGNLNAMDS(SEQIDNO.:6)轻链：DNA序列(381bp)。在以下序列中，框架区为粗体的，并且核酸和氨基酸序列的互补决定区(CDR)均为有下划线的。前导序列--CDR1--CDR2--CDR3-ATGAGGGTCCTTGCTGAGCTCCTGGGGCTGCTGCTGTTCTGCTTTTTAGGTGTGAGATGTCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTAAACAAGGCTTCCAACTTGCACACACAACAGGGTCAAAGTTATCCTCTGACG(SEQIDNO.:7)轻链：氨基酸序列(127AA)。在以下序列中，框架区为粗体的，并且核酸和氨基酸序列的互补决定区(CDR)均为有下划线的。前导序列--CDR1--CDR2--CDR3-MRVLAELLGLLLFCFLGVRCHASQNINVWLNKASNLHTQQGQSYPLT(SEQIDNO.:8)在一个非限定性实例中，使用以下CDR，可以将以下氨基酸序列镶嵌(veneer)到另一个抗体，例如人源抗体骨架的框架序列内的CDR区域中：选自GYTFTSYWMH(SEQIDNO.:9)、YINPSTGYIEYNQNFKD(SEQIDNO.:10)和SPSHYYGSRYGYFDV(SEQIDNO.:11)的重链CDR；或重链GFNIIDTYIH(SEQIDNO.:15)、RIDPADGNRKSDPKFQV(SEQIDNO.:16)和GYGNLNAMDS(SEQIDNO.:17)。同样，轻链还可以被选自以下的轻链CDR替代：RASSSVSYMH(SEQIDNO.:12)、ATSNLAS(SEQIDNO.:13)和QQWSSNPRT(SEQIDNO.:14)；或HASQNINVWLN(SEQIDNO.:18)、KASNLHT(SEQIDNO.:19)和QQGQSYPLT(SEQIDNO.:20)。与化疗剂组合的抗-RON抗体-药物缀合物Zt/g4-DM1作为用于晚期胰腺癌的新型治疗剂策略。胰腺导管腺癌(PDAC)是最恶性的肿瘤之一，具有有限的治疗选择。已经进行了一切努力以开发新型治疗剂来对抗该致命的疾病。本发明人还提供了用于晚期PDAC靶向治疗的被称为抗-RON抗体Zt/g4-药物美登木素生物碱(DM1)缀合物(抗-RONADC)的新型生物治疗剂及其与化学剂的组合。Zt/g4是对人RON高度特异的小鼠单克隆抗体(IgG1a/κ)。使用硫醚键技术实现Zt/g4缀合到DM1以形成Zt/g4-DM1。Zt/g4还缀合到单甲基澳瑞他汀E(MMAE)以形成Zt/g4-MMAE。生成的抗-RONADC的平均药物与抗体之比为3.8:1。使用人PDAC细胞系L3.6pl、BxPC-3和FG作为模型，我们发现Zt/g4-DM1和Zt/g4-MMAE两者在诱导RON内吞作用中很有效，其导致细胞毒性的有效负荷特异递送到癌细胞。靶向递送导致细胞周期在G2/M期停滞、细胞活力降低和大量细胞死亡。在被测试的三个PDAC细胞系中，导致细胞死亡的Zt/g4-DM1和Zt/g4-MMAE的平均IC50值分别为3.13μg/ml和5.16μg/ml。抗-RONADC还与包括吉西他滨的化疗剂显示杀死PDAC细胞的体外协同作用。在小鼠PDAC异种移植模型中，Zt/g4-DM1在时间剂量分级研究中，非常有效地抑制PDAC细胞-介导的肿瘤生长。Zt/g4-DM1与吉西他滨组合的体内研究目前在进行中。本发明人在本文中证明了抗-RONADCZt/g4-DM1或Zt/g4-MMAE是对表达RON的PDAC细胞高度特异的新型生物治疗剂。在临床前PDAC模型中的抗-RONADC的有效性的证实证明了人源化抗-RONADC的功效。细胞系和试剂：Panc-1、L3.6PL和BxPC-3细胞系来自ATCC。FG细胞来自Dr.AM.Lowy(MooresCancerCenterUCSanDiego)。小鼠抗-RONmAbZt/g4和Zt/c1如上文所述地生产。抗-RONmAb与DM1的缀合：通过硫醚键将Zt/g4缀合到SMCC-DM1，以实现4:1的药物-抗体比(DAR)，从而形成Zt/g4-DM1。使用PC10柱纯化缀合物，通过0.22μM滤器灭菌，并在4℃下储存。使用与TSK丁基-NPR4.6×3,5柱(TosohBiosciences,Prussia,PA)偶联的VarianProstar210QuaternaryHPLC系统(Varian,PaloAlto,CA,USA)，通过疏水作用色谱确定Zt/g4-DM1的分析。免疫荧光分析：通过使用5μg/mlZt/g4或Zt/g4-DM1孵育细胞，接着使用与FITC或罗丹明偶联的羊抗-小鼠IgG孵育，进行细胞表面或细胞质RON的免疫荧光检测。正常小鼠IgG用作对照。体外细胞活力和死亡分析：在Zt/g4-DM1、化疗剂及其组合处理后，通过MTT分析确定细胞活力。通过台盼蓝拒染分析确定细胞死亡。细胞周期的流式细胞分析：通过使用Zt/g4-DM1孵育细胞，使用碘化丙啶标记，然后通过Accuri流式细胞仪分析来确定细胞周期。小鼠异种移植PDAC模型和抗-RONADC处理：将5×106个L3.6PL、BxPC-3或FG细胞注射到雌性无胸腺裸鼠左侧腹的皮下间隙中。当所有肿瘤达到100至200mm3的平均肿瘤体积时，开始治疗。通过注射20mg/kgZt/g4-DM1研究单剂量的作用。每隔四天使用前述公式测定肿瘤体积：V＝pi/6×1.58×(长度×宽度)3/2。统计学分析:使用GraphPadPrism6软件进行统计学分析。结果显示为平均±SD。使用Studentt检验比较对照和实验组之间的数据。p<0.05的统计学差异被视为显著的。图8是显示在胰腺癌细胞系中Zt/g4-DM1诱导细胞表面RON减少的图表。图9显示在胰腺癌细胞中Zt/g4-DM1-诱导的细胞内RON定位。图10A至10D是显示Zt/g4-DM1对胰腺癌细胞周期、活力和细胞凋亡死亡的作用的图表。图11A至11C是显示Zt/g4-DM1与不同化疗剂组合的协同活性的图表。图11D包括显示Zt/g4-MMAE与吉西他滨组合的协同活性和人胰腺癌细胞的活力的图表；以及FIG.11E显示了示出Zt/g4-MMAE与奥沙利铂组合的协同活性和人胰腺癌细胞的活力的图表。图12是显示根据等效线图法的Zt/g4-DM1和化疗剂之间的协同作用的图表。图13是显示单剂量的Zt/g4-DM1对人PDAC的异种移植物生长的治疗性作用的图表。因此，本文证明在人异种移植小鼠中，Zt/g4-DM1在体内非常有效地抑制异种移植PDAC生长。Zt/g4-DM1与化疗剂组合显示对PDAC细胞活力的协同作用。如下所述，来自在重链和轻链两者中的小鼠抗-RONmAbZt/g4CDR和框架区的序列被接枝到人IgG1受体框架中，以产生五条人源化轻链(L1-5)和五条人源化重链(H1-5)。这形成25种不同的人源化Zt/g4对。其中，人源化Zt/g4H1L2、H1L3和H3L2已用于抗体-药物缀合。序列以下列格式显示：Kozak序列，接着是以斜体显示的前导序列，以粗体显示的可变区(VH/VL)，以下划线显示的恒定区域(hIgG1CH/hIgKCL)，以及最后三个核酸是终止密码子。DNA序列>G4-hzVH1-hIgG1CHGCCGCCACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTACAGTGAAAATCTCCTGCAAGGTTTCTGGATACACCTTCACCGACACCTATATACACTGGGTGCAACAGGCCCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGACCCTGCGGATGGTAATAGAAAATCTGACCCGAAGTTCCAGGTCAGAGTCACCATAACCGCGGACACGTCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGGGTACGGTAACCTCAATGCTATGGACTCCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTGTCGAGAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQIDNO:21)>Zt/g4-hzVH1-hIgG1CH-氨基酸序列AATASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQIDNO:22)>G4-hzVH2-hIgG1CHGCCGCCACCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCG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GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQIDNO:29)>Zt/g4-hzVH5-hIgG1CH-氨基酸序列AATASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQIDNO:30)>G4-hzVL1-hIgKCLGCCGCCACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGGGTCAAAGTTATCCTCTGACGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQIDNO:31)>Zt/g4-hzVL1-hIgKCL-氨基酸序列AATRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQIDNO:32)>G4-hzVL2-hIgKCLGCCGCCACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAAGTTATCCTCTGACGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQIDNO:33)>Zt/g4-hzVL2-hIgKCL-氨基酸序列AATRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQIDNO:34)>G4-hzVL3-hIgKCLGCCGCCACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTCAAAGTTATCCTCTGACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQIDNO:35)>Zt/g4-hzVL3-hIgKCL-氨基酸序列AATRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQIDNO:36)>G4-hzVL4-hIgKCLGCCGCCACCGCGACATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTAAACTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTCAAAGTTATCCTCTGACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQIDNO:37)>Zt/g4-hzVL4-hIgKCL-氨基酸序列AATRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQIDNO:38)>G4-hzVL5-hIgKCLGCCGCCACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTCAAAGTTATCCTCTGACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQIDNO:39)>Zt/g4-hzVL5-hIgKCL-氨基酸序列AATRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQIDNO:40)预期的是在本说明书中讨论的任何实施方案可以以本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。要理解的是，本文描述的具体实施方案通过说明的方式显示，并不作为对本发明的限制。在不脱离本发明范围的情况下，可以在各种实施方案中采用本发明的主要特征。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文描述的具体过程的多种等价方式。认为这样的等价方式在本发明的范围内，并涵盖在权利要求中。在本说明书中提及的所有出版物和专利申请显示本发明所涉及的领域中的技术人员的技术水平。将所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同具体地和单独地指明将每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入。使用词“一(a)”或“一(an)”当在权利要求和/或说明书中与术语“包括”联合使用时，可以指“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。在权利要求中术语“或”的使用是指“和/或”，除非明确表明仅指代择一的方案，或供选择的方案是互相排斥的，但是公开内容支持仅指代择一的方案和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用来指这样的值，其包括装置的误差、用于测定值的方法或在研究对象中存在的变化的固有改变。如在本说明书和权利要求(或多个权利要求)中所使用的，词“包含(comprising)”(和包含的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，不排除另外的未列举的元素或方法步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含(comprising)”可以被“基本上由……组成”或“由……组成”替换。如本文所使用的，短语“基本上由……组成”要求(多个)限定的整体或步骤以及不实质上影响所要求保护的发明的特征或功能的那些。如本文所使用的，术语“组成(consisting)”仅用来表示所列举的整体(例如，特征、元件、性质、特性、方法/过程步骤或限定)或整体的群组(例如，特征(或多个特征)、元件(或多个元件)、性质(或多个性质)、特性(或多个特性)、方法/过程步骤(或多个方法/过程步骤)或限定(或多个限定))的存在。如本文所使用的术语“或其组合”是指在该术语前所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意在包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在具体上下文中的顺序是重要的，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是包含一个或多个项目或条目的重复的组合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员将理解通常对任意组合中的项目或条目的数量没有限制，除非从上下文中明显得出。如本文所使用，近似的词，例如但不限于“约”、“基本”或“基本上”是指这样的状态，当如此修饰时，其被理解为不必是绝对的或完全的，但将被认为足够接近本领域普通技术人员保证指定该条件存在。描述可以变化的程度将取决于可以设置并仍然使本领域普通技术人员认可该修饰的特征仍具有未修饰的特征所需要的性质和能力的变化有多大。一般地，但符合前述讨论，由近似词如“约”修饰的本文的数值可以从指定值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％。根据本发明，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以在不进行过度实验的情况下形成或实施。虽然以优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，变化可以适用于本文所描述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序中。对本领域技术人员明显的是所有这些类似的替代和改变被视为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。参考文献1.RonsinC,MuscatelliF,MatteiMG,BreathnachR.Anovelputativereceptorproteintyrosinekinaseofthemetfamily.Oncogene1993；8:1195-202.2.Wang,MH,RonsinC,GesnelMC,CoupeyL,SkeelA,LeonardEJ等人，Identificationoftherongeneproductasthereceptorforthehumanmacrophagestimulatingprotein.Science1994；266:117-9.3.YaoHP,ZhouYQ,ZhangR,WangMH.MSP-RONsignalingincancer:pathogenesisandtherapeuticpotential.NatRevCancer2013；13:466-81.4.WangMH,LeeW,LuoYL,WeisMT,YaoHP.AlteredexpressionoftheRONreceptortyrosinekinaseinvariousepithelialcancersanditscontributiontotumorigenicphenotypesinthyroidcancercells.JPathol2007；213:402-11.5.ZhouYQ,HeC,ChenYQ,WangD,WangMH.AlteredexpressionoftheRONreceptortyrosinekinaseinprimaryhumancolorectaladenocarcinomas:generationofdifferentsplicingRONvariantsandtheironcogenicpotential.Oncogene2003；22:186-97.6.YaoHP,ZhuangCM,ZhouYQ,ZengJY,ZhangRW,WangMH.OncogenicvariantRON160expressioninbreastcanceranditspotentialasatherapeutictargetbysmallmoleculetyrosinekinaseinhibitor.CurrCancerDrugTargets.2013；13:686-97.7.ThomasRM,ToneyK,Fenoglio-PreiserC,Revelo-PenafielMP,HingoraniSR,TuvesonDA等人，TheRONreceptortyrosinekinasemediatesoncogenicphenotypesinpancreaticcancercellsandisincreasinglyexpressedduringpancreaticcancerprogression.CancerRes2007；67:6075-82.8.MaggioraP,MarchioS,StellaMC,GiaiM,BelfioreA,DeBortoliM等人，OverexpressionoftheRONgeneinhumanbreastcarcinoma.Oncogene1998；16:2927-33.9.LeeWY,ChenHH,ChowNH,SuWC,LinPW,GuoHR.Prognosticsignificanceofco-expressionofRONandMETreceptorsinnode-negativebreastcancerpatients.ClinCancerRes2005；11:2222-8.10.WelmAL,SneddonJB,TaylorC,NuytenDS,vandeVijverMJ,HasegawaBH等人，Themacrophage-stimulatingproteinpathwaypromotesmetastasisinamousemodelforbreastcancerandpredictspoorprognosisinhumans.ProcNatlAcadSciUSA2007；104:7570-5.11.ParkYL,LeeGH,KimKY,MyungE,KimJS,MyungDS等人，ExpressionofRONincolorectalcanceranditsrelationshipswithtumorcellbehaviorandprognosis.Tumori2012；98:652-62.12.WangJ,RajputA,KanJL,RoseR,LiuXQ,KuropatwinskiK等人，KnockdownofRonkinaseinhibitsmutantphosphatidylinositol3-kinaseandreducesmetastasisinhumancoloncarcinoma.JBiolChem2009；284:10912-22.13.XuXM,WangD,ShenQ,ChenYQ,WangMH.RNA-mediatedgenesilencingoftheRONreceptortyrosinekinasealtersoncogenicphenotypesofhumancolorectalcarcinomacells.Oncogene2004；23:8464-74.14.QianF,EngstS,YamaguchiK,YuP,WonKA,MockL等人，Inhibitionoftumorcellgrowth,invasion,andmetastasisbyEXEL-2880(XL880,GSK1363089),anovelinhibitorofHGFandVEGFreceptortyrosinekinases.CancerRes2009；69:8009-16.15.SchroederGM,AnY,CaiZW,ChenXT,ClarkC,CorneliusLA等人，DiscoveryofN-(4-(2-amino-3-chloropyridin-4-yloxy)-3-fluorophenyl)-4-ethoxy-1-(4-fluorophenyl)-2-oxo-1,2-dihydropyridine-3-carboxamide(BMS-777607),aselectiveandorallyefficaciousinhibitoroftheMetkinasesuperfamily.JMedChem2009；52:1251-4.16.PanBS,ChanGK,ChenardM,ChiA,DavisLJ,DeshmukhSV等人，MK-2461,anovelmultitargetedkinaseinhibitor,preferentiallyinhibitstheactivatedc-Metreceptor.CancerRes2010；70:1524-33.17.O'TooleJM1,RabenauKE,BurnsK,LuD,MangalampalliV,BalderesP等人，Therapeuticimplicationsofahumanneutralizingantibodytothemacrophage-stimulatingproteinreceptortyrosinekinase(RON),ac-METfamilymembe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