肌肉萎缩相关的蛋白质分子标记Dkk-3的筛选及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及肌肉萎缩相关的蛋白质分子标记Dkk-3的筛选及其应用。

背景技术：

肌肉萎缩的现有诊断方法主要包括询问病史、进行肌肉的外观检查、观察有无肌束颤动、观察病人是否有明显的肌肉质量减少，并通过肌电图结合神经传导速度和诱发电位进行诊断。目前还没有分子诊断方法。

Dkk-3是Dickkopf蛋白家族的一员,属于胞外分泌蛋白。但是，目前的研究还没有发现Dkk-3的表达量高低是否与肌肉萎缩的发生存在关联。

因此，为治疗和诊断目的的研究和开发在肌肉萎缩中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要在肌肉萎缩中高表达的基因和/或蛋白。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供肌肉萎缩相关的蛋白质分子标记Dkk-3的筛选及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供一种Dkk-3蛋白、其抗体、其编码基因或其转录本的用途，用于制备检测肌肉萎缩的试剂。

本发明的第二方面，提供了一种体外确定待测肌肉细胞中Dkk-3基因表达量是否异常的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)抽提待测肌肉细胞的mRNA，并反转录为cDNA；

(2)用特异性扩增Dkk-3转录本的引物，以步骤(1)的cDNA为模板，通过定量PCR法扩增获得Dkk-3的扩增产物；

(3)将步骤(2)待测肌肉细胞的Dkk-3扩增产物数量进行比较，高于正常肌肉细胞的Dkk-3扩增产物数量就表示待测肌肉细胞中Dkk-3基因表达量存在异常。

上述方法可以是非疾病诊断目的的方法，例如仅仅用于可以研究相关机理。

本发明的第三方面，提供了一种体外确定待测肌肉细胞中Dkk-3蛋白表达量是否异常的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)用特异性抗Dkk-3蛋白的抗体检测待测肌肉细胞中Dkk-3蛋白的数量；

(2)将步骤(1)中待测肌肉细胞的Dkk-3蛋白数量与正常肌肉细胞的Dkk-3蛋白数量进行比较，高于正常肌肉细胞的Dkk-3蛋白数量就表示待测肌肉细胞中Dkk-3蛋白表达量存在异常。

上述方法可以是非疾病诊断目的的方法，例如仅仅用于可以研究相关机理。

本发明的第四方面，提供了一种检测肌肉萎缩的试剂盒，所述试剂盒包括：特异性扩增Dkk-3转录本的引物和/或特异性抗Dkk-3的抗体。

在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的试剂：

(1)阳性对照；

(2)阴性对照。

本发明的第五方面，提供了一种Dkk-3蛋白、其编码基因或其转录本的用途，用作检测肌肉萎缩的标记物。

本发明的第六方面，提供了检测肌肉萎缩或肌肉萎缩易感性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)用特异性扩增Dkk-3转录本的引物，以待测个体肌肉细胞的cDNA为模板，通过定量PCR法扩增获得Dkk-3的扩增产物，检测形成的扩增产物数目是否高于正常对照；或者适合形成抗体复合物的条件下，将特异性抗Dkk-3蛋白的抗体与待测个体的样品进行接触，并检测形成的抗体复合物数量是否高于正常对照；

(2)形成的扩增产物数目或抗体复合物数量如果高于正常对照，就表示该个体患有肌肉萎缩或肌肉萎缩易感性高于正常人群。

上述方法可以是非疾病诊断目的的方法，例如仅仅用于可以研究相关机理。

本发明的第七方面提供了一种筛选治疗肌肉萎缩的药物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将Dkk-3基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备表达Dkk-3蛋白的细胞株；

(2)向步骤(1)中的表达Dkk-3蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，施用后导致肌肉萎缩症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肌肉萎缩的候选药物。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次揭示了Dkk-3与肌肉萎缩的相关性，在90％以上的肌肉萎缩病例中有高表达，肌肉萎缩细胞中的表达量:正常肌肉细胞中的表达量≥3.0:1，本发明方法在检出的灵敏度，准确性都显著优于现有的诊断方法，不仅填补了分子诊断法检测肌肉萎缩的盲区，而且操作简便。

(2)通过PCR等分子诊断方法检测肌肉中Dkk-3的表达水平来诊断老年肌肉萎缩，可以在肌肉萎缩早期进行诊断。传统诊断方法主要依靠观察肌肉形态结合肌力测定进行。只有肌肉萎缩进行到相当的程度，肌肉形态及肌力才会发生变化，无法在肌肉萎缩的早期发现并干预。此外，肌力检测一般检测到的是一组肌肉的收缩力，对于确定肌群中的某一块肌肉是否发生萎缩灵敏度不高。而分子诊断可以准确固定取样位置，检测每一块肌肉的萎缩情况。分子诊断可进行定量检测，能够制订标准化的检测流程，去除传统观察诊断方法中的人为主观误差因素。此外，PCR检测所需样品极少，检测方便快速。

附图说明

图1：Dkk-3表达水平在老年肌肉中显著增加，肌肉萎缩特异性基因Atrogin-1和Murf-1的表达水平在老年肌肉中也显著上调。

图2：Lammin B免疫荧光染色，显示老年肌纤维的面积明显小于年轻的肌纤维。Scale bar:20μm。

图3：统计学分析显示，老年肌纤维的面积明显小于年轻肌纤维。

图4：在体外培养的小鼠myotube中过表达Dkk-3造成肌肉萎缩。

图4A：与对照组相比，过表达带有Flag标签的Dkk-3后，myotube的直径显著减小。

图4B：统计学分析显示，过表达Dkk-3后myotube的直径显著减小。

图:4C：通过Western blot检测带有Flag标签的Dkk-3在myotube中的过表达水平。

图5：在体外培养的myotube中过表达Dkk-3导致肌肉萎缩特异性基因Atrogin-1和Murf-1的表达量增加。

图6：在小鼠肌肉中过表达Dkk-3导致肌肉萎缩。

图6A：在小鼠肌肉中过表达带有GFP标签的Dkk-3导致注射部位的肌纤维面积显著减小。

图6B：过表达Dkk-3的肌纤维面积的统计学分析。过表达带有GFP标签的Dkk-3导致注射部位的肌纤维面积显著减小。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，不仅克隆了人的Dkk-3基因序列，而且还利用不同的模型，对Dkk-3基因在肌肉萎缩过程中的功能进行了研究。意外地发现，Dkk-3与肌肉萎缩有关。

以人肌肉中Dkk-3基因的cDNA保守区域为参照设计了一对引物，通过PCR，在老年肌肉cDNA文库中克隆到一段DNA序列。测序结果表明，该序列长度为1053bp，与大鼠和小鼠Dkk-3的cDNA相应区域分别具有92％和93％的同源性。

以小鼠为实验动物，通过实验模型对Dkk-3基因进行了功能检测。向肌肉注射能够表达Dkk-3基因的病毒，结果发现Dkk-3基因的表达可显著上调肌肉萎缩特异性基因Atrogin-1和Murf-1基因的表达，导致肌肉萎缩。

鉴于，Dkk-3mRNA在肌肉组织中的特异性高表达，提示Dkk-3蛋白与肌肉萎缩有关。根据人Dkk-3基因及其表达产物设计的药物和诊断技术，可用于诊断和治疗人类的肌肉萎缩。

定义

如本文所用，“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核酸聚合物。除非另外说明该术语已包括能够与天然核苷酸类似方式发挥作用的天然核苷酸的类似物。

“杂交”指通过互补碱基的配对而使两个单链核酸结合在一起。

“基本结合于”或“特异结合”或“选择性结合”或“特异性杂交于”，指在寡核苷酸和靶序列之间的互补杂交反应，并可包括微小的错配，这些错配可通过降低杂交介质的严紧度来实现检测所需靶多核苷酸序列。该术语还指在严紧条件下，一分子结合、复合或杂交于特定核苷酸序列，当该序列存在于复合的混合物中(如总细胞DNA或RNA)时，术语“严紧条件”指探针杂交于靶序列而不杂交于其他序列的条件。严紧条件是依赖于序列的，并且在不同情况下是不同的。较长的序列可在更高的温度下特异性杂交。通常，选定的严紧条件是比在限定的离子强度和pH下推定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。该Tm是在达到平衡时，有约50％与靶序列互补的探针与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。通常，对于短探针而言，严紧条件是这样的条件，其中盐浓度至少约0.02mol/L Na⁺离子浓度,0.0015mol/L Mg²⁺(或其他盐)，pH7.0-8.3，且温度至少约60℃。严紧条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺、DMSO等而实现。

本领域的技术人员能够理解，此处所述的具体引物和探针的确切序列可以被一定程度地修饰，以产生所公开的引物或探针“基本相同”但保留基本结合于靶序列的能力。

Dkk-3蛋白和基因

基于本发明所揭示的Dkk-3与肌肉萎缩的相关性以及Dkk-3的序列信息，本领域技术人员可采用本领域的常规技术来产生DKK-3基因、蛋白或其片段。

在本发明中，术语“Dkk-3蛋白”、“Dkk-3多肽”、“肌肉萎缩高表达蛋白Dkk-3”或“本发明蛋白”等可互换使用，都指具有人或其他哺乳动物的Dkk-3蛋白(Genebank登录号为AAQ88744.1；NCBI登录号为AY358378.1)。

一种特别优选的Dkk-3蛋白是人的Dkk-3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

MQRLGATLLCLLLAAAVPTAPAPAPTATSAPVKPGPALSYPQEEATLNEMFREVEELMEDTQHKLRSAVEEMEAEEAAAKASSEVNLANLPPSYHNETNTDTKVGNNTIHVHREIHKITNNQTGQMVFSETVITSVGDEEGRRSHECIIDEDCGPSMYCQFASFQYTCQPCRGQRMLCTRDSECCGDQLCVWGHCTKMATRGSNGTICDNQRDCQPGLCCAFQRGLLFPVCTPLPVEGELCHDPASRLLDLITWELEPDGALDRCPCASGLLCQPHSHSLVYVCKPTFVGSRDQDGEILLPREVPDEYEVGSFMEEVRQELEDLERSLTEEMALGEPAAAAAALLGGEEI。

编码所述Dkk-3蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

atgcagcg gcttggggcc accctgctgtgcctgctgct ggcggcggcg gtccccacgg cccccgcgcc cgctccgacg gcgacctcggctccagtcaa gcccggcccg gctctcagct acccgcagga ggaggccacc ctcaatgagatgttccgcga ggttgaggaa ctgatggagg acacgcagca caaattgcgc agcgcggtggaagagatgga ggcagaagaa gctgctgcta aagcatcatc agaagtgaac ctggcaaacttacctcccag ctatcacaat gagaccaaca cagacacgaa ggttggaaat aataccatccatgtgcaccg agaaattcac aagataacca acaaccagac tggacaaatg gtcttttcagagacagttat cacatctgtg ggagacgaag aaggcagaag gagccacgag tgcatcatcgacgaggactg tgggcccagc atgtactgcc agtttgccag cttccagtac acctgccagccatgccgggg ccagaggatg ctctgcaccc gggacagtga gtgctgtgga gaccagctgtgtgtctgggg tcactgcacc aaaatggcca ccaggggcag caatgggacc atctgtgacaaccagaggga ctgccagccg gggctgtgct gtgccttcca gagaggcctg ctgttccctgtgtgcacacc cctgcccgtg gagggcgagc tttgccatga ccccgccagc cggcttctggacctcatcac ctgggagcta gagcctgatg gagccttgga ccgatgccct tgtgccagtggcctcctctg ccagccccac agccacagcc tggtgtatgt gtgcaagccg accttcgtggggagccgtga ccaagatggg gagatcctgc tgcccagaga ggtccccgat gagtatgaagttggcagctt catggaggag gtgcgccagg agctggagga cctggagagg agcctgactgaagagatggc gctgggggag cctgcggctg ccgccgctgc actgctggga ggggaagagatttag。

Dkk-3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩展法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已知的人Dkk-3、小鼠Dkk-3或大鼠Dkk-3的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA序列作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成的方法来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

可用于本发明的Dkk-3蛋白可通过将相应的编码序列引入宿主细胞(直接引入或通过引入含Dkk-3编码序列的载体)，并在合适的条件下培养转化的宿主细胞以表达Dkk-3蛋白，然后分离和纯化出Dkk-3蛋白。

抗Dkk-3蛋白的抗体

另一方面，本发明还包括对Dkk-3DNA或其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Dkk-3基因产物或片段。较优地，指那些能够与Dkk-3基因产物或片段结合但不识别和结合于其他非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制DKK-3蛋白的分子，也包括那些并不影响Dkk-3蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，而且还包括具有免疫原活性的抗体片段，如Fab1或Fab2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

抗Dkk-3蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的Dkk-3蛋白。此外，与人Dkk-3蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素或荧光标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性或荧光标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肌肉萎缩 细胞的定位。

本发明中的抗体可用于检测与人Dkk-3蛋白相关的疾病，如肌肉萎缩。抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的抑制剂。如人Dkk-3蛋白高亲和性的单克隆抗体可与抑制剂共价结合。由于本发明的Dkk-3蛋白在肌肉细胞中是特异性高表达的，这种杂交抗体可用于降低人Dkk-3蛋白的水平。

多克隆抗体的生产可用人Dkk-3蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂。

药物组合物

本发明蛋白的拮抗剂(如抗体)，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供治疗的效果。通常，将这些物质配置于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5～8，较佳地pH约为6～8，尽管pH值可随被配置物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配置好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明多肽的拮抗剂可用于肌肉萎缩的治疗。在使用本发明的Dkk-3蛋白时，还可以同时使用其他的治疗剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效剂量的(如0.01～99wt％)本发明Dkk-3蛋白的拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的辅料包括(但并不限于):药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明的药物组合物可以为口服制剂，如胶囊、片剂、分散片、口含片、咀嚼片、泡腾片、缓释片、颗粒剂等。可有效改变传统汤剂外观差，不便携带，服用麻烦，服用量大的缺点，为研制治疗慢性肾炎的剂量小、药效强、稳定性好的新剂型提供了新途径。

本发明的药物组合物可采用常规方法制备，如将各有效成分混匀，或者根据各种制剂的常规制法，将药效成分与相应辅料混配后制备获得。本发明的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明的药物组合物可用于治疗肌肉萎缩。

本发明的药物组合物的有效治疗剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人Dkk-3蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由Dkk-3蛋白的表达异常所致的或所代表的细胞增殖、发育或代谢异常(如肌肉萎缩)。

抑制人Dkk-3mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酸酶也在本发明的范围之内。核酸酶是一种能够特异性分解特定RNA的酶，其作用机制是核酸酶分子与互补的靶RNA特异性杂交进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酸酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中，或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)现将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内或者通过TALEN、CRSP/Cas9或其它基因编辑的方法改变基因组序列后产生的基因敲除或竞争性突变体等。

利用本蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Dkk-3蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。在筛选时，可以将Dkk-3蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响Dkk-3蛋白与其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。此外，还可将测试化合物与Dkk-3蛋白一起施用于实验动物，与对照相比存在动物肌肉萎缩变化就表明，该化合物是Dkk-3蛋白的激动剂或拮抗剂。

此外，还可将Dkk-3基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备高表达Dkk-3蛋白的细胞株；并以此细胞株中的Dkk-3蛋白为靶点，筛选对Dkk-3蛋白有激活或抑制作用的药物。并向所述的表达Dkk-3蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测Dkk-3蛋白表达量的变化。抑制Dkk-3蛋白表达的化合物可用于治疗肌肉萎缩。

检测方法

本发明还涉及定量和定位检测人Dkk-3蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括免疫荧光测定、免疫组化和放射免疫测定。试验中所检测的Dkk-3蛋白水平，可以用作确定被检测个体患有肌肉萎缩易感性的几率是否高于正常人群的指标之一。

一种检测样品中是否存在Dkk-3蛋白的方法是利用Dkk-3蛋白的特异性进行检测，它包括：将样品与Dkk-3蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Dkk-3蛋白。

编码Dkk-3蛋白的多聚核苷酸可用于Dkk-3蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，编码Dkk-3蛋白的多聚核苷酸可用于检测Dkk-3转录本的表达与否或在疾病状态下Dkk-3 转录本的异常表达。如Dkk-3DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断Dkk-3蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可以从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或基因芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用Dkk-3蛋白特异的引物进行RT-PCR体外扩增也可检测Dkk-3基因的转录产物。

由于Dkk-3蛋白在肌肉萎缩中的高表达率，因此Dkk-3多核苷酸、Dkk-3蛋白及其抗体，以及Dkk-3蛋白相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗肌肉萎缩提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

试剂盒

本发明还提供了诊断Dkk-3表达是否异常的诊断试剂盒。在优选例中，一种试剂盒包括特异性扩增Dkk-3转录本的引物和/或特异性抗Dkk-3的抗体。所述试剂盒还可含有描述如何使用试剂盒来检测Dkk-3说明材料。进一步的，所述试剂盒还可以含有以下组分中的任意一种或多种：用于协助检测的各种标记物或标记试剂；用于PCR的试剂(包括缓冲液)；用于免疫杂交的试剂；以及阳性和阴性对照等。

应理解，在本发明首次揭示了Dkk-3基因的表达异常与肌肉萎缩的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增Dkk-3的引物，然后通过定量检测等方法确定其表达量。通常，引物的长度为15～50bp，较佳地为18～30bp。虽然，引物与模板完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100～3000bp，较佳地为150～2000bp，更佳地为200～1000bp。

与现行用于诊断肌肉萎缩的其他方法相比较，本发明的优势主要表现在：DKK-3与肌肉萎缩的相关性，在90％以上的肌肉萎缩病例中有高表达，肌肉萎缩细胞中的表达量：正常肌肉细胞中的表达量≥3.0:1，本发明方法在检出的灵敏度，准确性都显著优于现有的诊断方法，不仅填补了分子诊断法检测肌肉萎缩的盲区，而且操作简便。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Aμsμbel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic μpdates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 DKK-3在肌肉萎缩中高表达

(1)通过RT-qPCR检测Dkk-3是否在老年肌肉中高表达。取老年肌肉，提取总RNA，反转录后获得cDNA。以cDNA为模板，通过实时定量PCR(qPCR)检测Dkk-3mRNA的水平，并与年轻肌肉中的Dkk-3水平进行比较。表达水平提高3倍以上即认为Dkk-3表达水平增加。

具体实验方法：取老年(>65岁)肌肉样品40份和成年(18-30岁)肌肉样品10份(<50mg)，置于1.5ml EP管中，加入1mlTrizol，组织匀浆器匀浆2分钟。13,200rpm/min 4℃离心10分钟，上清转入另一干净EP管中。加入200μl酚：氯仿(24：1)，涡旋震荡充分混匀，13，200rpm/min 4℃离心15分钟。上清转入一干净EP管中，加入500μl异丙醇，充分混匀，13,200rpm/min 4℃离心15分钟。弃上清，用75％乙醇洗两次，每次13,200rpm/min 4℃离心5分钟。弃上清，室温放置5-10分钟晾干，加入30-50μl DEPC水溶解，此即为总RNA。然后将总RNA反转录为cDNA。取RNA1μg，加入1μl(200μnits)NEB公司MuLV反转录酶及其1x反应缓冲液，0.5mM dNTP混合物，4μM Oligo dT,1μl RNase inhibitor 42℃孵育1小时，反转录为cDNA。将cDNA在90℃灭活10分钟，作为PCR模板。使用如SEQ ID NO.3和4所示的正向和反向引物，进行实时荧光定量PCR检测目的基因的表达量。PCR条件为95℃ 10分钟，95℃ 30秒，60℃ 60秒，第二和第三步反复循环40次。

正向引物：tgaggcagtggctacacaag SEQ ID NO.3

反向引物：gctggtatggggttgagaga SEQ ID NO.4

采用GAPDH作为内参，所用引物序列为

GAPDH forward：ACCCAGAAGACTGTGGATGG SEQ ID NO.5

GAPDH reverse：ACACATTGGGGGTAGGAACA SEQ ID NO.6

同时检测肌肉中肌肉萎缩特异性基因atrogin的表达作为肌肉萎缩的标记。所用引物为：

Atrogin-1 forward：AGAGAGGCAGATTCGCAAGCGT SEQ ID NO.7

Atrogin-1 reverse：TGCAAAGCTGCAGGGTGACCC SEQ ID NO.8

RT-qPCR结果如图1所示，Dkk-3表达水平在老年肌肉中显著增加(亦即发生肌肉萎缩的肌肉中Dkk-3表达水平为正常肌肉中DKK-3表达水平的11.83倍)，肌肉萎缩特异性基因atrogin-1的表达水平在老年肌肉中也有显著上调。

(2)通过免疫荧光染色鉴定Dkk-3表达水平与肌肉直径之间的关系。取老年(65岁)肌肉，OCT包埋做冰冻切片。应用Dkk-3抗体和Lammin B抗体进行免疫荧光染色。Dkk-3抗体染色显示Dkk-3的表达水平，Lammin B显示肌纤维轮廓。通过统计肌纤维面积大小确定Dkk-3表达水平与肌纤维面积的关系。

小于100mg的老年或成年肌肉包埋于OCT中，置于液氮中冷冻30秒制成冰冻样品，用于制作冷冻切片，厚度8μm。切片用于lammin B免疫荧光染色，确定肌纤维轮廓，统计肌纤维大小。染色方法如下：冰冻切片用PBS洗3次。用4％甲醛固定，室温15分钟。用PBS洗3次，加入1％Tween20，室温10分钟。用PBS洗3次，加入在含有1％BSA的PBS中稀释200倍的Laminin抗体，室温孵育1小时。用PBS洗三次，每次5分钟。加入在含1％BSA PBS溶液中1：1000稀释的荧光标记的驴抗兔二抗，室温孵育1小时。用PBS洗一次，加入含有20μM DAPI的PBS,室温5分钟，用PBS洗三次，每次5分钟。加入抗猝灭剂后封片。在Zeiss激光共聚焦显微镜下观察拍照。如图2所示，老年肌纤维明显更小。进行统计学分析，结果如图3所示，老年小鼠肌纤维明显更小。

实施例2 Dkk-3与肌肉萎缩的相关性

我们发现成年(<60岁)肌肉中Dkk-3的表达量较低，但是老年(>65岁)肌肉中Dkk-3表达量较成年肌肉有明显的增加。在细胞实验中，我们发现自体内直接分离的原代肌纤维和在体外诱导肌肉干细胞分化而获得的终末分化的myotube中Dkk-3的表达量都较低。在终末分化的myotube中过表达Dkk-3会造成肌肉萎缩。体内实验表明，在小鼠肌肉中应用腺病毒载体过表达Dkk-3也会造成肌肉萎缩。

细胞实验：

(1)配置生长培养基：DMEM高糖培养基加入10％胎牛血清后混匀备用。

(2)配置分化培养基：DMEM高糖培养基中加入2％马血清后混匀备用。

(3)包装能够表达DKK-3的腺病毒(滴度：1.3x10¹⁰Tu/ml)，具体方法如下：

首先从NCBI上获取DKK-3CDS序列(NM_015814)，并设计PCR引物：

primer-F：GGGGTACCATGGACTACAAAGACCATGAC(SEQID NO.9)；

primer-R：GCTCTAGACTAAATCTCCTCCTCTCCGCC(SEQID NO.10)；

取一个10cm培养皿的C2C12细胞，吸弃培养液，加入1mlTrizol裂解细胞；加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000转/分钟4℃离心15分钟，取上层清亮液体，转入到新的EP管中；加入500ul异丙醇，充分混匀，12000转/分钟4℃离心15分钟，弃上清，向沉淀中加入1ml75％乙醇洗一次，弃上清后室温晾10分钟；加入40ul无RNA酶的水溶解，获得总的mRNA。分光光度法测mRNA浓度后，取1ug总RNA，加入1μl(200units)NEB公司MuLV反转录酶及其1x反应缓冲液，0.5mM dNTP混合物，4μM Oligo dT,1μl RNase inhibitor 42℃孵育1小时，反转录为cDNA。将cDNA在75℃灭活10分钟，作为PCR模板。用设计的PCR引物，加入1ulKOD聚合酶，1ul(10mM)的dNTP，PCR获得表达DKK-3的基因。(1.95℃5min；2.95℃变性30s；3.58℃退火30s；4.68℃延伸2min；5.68℃10min。第2-4步循环30次)PCR产物琼脂糖凝胶电泳回收后，用1ulNEB的Kpn1和Xbal1限制性内切酶37℃酶切2小时，1ug载体padTrack-GFP也用1ulNEB的Kpn1和Xbal1限制性内切酶37℃酶切2小时，琼脂糖凝胶电泳回收后，用1ulNEB的T4DNA连接酶室温连接5小时后，转化感受态细胞BJ5183，用Kpn1和Xbal1限制性内切酶酶切鉴定后，转染DH5α感受态细胞扩增质粒，提取质粒后，用Pac1限制性内 切酶线性化，胶回收后即可用于转染包装病毒的细胞293A。取10ug线性化好的表达质粒，磷酸钙沉淀法转染293A细胞(10ug质粒加入到250ul水中，加入250ul氯化钙溶液，充分混匀备用；取一个50ml离心管，加入500ul的2xHBS溶液，将备好的质粒-钙溶液逐滴加入到HBS溶液中，边加边充分震荡；加完后室温放置20分钟备用；长到约60％底面积的293A细胞取出，吸弃旧培养液，加入10ml生长培养(DMEM+10％FBS)，将前面备好的质粒钙沉淀悬液缓慢加入到培养基中，轻轻摇匀后置于37度，5％二氧化碳培养箱中培养；转染后16小时，更换新的生长培养基，继续培养。从48小时后，每日在荧光显微镜下观察，直至镜下所有的细胞都表达绿色荧光(一般需要7-10天)。收集所有的细胞及细胞培养液，1500转/分钟离心室温离心5分钟，弃上清，留细胞沉淀。用PBS洗两次后，加入500ulPBS重悬，用液氮-37度反复冻融法裂解细胞(冻融3次)，2000转/分钟室温离心5分钟，上清转到新的管子备用(即P1代病毒)。培养40盘(10cm培养皿)293A细胞至长到60％底面积，每盘加入10ulP1代病毒感染，24小时后每日镜下观察，直至所有细胞表达绿色荧光(一般需要2-3天)后，按照收P1代病毒同样的方法收取并裂解释放病毒(一般加入2mlPBS裂解细胞获得病毒)，至此即获得P2代病毒。测滴度后即可使用(后续如若需要更多的病毒，即按照获取P2代病毒的方法扩增即可)。

(4)细胞系培养：C2C12细胞从液氮中取出后迅速置于37℃水浴锅中溶解，加入到9ml生长培养基中，1500rpm/min室温离心5分钟后，弃掉上清，加入1ml生长培养基重悬后转入10cm培养皿中，补加9ml生长培养基，在37℃，5％二氧化碳条件下培养。C2C12细胞系分化为myotube：待C2C12细胞长至完全铺满整个培养皿之后，用PBS洗3次，加入10ml分化培养基，在37℃，5％二氧化碳条件下诱导分化3天。

(5)过表达DKK-3诱导由C2C12分化而来的myotube发生肌肉萎缩：更换新鲜10ml分化培养基，在对照组中加入10μl PBS，在实验组中加入Dkk-3腺病毒(滴度：1.3x1010TU/ml,MOI:1:5)，37℃，5％二氧化碳条件下培养72小时。在Zeiss荧光显微镜下观察拍照，并测量myotube的直径(图4A,B)。同时收集细胞，提取总蛋白，取40μg总蛋白进行SDS－PAGE电泳，转膜后用Flag抗体杂交(1：2000稀释，室温1小时)，检测带有Flag标签的过表达的Dkk-3。PBS洗3次(10分钟/次)后，加入1：1000稀释的驴抗鼠二抗，室温孵育1小时。PBS洗3次(10分钟/次)后，显色，检测过表达Flag标记的Dkk-3的表达(图4C)。

结果，如图4A所示：与空白对照组相比，过表达带有Flag标签的Dkk-3后，myotube的直径显著减小。如图4B：统计学分析显示，过表达Dkk-3后myotube直径的显著减小。如图4C：通过Western blot检测，带有Flag标签的Dkk-3在myotube中的确过表达。

(6)取加入Dkk-3腺病毒的实验组和对照组各一盘细胞，加入1ml Trizol后提取总RNA，各取1μg总RNA加入1μl(200units)NEB公司MuLV反转录酶及其1x反应缓冲液，0.5mM dNTP混合物，4μM Oligo dT,1μl RNase inhibitor 42℃孵育1小时，反转录为cDNA。将cDNA在90℃灭活10分钟，作为PCR模板。使用上面列出的正向和反向引物，进行实时荧光定量PCR检测目的基因的表达量。PCR条件为95℃ 10分钟，95℃ 30秒，60℃ 60秒，第二和第三步反复循环40次。采用GAPDH作为内参，所用引物序列为：

GAPDH forward:ACCCAGAAGACTGTGGATGG(SEQID NO.5)

GAPDH reverse:ACACATTGGGGGTAGGAACA(SEQID NO.6)

同时检测肌肉中肌肉萎缩特异性基因Atrogin1(NM_026346.3)和Atrogin1(NM_026346.3)的表达作为肌肉萎缩的标记。

所用引物序列为：

Atrogin-1 forward:AGAGAGGCAGATTCGCAAGCGT(SEQID NO.7)

Atrogin-1 reverse:TGCAAAGCTGCAGGGTGACCC(SEQID NO.8)

采用NEB的MuLv反转录酶反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR检测肌肉萎缩标记物Atroign1的mRNA表达水平。结果如图5所示，过表达Dkk-3能上调Atrogin1的表达水平，造成肌肉萎缩。

动物实验：

表达带有GFP标签的DKK-3腺病毒，滴度为1.3x10¹⁰TU/ml。

包装能够表达DKK-3的腺病毒(滴度：1.3x10¹⁰TU/ml)的具体方法如下：

首先从NCBI上获取DKK-3CDS序列(NM_015814)，设计PCR引物：

primer-F：GGGGTACCATGGACTACAAAGACCATGAC(SEQID NO.7)；

primer-R:GCTCTAGACTAAATCTCCTCCTCTCCGCC(SEQID NO.7)。

取一个10cm培养皿的C2C12细胞，吸弃培养液，家入1mlTrizol裂解细胞；加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000转/分钟4度离心15分钟，取上层清亮液体，转入到新的EP管中；加入500ul异丙醇，充分混匀，12000转/分钟4度离心15分钟，弃上清，向沉淀中加入1ml75％乙醇洗一次，弃上清后室温晾10分钟；加入40ul无RNA酶的水溶解，获得总的mRNA。测浓度后，取1ug总RNA，加入1μl(200units)NEB公司MuLV反转录酶及其1x反应缓冲液，0.5mM dNTP混合物，4μM Oligo dT,1μl RNase inhibitor 42℃孵育1小时，反转录为cDNA。将cDNA在75℃灭活10分钟，作为PCR模板。用设计的PCR引物PCR获得表达DKK-3的基因，Kpn1和Xbal1限制性内切酶37℃酶切2小时，载体 padTrack-GFP也用Kpn1和Xbal1限制性内切酶37℃酶切2小时，琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶室温连接5小时后，转化感受态细胞BJ5183，用Kpn1和Xbal1限制性内切酶酶切鉴定后，转染DH5α感受态细胞扩增质粒，提取质粒后，用Pac1限制性内切酶线性化，胶回收后即可用于转染包装病毒的细胞293A。取10ug线性化好的表达质粒，磷酸钙沉淀法转染293A细胞(10ug质粒加入到250ul水中，加入250ul氯化钙溶液，充分混匀备用；取一个50ml离心管，加入500ul的2xHBS溶液，将备好的质粒-钙溶液逐滴加入到HBS溶液中，边加边充分震荡；加完后室温放置20分钟备用；长到约60％底面积的293A细胞取出，吸弃旧培养液，加入10ml生长培养(DMEM+10％FBS)，将前面备好的质粒钙沉淀悬液缓慢加入到培养基中，轻轻摇匀后置于37度，5％二氧化碳培养箱中培养；转染后16小时，更换新的生长培养基，继续培养。从48小时后，每日在荧光显微镜下观察，直至镜下所有的细胞都表达绿色荧光(一般需要7-10天)。收集所有的细胞及细胞培养液，1500转/分钟离心室温离心5分钟，弃上清，留细胞沉淀。用PBS洗两次后，加入500ulPBS重悬，用液氮-37度反复冻融法裂解细胞(冻融3次)，2000转/分钟室温离心5分钟，上清转到新的管子备用(即P1代病毒)。培养40盘(10cm培养皿)293A细胞至长到60％底面积，每盘加入10μl P1代病毒感染，24小时后每日镜下观察，直至所有细胞表达绿色荧光(一般需要2-3天)后，按照收P1代病毒同样的方法收取并裂解释放病毒(一般加入2mlPBS裂解细胞获得病毒)，至此即获得P2代病毒。测滴度后即可使用(后续如若需要更多的病毒，即按照获取P2代病毒的方法扩增即可)。

方法：将50μl滴度为1.3x10¹⁰TU/ml的表达DKK-3的腺病毒通过肌肉注射，注射进小鼠左腿胫骨前肌中，右腿胫骨前肌注射50μl滴度为1.3x10¹⁰TU/ml的空载体腺病毒作为对照，每天注射一次，连续注射7天后，等待10天。然后取小鼠胫骨前肌，包埋于包埋剂OCT中，制成冰冻切片。通过苏木精-伊红染色(HE染色)显示肌纤维轮廓，比较肌纤维直径大小。染色方法如下：将冰冻切片用PBS洗两次，5分钟/次；苏木精染色1分钟，自来水冲洗20分钟；30％乙醇中孵育5分钟；50％乙醇中孵育5分钟；70％乙醇中孵育5min；95％乙醇中孵育5min；在伊红染料中染色10秒；95％乙醇中孵育5分钟；100％乙醇中孵育5分钟；100％乙醇中孵育5分钟；二甲苯：EtOH＝1:1溶液中孵育10分钟；二甲苯中孵育10分钟；晾干后用树脂胶封片。显微镜下拍照，统计肌纤维的直径(图6)。具体的，如图6A所示，在小鼠肌肉中过表达带有GFP标签的Dkk-3诱导肌肉萎缩；如图6B所示，统计学分析显示，过表达带有GFP标签的Dkk-3比只表达GFP的肌肉的直径明显要小。

实施例3试剂盒的制备

如实施例1和2所述，Dkk-3蛋白的表达异常与肌肉萎缩密切相关。因此，可根据此设计Dkk-3基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，所述试剂盒含有：

抽取待测病人的肌肉组织，使用常规方法或使用特定的抽提试剂盒，从中提取mRNA，并转录为cDNA。将肌肉萎缩试剂盒中的PCR引物稀释，检测DKK-3表达量，并与正常对照进行比较，从而确定Dkk-3蛋白的表达量高低。

检测结果，Dkk-3蛋白的表达量高于正常对照(表达量高3倍)的检测对象的肌肉萎缩易感性高于正常人群。

实施例4试剂盒的制备

检测试剂盒的制备

在本实施例中，用抗Dkk-3蛋白的抗体制备以下检测试剂盒：

如实施例1和2所述，Dkk-3蛋白的表达异常与肌肉萎缩密切相关。因此，可根据此应用商品化或自制备的Dkk-3抗体，免疫组织化学方法检测肌肉组织中的DKK-3蛋白的表达。

制备一试剂盒(100人次)，所述试剂盒含有：

成分 数量

山羊抗人Dkk-3多抗(购自R&D公司)0.5毫升，浓度为200μg/ml使用前作1：1000稀释。

使用前，临床新鲜肌肉标本常规制备冰冻切片，加入山羊抗人Dkk-3多克隆抗体，室温孵育，检测阳性信号，镜下计算阳性细胞比例并评分，评分值大于正常肌肉组织3倍为有显著差异。

结果在85％以上(在28例检测的肌肉萎缩病例中有25例)的肌肉萎缩病例中Dkk-3 有高表达，肌肉萎缩组织中的表达量：正常肌肉组织中的表达量≥3.0。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。