一种检测人羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种检测人羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用。

背景技术：

羧酸酯酶(Carboxylesterases，CE)是α/β水解酶折叠蛋白家族的重要成员之一，在机体内分布广泛。该酶参与多种药物、前体药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢，能有效催化羧酸酯类、氨甲酸酯类、酰胺类、硫酯类等外源性物质的水解。在人体中，羧酸酯酶主要包括人羧酸酯酶1(hCE1)和人羧酸酯酶2(hCE2)两个亚型，二者在组织分布和底物特异性上存在显著差异。hCE2在人肠道和肿瘤组织中高表达，在提高很多前药的口服生物利用度中起着十分重要作用，并且其活性也会影响很多酯类抗癌试剂(如伊立替康和卡培他汀)的疗效。机体羧酸酯酶的组织分布与功能差异不仅决定其处置酯类外源物的能力，还与肥胖、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、脂肪肝等代谢综合症，以及多种癌症的发生发展密切相关。因此，精确测量不同生物体系中hCE2的真实活性在临床上意义十分重大。

截至目前，hCE2的定量方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹法(Western Blotting)、质谱法等。上述方法虽然特异性较好，但均需要价格昂贵的抗体、肽段或专门的仪器，且制备样品的过程复杂耗时，更重要的是这些方法都是测定的hCE2的蛋白含量而不是它的真实活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测人羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用，本发明提供了一种hCE2活性检测的试剂盒及其使用方法与应用。该试剂盒 使用N-正丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位氨基被氯乙酰取代的衍生物作为hCE2荧光探针底物，探针经hCE2水解后可生成具有良好荧光属性的水解产物。基于单位时间产物的生成量来表示酶的活性。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。

一种检测人羧酸酯酶2的试剂盒，该试剂盒包括4种试剂：A液、B液、C液和质控标准品；

所述A液为：pH＝7.4,100mM磷酸盐缓冲液，

所述B液为0.1～10mM的NCEN溶液，溶剂为甲醇、乙腈、二甲基亚砜中任意一种，

所述C液为乙腈或甲醇，

所述质控标准品为5mg/ml的hCE2水溶液。

一种检测人羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法，具体按下面步骤进行：

(1)预孵育：将待测样品与A液混匀，20～60度下孵育3～5分钟；

(2)起始反应：加入B液混匀，20～60度下孵育10～120分钟；

(3)终止反应：加入C液，剧烈震荡10秒；

(4)检测：离心后取上清于酶标仪或生化仪检测荧光值，检测条件为：底物激发波长354nm，发射波长452nm；产物激发波长430nm，发射波长542nm。

所述待测样品为：重组表达的人羧酸酯酶2单酶、人组织制备液、各类组织细胞或其他生物体系；

一种检测人羧酸酯酶2的试剂盒的应用，该试剂盒用于人羧酸酯酶2活性的快速定量检测，以及该酶抑制剂的快速筛选与评估。

所述试剂盒用于人羧酸酯酶2活性的快速定量检测的方法为：荧光底物NCEN可被人羧酸酯酶特异性水解为与发射波长更长的荧光产物NAH；按照试剂盒的使用方法，通过定量检测单位时间内底物的消除量以及水解产物的生成量来测定不同样本中人羧酸酯酶2的活性。

该试剂盒用于人羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估方法为：以荧光底物NCEN水解反应作为hCE2的特异性探针反应，按照试剂盒的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中hCE2的残余活性，进而实现hCE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。该试剂盒检测原理是利用人羧酸酯酶2能催化水解酰胺键的特性，设计一种具有酰胺键的荧光母体分子NCEN(λex＝354nm，λem＝452nm)，NCEN可被hCE2特异地识别与催化，在生理pH条件下水解生成一种新的荧光产物(λex＝430nm，λem＝542nm)，产物和底物荧光强度的比值与hCE2的含量成正比。利用该探针反应可对多种生物体系中hCE2的分布和功能进行定量评价。其检测原理如图1所示。

试剂盒中使用的荧光化合物NCEN其原型和水解产物的荧光发射波长具有明显差异，且产物更易检测。荧光检测条件为：底物激发波长354nm，在384～600nm进行荧光发射谱的检测；产物的激发波长为430nm，在460～700nm进行荧光发射谱的检测；该方法可用作人羧酸酯酶2活性快速定量检测，以及该酶抑制剂的快速筛选与评估。

本发明所述特异性检测人羧酸酯酶(hCE2)的试剂盒的应用领域，包括但不限于重组表达的hCE2酶、含有hCE2的细胞及组织制备物等生物样品中hCE2活性的定量测定。

本发明提供的检测人羧酸酯酶2(hCE2)的试剂盒的应用，需注意所述底 物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。

本发明所提供的检测人羧酸酯酶2(hCE2)的试剂盒，底物分子NCEN及水解产物均具有良好的荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长300～500nm，在400～700nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应hCE2活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中hCE2酶活的定量测定。

本发明中试剂盒可用于重组羧酸酯酶、细胞或组织制备液等多种生物体系中hCE2酶活的定量测定，还可用于快速筛选hCE2酶的抑制剂及抑制能力的定量评价(如图5-图6所示)。

采用hCE2单酶或微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学等多方面的证据，证明NCEN可特异性的经羧酸酯酶2代谢生成相应的水解产物(如图3-图5所示)。

选用本发明所述检测人羧酸酯酶2试剂盒及其使用方法具有以下突出优势：

(1)高特异性：N-正丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺母体C-4位氨基取代的氯乙酰酯类衍生物NCEN可被hCE2高特异性地代谢成一个代谢产物，即C-4位酰胺键断裂的水解产物；

(2)廉价易得：底物NCEN及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行；

(3)高灵敏度：具有N-正丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺母体结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(400～700nm)，反应的底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可经比率法通过绘制标准曲线进行定量测定，检测下限为5ng/ml。

(4)高通量：利用该类荧光探针底物可实现96,386孔板的快速检测，可实现 每日2万个样品的高通量检测，具有单个测试成本低廉(<0.5元)的优势。

附图说明

图1.hCE2试剂盒的检测原理

图2.hCE2试剂盒的特异性评估；

图3.加入hCE2前后的荧光发射光谱图(产物和底物分别在354nm或430nm进行激发)；

图4.hCE2检测标准曲线；

图5.hCE2抑制剂筛选；

图6.hCE 2活性的个体差异分析；

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。hCE2试剂盒的检测原理如图1所示。

实施例1

重组表达人单酶中的选择性

(1)含有羧酸酯酶1b、羧酸酯酶1c、羧酸酯酶2、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碳酸酐酶、а-糜蛋白酶(10μg/mL)、乙酰胆碱酯酶(5U/L)、丁酰胆碱酯酶(20U/L)、对氧磷酶1、对氧磷酶2(5μg/mL)、人血清白蛋白(500μg/mL)、牛血清白蛋白(500μg/mL)的A液198μL，于37℃条件下震荡预孵5分钟；

(2)加入2μL的B液(NCEN终浓度为10μM)起始反应，37度震荡孵育；

(3)90分钟后，加入200μL的C液，剧烈震荡后，终止反应；

(4)分别检测底物分子NCEN(λ_ex＝354nm，λ_em＝452nm)和水解产物(λ_ex ＝430nm，λ_em＝542nm)在采集波长处的荧光强度值，计算底物与产物的荧光强度比值(见图2)。

实施例2.

羧酸酯酶2定量标准曲线的绘制

(1)采用5mg/mL的人羧酸酯酶2(hCE2)的标准溶液，先采用A液稀释成100μg/mL，再稀释成不同浓度的标准品工作液(0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μg/mL)，37℃下预孵育5min；

(2)向每个所述溶液样本(198μL)中加入2μL的B液(NCEN终浓度为10μM)，37℃震荡孵育60min，加入200μL的C液剧烈震荡15秒钟终止反应；

(3)分别检测探针分子NCEN(λ_ex＝354nm，λ_em＝452nm)和水解产物NAH(λ_ex＝430nm，λ_em＝542nm)在采集波长处的荧光强度值，将NCEN与NAH的荧光强度比值对hCE2浓度进行线性拟合作图，建立人羧酸酯酶2的定量标准曲线；曲线方程为Y＝0.1653*X-0.09711，相关系数平方为0.98(见图4)。

实施例3

洛哌丁胺的抑制实验

(1)hCE2重组表达单酶(5μg/mL)、人肝微粒体(10μg/mL)、人肠微粒体(10μg/mL)各198μL，于37℃条件下震荡预孵5分钟；

(2)向反应体系中加入1μL羧酸酯酶hCE2的阳性抑制剂洛哌丁胺终浓度(0-100μM)，继续孵育5分钟；

(3)加入2μL的B液(NCEN终浓度为10μM)起始反应；

(3)60分钟后，加入200μL的C液，剧烈震荡后，终止反应；

(4)进行荧光检测(λ_ex＝354nm，λ_em＝452nm；λ_ex＝430nm，λ_em＝542nm)；计算荧光强度比值，根据各组在542nm与452nm下的荧光强度比值与DMSO组 的比值计算hCE2的抑制强度(见图5)。

实施例4.

不同个体来源肝微粒体中hCE2的活性定量评估

(1)选取14例人肝微粒体(HLM)稀释至10μg/ml，准备hCE2代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液(100mM)、人肝微粒体(10μg/ml mg/ml)，于37℃条件下震荡预孵5分钟；

(2)向反应体系中加入2μl的B液(NCEN终浓度为10μM)起始反应；

(3)60分钟后，加入200μl的C液，剧烈震荡后，终止反应；

(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心5分钟后，取上清，进行荧光检测(λ_ex＝354nm，λ_em＝452nm；λ_ex＝430nm，λ_em＝542nm)，计算单位时间内产物的生成率从而得到14例人肝微粒体(HLM)对探针的代谢速率(图6)。