一种选择性计数酸奶中保加利亚杆菌的方法与流程

本发明属于乳品微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种选择性计数酸奶中保加利亚杆菌的方法。

背景技术：

联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)将酸奶定义为乳与乳制品(杀菌乳或浓缩乳)在保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)和嗜热链球菌(S.thermophilus)的作用下经乳酸发酵而得到的凝乳状乳制品，在最终发酵产品中必须大量存在这些微生物。

保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)和嗜热链球菌(S.thermophilus)在酸奶中起着极为重要的作用，主要体现在以下两个方面：

1)嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的活菌数对酸奶质量品质有着重要的影响，直接影响到产品的风味以及感官质量；

2)酸奶对人类健康的有益作用已被科学研究所证实，而其中的活性乳酸菌起着极其重要的作用。

为此，国际乳品联合会(IDF)制定的标准要求在酸奶中的活菌数必须达到一定数量(每g或mL产品中不低于10⁶cfu)，因此酸奶制品在生产和销售过程中对其中的活菌数进行准确评估是至关重要的。

目前，选择性计数保加利亚乳杆菌培养基的研究主要集中在乳酸杆菌(LB)培养基和酸化的MRS培养基。乳酸杆菌(LB)培养基可以通过嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌在其培养基中的不同菌落形态而将它们分离，但因为两种菌可以同时生长，仅依靠菌落形态差别很容易造成误判。鲁慧峰,王慧在酸奶中特征菌检测计数方法的研究，中国乳业，2010,(7)：46-47中指出，用醋酸将MRS培养基的pH值调节至5.40可以抑制嗜热链球菌的生长；Van de Casteele等人在Evaluation of culture media for selective enumeration of probiotic strains of lactobacilli and bifidobacteria in combination with yoghurt or cheese starters，International Dairy Journal,2006,16(12):1470-1476中将MRS培养基的pH调为5.20，也能达到相同的目的。但利用酸化MRS培养基的方法不具有普遍适用性，在有些情况下，嗜热链球菌也在其上生长。目前公认的最有效的方法是Tharmaraj N,Shah N P.在Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus acidophilus,bifidobacteria,Lactobacillus casei,Lactobacillus rhamnosus,and propionibacteria[J].Journal of Dairy Science,2003,86(7):2288-2296中公开的方法，即MRS固体培养基pH值调整到4.58，在温度45℃下厌氧培养72h，在这种条件下不适合嗜热链球菌生长，而保加利亚乳杆菌生长受到的影响较小，而这种方法的缺点在于MRS固体培养基成分多，成本高，培养条件所要求的厌氧条件也很严格，培养时间为72h也较长，因此在实际应用中存在一定的不足。

为了解决上述现有技术问题，本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量实验工作与分析研究，终于完成了本发明。

技术实现要素：

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种选择性计数酸奶中保加利亚杆菌的方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种选择性计数酸奶中保加利亚杆菌的方法。

该方法包括选择适于保加利亚乳杆菌生长的选择性计数培养基、往所述的培养基中加入抑制嗜热链球菌生长的无水乙酸钠、调整计数培养基pH与调整计数培养温度的步骤。

根据本发明的一种优选实施方式，所述选择性计数培养基的必需营养成分组成如下：以重量份计

根据本发明的另一种优选实施方式，所述选择性计数培养基的必需营养成分组成如下：以重量份计

根据本发明的另一种优选实施方式，所述选择性计数培养基的必需营养成分组成如下：以重量份计

根据本发明的另一种优选实施方式，在所述选择性计数培养基中，无水乙酸钠的添加量是23.0～27.0重量份。

根据本发明的另一种优选实施方式，在所述选择性计数培养基中，无水乙酸钠的添加量是24.2～25.8重量份。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的选择性计数培养基的pH是6.6～7.0。

根据本发明的另一种优选实施方式，保加利亚杆菌在所述的选择性计数培养基中在温度37℃下培养48h。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种选择性计数酸奶中保加利亚杆菌的方法。

该方法包括选择适于保加利亚乳杆菌生长的选择性计数培养基、往所述的培养基中加入抑制嗜热链球菌生长的无水乙酸钠、调整计数培养基pH与调整计数培养温度的步骤。

具体地，采用常规方法进行菌株活化如下：

制备MRS液体培养基：将10g大豆蛋白胨、4g酵母粉、1g吐温80、5g乙酸钠、0.2g MgSO₄·7H₂O、5g牛肉膏、20g葡萄糖、2g K₂HPO₄、2g柠檬酸三铵与0.05g MnSO₄·4H₂O溶于1000mL蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱将其pH值调节至6.80，然后在温度121℃下灭菌15min，得到所述的MRS液体培养基。

按照MRS液体培养基质量的1.5％，往所述MRS液体培养基中添加琼脂能够得到MRS固体培养基。

制备AST液体培养基：将10g胰蛋白胨、10g蔗糖、5g酵母粉与2g K₂HPO₄蒸馏水溶于1000mL蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱将其pH值调节至6.80，然后在温度121℃下灭菌15min，得到所述的AST液体培养基。

按照AST液体培养基质量的1.5％，往所述AST液体培养基中添加琼脂能够得到AST固体培养基。

以从内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的分离自传统发酵乳而获得的4株嗜热链球菌NM84-1、G80-1、G80-3与ND03、从内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的分离自传统发酵乳而获得的4株保加利亚乳杆菌ND02、S21-4、QH11-3、ML12-2-2作为试验菌株。在镜检为纯菌后，按照常规方法分别将嗜热链球菌接种于AST液体培养基中，保加利亚乳杆菌接种于MRS液体培养基中进行活化两代；培养物通过离心分离收集菌泥，接着用浓度以重量计0.85％的灭菌生理盐水洗涤2次，然后重悬于2mL无菌水中得浓缩菌液，此浓缩菌液的菌密度经常规平板计数为约10⁹cfu/mL，所有的菌株在MRS琼脂培养基中在温度37℃下培养48h计数得到活菌数为(1～2)×10⁹cfu/mL。

本发明保加利亚乳杆菌选择性培养基研究结果描述如下。

首先，确定培养基基本成分。分别选用葡萄糖和胰蛋白胨、乳糖和胰蛋白胨、蔗糖和大豆蛋白胨、葡萄糖和大豆蛋白胨、乳糖和大豆蛋白胨作为保加利亚乳杆菌选择性培养基中的碳、氮源，并添加酵母粉及K₂HPO₄成分，得到不同的固体培养基。

将前面制备的保加利亚乳杆菌菌体浓缩液分别接种于不同固体培养基上，并以MRS琼脂培养基为对照组，观测不同碳、氮源对保加利亚乳杆菌生长的影响，从中选出使保加利亚乳杆菌生长最好的碳、氮源组合作为其选择性培养基的基本组成，然后进行后续试验。

该试验使用培养基基本组成及培养条件如下：8.8-11.2g碳源、8.5-11.5g氮源、4.6-5.4g酵母粉、1.8-2.2g K₂HPO₄与1000mL蒸馏水；将培养基pH值调为6.60～7.00，在温度121℃下灭菌15min，得到该试验使用培养基。试验结果列于表1中。

表1保加利亚乳杆菌在不同碳、氮源培养基上的活菌数[log(cfu/mL)]

注：相同字母表示无统计学差异；不同字母表示存在显著性差异(p<0.05)，下同。

试验结果表明当碳、氮源组合为葡萄糖、大豆蛋白胨时，四株保加利亚乳杆菌生长良好，其活菌数与对照组MRS培养基的相比，无显著性差异(P>0.05)。且在以葡萄糖、大豆蛋白胨为碳、氮源的培养基上的单菌落(直径约为0.3～0.5mm)比其他组上的(直径约为0.1～0.3mm)大，较容易观察计数，具体参见附图1。

根据本发明，所述选择性计数培养基的必需营养成分组成如下：以重量份计

优选地，所述选择性计数培养基的必需营养成分组成如下：以重量份计

更优选地，所述选择性计数培养基的必需营养成分组成如下：以重量份计

其次，确定不同浓度乙酸钠对嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌生长的影响。

在上述确定的碳源与氮源组合培养基中加入以所述培养基质量计0.0％、1.8～2.2％、2.3～2.7％乙酸钠，将前面得到的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌体浓缩液分别接种于含有不同浓度乙酸钠的培养基中，观察它们对菌株生长的影响。试验结果列于表2中。

表2：ST和LB在不同浓度乙酸钠的培养基中的活菌数[log(cfu/mL)]

表2列出的试验结果表明，添加2.3～2.7％的乙酸钠可以抑制嗜热链球菌的生长，而对保加利亚乳杆菌的生长没有显著影响。

因此，在所述选择性计数培养基中，无水乙酸钠的添加量是23.0～27.0重量份。

优选地，在所述选择性计数培养基中，无水乙酸钠的添加量是24.2～25.8重量份。

第三，确定所述选择性计数培养基的不同pH值对嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌生长的影响。

在上述确定成分的选择性计数培养基中调节不同的pH值，将前面得到的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌体浓缩液分别接种于不同pH值的培养基中，观察它们对菌株生长的影响。试验结果列于表3中。

表3：ST和LB在不同pH值培养基中的活菌数[log(cfu/mL)]

表3列出的试验结果表明，与对照组MRS相比，选择性计数培养基可以明显地抑制四株嗜热链球菌的生长；当选择性计数培养基pH调整为5.0～5.4时，会对保加利亚乳杆菌ND02和QH11-3的生长造成显著影响，与对照组MRS及pH 6.6～7.0的选择性计数培养基相比，两株杆菌活菌数显著减少，而pH 6.6～7.0的选择性计数培养基与对照组MRS相比，四株保加利亚乳杆菌活菌数没有显著性差异。

表3的试验结果表明，所述的选择性计数培养基的pH是6.6～7.0。

第四，确定培养温度与培养时间对嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌生长的影响。

将前面得到的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌体浓缩液分别接种于选择性计数培养基中，将其分别在不同培养时间和培养温度下培养，观察不同培养条件对菌株生长的影响。试验结果列于表4中。

表4：ST和LB在不同培养温度与培养时间下的活菌数[log(cfu/mL)]

表4列出的试验结果表明，当培养时间在24h时，保加利亚乳杆菌因为培养时间短，均未生长；当培养时间在48h时及以上时，与对照组MRS相比，四株保加利亚乳杆菌活菌数没有显著性差异，在37℃及45℃不同培养温度下，四株保加利亚乳杆菌活菌数没有显著差异。因此从缩短培养时间以及节省能源的角度出发，选择37℃下培养48h。

试验结果表明，保加利亚杆菌在所述的选择性计数培养基中在温度37℃下培养48h。

利用本发明选择性计数培养基可以使嗜热链球菌的活菌数从10⁸cfu/mL降到10⁶cfu/mL以下，而保加利亚乳杆菌的活菌数与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。且保加利亚乳杆菌在培养基上菌落为白色，椭圆形，边缘光滑，单菌落的直径约为0.3～0.5mm，具体参见附图2。

本发明培养基成分较少，成本较便宜，培养条件简单易实现，克服了现有用于选择性计数酸奶中保加利亚乳杆菌的MRS固体培养基存在的技术缺陷。

[有益效果]

本发明的有益效果是：利用本发明选择性计数培养基及其培养条件可以使嗜热链球菌的活菌数从10⁸cfu/mL降到10⁶cfu/mL以下，而保加利亚乳杆菌的活菌数与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。本发明培养基成分较少，成本较便宜，培养条件简单易实现，克服了现有用于选择性计数酸奶中保加利亚乳杆菌的MRS固体培养基存在的技术缺陷。

【附图说明】

图1是保加利亚乳杆菌ML12-2-2在葡萄糖与胰蛋白胨培养基上和在葡萄糖与大豆蛋白胨培养基上的菌落形态图；

图中：

A、添加葡萄糖与胰蛋白胨的培养基

B、添加葡萄糖与大豆蛋白胨的培养基

图2是保加利亚乳杆菌ML12-2-2和嗜热链球菌G80-1在本发明选择性培养基上的菌落形态图。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：

该实施例的实施步骤如下：

制备MRS液体培养基：将10g大豆蛋白胨、4g酵母粉、1g吐温80、5g乙酸钠、0.2g MgSO₄·7H₂O、5g牛肉膏、20g葡萄糖、2g K₂HPO₄、2g柠檬酸三铵与0.05g MnSO₄·4H₂O溶于1000mL蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱将其pH值调节至6.80，然后在温度121℃下灭菌15min，得到所述的MRS液体培养基。按照MRS液体培养基质量的1.5％，往所述MRS液体培养基中添加琼脂能够得到MRS固体培养基。

制备AST液体培养基：将10g胰蛋白胨、10g蔗糖、5g酵母粉与2g K₂HPO₄蒸馏水溶于1000mL蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱将其pH值调节至6.80，然后在温度121℃下灭菌15min，得到所述的AST液体培养基。按照AST液体培养基质量的1.5％，往所述AST液体培养基中添加琼脂能够得到AST固体培养基。

菌株活化：以从内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的分离自传统发酵乳而获得的4株嗜热链球菌NM84-1、G80-1、G80-3与ND03、从内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的分离自传统发酵乳而获得的4株保加利亚乳杆菌ND02、S21-4、QH11-3、ML12-2-2作为试验菌株。在镜检为纯菌后，按照常规方法分别将嗜热链球菌接种于AST液体培养基中，保加利亚乳杆菌接种于MRS液体培养基中进行活化两代；培养物通过离心分离收集菌泥，接着用浓度以重量计0.85％的灭菌生理盐水洗涤2次，然后重悬于2mL无菌水中得浓缩菌液，此浓缩菌液的菌密度经常规平板计数为约10⁹cfu/mL，所有的菌株在MRS琼脂培养基中在温度37℃下培养48h计数得到活菌数为(1～2)×10⁹cfu/mL。

以从内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的分离自传统发酵乳而获得的4株嗜热链球菌NM84-1、G80-1、G80-3与ND03、从内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的分离自传统发酵乳而获得的4株保加利亚乳杆菌ND02、S21-4、QH11-3、ML12-2-2作为试验菌株。在镜检为纯菌后，按照常规方法按照1％～2％接种量将嗜热链球菌接种于AST液体培养基中，按照1％～2％接种量将保加利亚乳杆菌接种于MRS液体培养基中进行活化两代；培养物通过离心分离收集菌泥，接着用浓度以重量计0.85％的灭菌生理盐水洗涤2次，然后重悬于2mL无菌水中得浓缩菌液，此浓缩菌液的菌密度经常规平板计数为约10⁹cfu/mL，所有的菌株在MRS琼脂培养基中在温度37℃下培养48h计数得到活菌数为(1～2)×10⁹cfu/mL。

凝乳的制备：将由恒天然有限公司以商品名skimmed milk powder销售的脱脂乳粉溶解于蒸馏水中，配制成以质量计10％的溶液，然后让这种溶液在温度121℃下灭菌7分钟，再快速冷却至室温，接着往冷却的脱脂乳溶液中分别接种在前面制备的菌体浓缩液，并在温度37℃下培养至凝乳。

将0.5mL凝乳移取到4.5mL浓度为以重量计0.85％的灭菌生理盐水中，以10倍梯度进行稀释，取1mL 10^-6、10^-7稀释度的菌液移入平板中，采用倾注平板计数法，每个株菌分别用下面三组培养基计数，每种培养基计三次平行样，活菌数以cfu/mL表示。

A、空白组是常规MRS琼脂培养基，pH6.80，在温度37℃下有氧培养48h；

B、验证组是MRS琼脂培养基，pH值4.58，在温度45℃下厌氧培养72h；

C、试验组是本发明选择性保加利亚乳杆菌培养基，pH6.60～7.00，在温度37℃下有氧培养48h。

其试验结果列于表5中。

表5：ST和LB分别在不同培养基中的活菌数[log(cfu/mL)]

表5的结果显示，在P<0.05的水平下，(ST)四株嗜热链球菌在乙酸钠浓度为2.5％时，活菌数<10⁶cfu/mL。而四株保加利亚乳杆菌在不同浓度乙酸钠下，其活菌数与空白组无显著性差异(P>0.05)。因此，确定本发明选择性计数保加利亚乳杆菌培养基中乙酸钠浓度为以质量计2.5％。

实施例2：

该实施例的实施步骤如下：

按照实施例1描述的方式制备MRS液体培养基、AST液体培养基与菌株活化。

酸奶制备：将活化嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌两两组合，各取200μL共同接种于10mL脱脂乳中，在温度42℃培养箱中发酵3～4h至凝乳。取0.5mL凝乳转移到4.5mL浓度为以重量计0.85％的灭菌生理盐水中，以10倍梯度进行稀释，取1mL稀释度10^-6，10^-7的菌液移入平板中，采用倾注平板计数法，每株菌分别用下面的培养基计数，每种培养基计三次平行样，活菌数以cfu/mL表示。

A、常规MRS琼脂培养基，pH6.80，在温度37℃下有氧培养48h，以此用来计酸奶中总活菌数；

B、常规AST琼脂培养基，pH6.80，在温度37℃下有氧培养18h，以此用来计酸奶中嗜热链球菌的活菌数；

C、验证组为已被研究所证明的保加利亚乳杆菌选择性计数MRS固体培养基，pH4.58，在温度45℃下厌氧培养72h；

D、试验组为本发明保加利亚乳杆菌选择性计数培养基，pH6.60～7.00，在温度37℃下有氧培养48h。

这些试验的试验结果列于表6与表7中。

酸奶中总活菌数和嗜热链球菌活菌数的试验结果列于表6中。

表6：酸奶中ST和总菌的活菌数[lg(cfu/mL)]

表6的结果表明，使用MRS固体培养基的总活菌数远远大于AST固体培养基的嗜热链球菌活菌数，说明有保加利亚乳杆菌的生长。

表7：酸奶中LB在不同选择性计数组中的活菌数[lg(cfu/mL)]

表7的结果显示，试验组中的活菌数与验证组的选择性计数保加利亚乳杆菌培养基的活菌数没有发生显著性变化(P>0.05)，证明本发明培养基并没有影响保加利亚乳杆菌的正常生长，同时也表明嗜热链球菌的生长明显被抑制。

结合表6与表7的试验结果可以知道嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌分别在各自的选择性培养基上的活菌数之和与在正常MRS培养基上的总菌数相近，表明酸奶中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌两种菌都能正常生长。