一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法与流程

本发明涉及一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法，涉及酶检测和高通量筛选筛选，属于新型生物催化剂挖掘领域。

背景技术：

基于酶和微生物细胞的生物催化是生产重要化学品的高效、绿色路线，并正在取代传统的化学合成路径，广泛应用于生产精细化学品和药物的工艺中。氧化还原酶是六大酶内中所占比重最大的一类，可用于手性化合物的生物合成、医疗诊断试剂盒、辅酶再生体系、生物感应器以及污染物生物降解等。氧化还原酶被用于不对称合成手性药物、合成或修饰聚合物及构建生物感应器等各个方面。其中NADH或NADPH依赖型氧化还原酶在手性合成中有着重要的作用，例如催化醛、酮、羰基以及烯烃碳碳双键的还原，使许多潜手性物质转化为手性产品应用于医药、食品、精细化工等领域。

在生物催化过程中，为了克服底物或产物溶解度低等限制，添加有机溶剂是工业上疏水性化合物生物转化工艺中普遍采用的方法。相比于水相生物催化，非水相生物催化有很多潜在的优势：如更高的底物溶解性、减少副反应以及可调节酶的特异性等。因此，非水相生物催化技术在手性中间体及药物合成、精细化学品和生物能源生产等领域日益受到关注。但目前非水相体系酶催化的研究集中于脂肪酶以及酯酶等水解酶，对氧化还原酶的报道较少，因为大部分氧化还原酶在有机溶剂中容易失活。究其原因，主要是自然界耐受有机溶剂的氧化还原酶少，因此往往难以获得新型的目标催化剂。因此，开发耐有机溶剂的氧化还原酶对推进非水相酶催化工艺的广泛应用和深入发展具有重要的意义。

目前，非水相生物催化技术的研究一方面集中在发现和筛选溶剂耐受性生物催化剂，利用合理设计及定向进化等技术改造酶以提高热稳定性或选择性；另一方面则致力于探索与构建生物相容且与生物催化剂性能匹配的非水相介质。如何高通量筛选获得耐受有机溶剂的生物催化剂是该领域研究的前沿热点。高通量耐有机溶剂氧化还原酶活检测平台的建立是目前急需解决的一个重要技术问题。每个酶都有其最佳反应条件，这包括反应缓冲液、温度、离子浓度等。设计合理、高效的筛选方法是关键。另一方面，在筛选有实际应用价值的氧化还原酶时，大部分研究都只着眼于某一种酶的筛选，而在每个细胞中往往含有上百种酶类，这样导致在筛选过程中可能无法充分挖掘所考察菌株的实际应用价值，在人力、资源及时间成本上都造成了极大的浪费。目前针对建立耐有机溶剂氧化还原酶的高通量检测平台，经检索还未见有公开相关文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法，涉及酶检测和生物催化剂高通量筛选，构建了多种酶体系多种有机溶剂耐受性的高通量检测平台，并通过这个平台检测巴利阿里假单胞杆菌(Pseudomonas balearica)的胺脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶以及异柠檬酸脱氢酶等氧化还原酶的耐有机溶剂性能。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法，包括：

1)菌株培养：将菌株以1～10％的接种量接种入216L培养基中培养；本发明所选用的菌株为巴利阿里假单胞杆菌(Pseudomonas balearica)(CGMCC编号8967)，但本发明的方法不限于此菌株。

2)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心，洗涤，重悬，获得的细胞用超声破碎后离心，上清液即为粗酶液；

3)在步骤2)所得粗酶液中加入氯化钠溶液使其终浓度为1～3M，和/或在步骤3)所得粗酶液中加入pH 8.0～11.0的分子量为2～500kDa的支链聚乙烯亚胺(PEI)溶液使其终浓度为1～10mg/mL；氯化钠可促进耐盐、嗜盐氧化还原酶的正确折叠，减少假阴性，提高耐有机溶剂氧化还原酶的筛选效率；PEI能够提高氧化还原酶的稳定性，减少操作过程中酶失活，提高耐有机溶剂氧化还原酶的筛选效率；

4)氧化还原酶对有机溶剂耐受性测定：在平行条件下，向步骤3)所得溶液中分别添加不同的有机溶剂并使各有机溶剂的终浓度至10～30％(v/v)，于20～50℃、150～250rpm平行地震荡0.5～1.5h，然后构建多种有机溶剂体系酶活性高通量检测平台，即利用酶标仪平行地同时测定加入有不同有机溶剂的体系中氧化还原酶在震荡不同时间后的剩余酶活力，以同时测定不同有机溶剂对氧化还原酶活性和稳定性的影响，从而同时得到该氧化还原酶对不同有机溶剂的耐受性。

上述方法统一了多种酶的反应条件，包括温度、缓冲液、激活因子及有机溶剂种类浓度等，通过减少、消除不同酶之间检测方式、仪器要求以及结果处理的差异性，利用酶标仪同时快速检测菌株中的多种氧化还原酶耐对多种有机溶剂的耐受性，从而构建耐有机溶剂的氧化还原酶高通量检测平台，能够迅速筛选获得多种耐有机溶剂的氧化还原酶。

一实施例中：所述氧化还原酶为NADH或NADPH依赖型氧化还原酶。

一实施例中：所述氧化还原酶包括胺脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、异柠檬酸脱氢酶。

一实施例中：所述有机溶剂为乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜。

一实施例中：所述步骤1)中，216L培养基组成为1～15.0g/L蛋白胨，1～10.0g/L酵母粉，0.1～1g/L牛肉膏，0.1～2g/L柠檬酸钠，0.1～1g/L硝酸铵，0.1～2g/L乙酸钠，用海水配置；所述的培养条件为：起始pH 6.5～8.0，装液量体积分数为5％～15％，培养温度20～40℃，摇床转速150～250rpm，培养时间12～48h。

一实施例中：所述步骤2)中，将步骤1)培养结束获得的发酵液在4℃，8000rpm离心15min获得细胞，弃上清液，沉淀用pH 6.5～8.0的Tris-盐酸缓冲液重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次；配置成浓度为0.025～100g/L的细胞液用于超声破碎。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明统一了多种酶的反应条件，包括温度、缓冲液、激活因子及有机溶剂种类浓度等，通过减少、消除不同酶之间检测方式、仪器要求以及结果处理的差异性，利用酶标仪同时快速检测菌株中的多种氧化还原酶耐对多种有机溶剂的耐受性，从而构建耐有机溶剂的氧化还原酶高通量检测平台，能够迅速筛选获得耐有机溶剂的氧化还原酶。同时通过在粗酶液中加入不同浓度的氯化钠，稳定耐盐、嗜盐酶的结构，使其正确折叠，减少假阴性的结果；并通过加入聚乙烯亚胺，提高氧化还原酶的稳定性，提高筛选效率，能够对大量菌株同时进行多种氧化还原酶耐多种有机溶剂耐受性的检测，有利于最大限度地同时挖掘所考察菌株的应用潜力，获得工业生物催化应用所需的耐有机溶剂的氧化还原酶，并提高筛选效率，减少人力、物力及时间成本的投入。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为实施例1中胺脱氢酶有机溶剂耐受性测试结果。(A)有机溶剂对胺脱氢酶的影响；(B)有机溶剂对胺脱氢酶稳定性的影响。

图2为实施例2中丙酮酸脱氢酶有机溶剂耐受性测试结果。(A)有机溶剂对丙酮酸脱氢酶的影响；(B)有机溶剂对丙酮酸脱氢酶稳定性的影响。

图3为实施例2中苹果酸酶有机溶剂耐受性测试结果。(A)有机溶剂对苹果酸酶的影响；(B)有机溶剂对苹果酸酶稳定性的影响。

图4为实施例2中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶有机溶剂耐受性测试结果。(A)有机溶剂对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的影响；(B)有机溶剂对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶稳定性的影响。

图5为实施例2中酮戊二酸脱氢酶有机溶剂耐受性测试结果。(A)有机溶剂对酮戊二酸脱氢酶的影响；(B)有机溶剂对酮戊二酸脱氢酶稳定性的影响。

图6为实施例2中异柠檬酸脱氢酶有机溶剂耐受性测试结果。(A)有机溶剂对异柠檬酸脱氢酶的影响；(B)有机溶剂对异柠檬酸脱氢酶稳定性的影响。

图7为实施例2中苹果酸脱氢酶有机溶剂耐受性测试结果。(A)有机溶剂对苹果酸脱氢酶的影响；(B)有机溶剂对苹果酸脱氢酶稳定性的影响。

图8为实施例3中盐浓度对丙酮酸脱氢酶在有机溶剂体系中活性的影响。

图9为实施例3中盐浓度对丙酮酸脱氢酶在有机溶剂体系中稳定性的影响。其中(A)为不同盐浓度下丙酮酸脱氢酶耐30％异丙醇的稳定性曲线；(B)为不同盐浓度下丙酮酸脱氢酶耐30％环己烷的稳定性曲线。

图10为实施例4中PEI浓度对丙酮酸脱氢酶在有机溶剂体系中活性的影响。

图11为实施例4中PEI浓度对丙酮酸脱氢酶有机溶剂体系中稳定性的影响。其中(A)为不同PEI浓度下丙酮酸脱氢酶耐30％异丙醇的稳定性曲线；(B)为不同PEI浓度下丙酮酸脱氢酶耐30％环己烷的稳定性曲线。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1

1)巴利阿里假单胞杆菌(Pseudomonas balearica)的培养：以1％的接种量，将菌种接入500mL 216L培养基中。216L培养基的组成为10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏，0.5g/L柠檬酸钠，0.2g/L NH₄NO₃，1.0g/L NaAc，用海水配置。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度25℃，摇床转速200rpm，培养时间24小时。

2)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞，配置成浓度为0.025～100g/L的细胞液用超声细胞破碎机破碎，收集上清液即获得粗酶液。

3)有机溶剂对酶活性影响测定：在平行条件下，在粗酶液中分别添加不同有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜等)，使各有机溶剂的终浓度至10～30％(v/v)，于25℃、200rpm的摇床中平行地震荡1h，测定剩余酶活力，从而测定胺脱氢酶对不同有机溶剂的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作为对照。

4)有机溶剂对胺脱氢酶稳定性影响测定：在平行条件下，在粗酶液中分别添加不同有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜等)，使各有机溶剂的终浓度至10～30％(v/v)，于25℃、200rpm的摇床中平行地震荡，间隔时间取样测定酶活，测定剩余酶活力，从而测定胺脱氢酶对不同有机溶剂的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作为对照。

5)胺脱氢酶酶活检测方法：向96微孔板中加入反应体系，即180μL氯化铵缓冲液(pH 8.5)，10μL NADH，10μL苯氧基-2-丙酮，20μL粗酶液，在所统一检测温度下温育5min。加入经适当稀释的所需检测酶液启动反应。使用酶标仪在340nm下监测一段时间内吸光度的变化，计算得到各酶的酶活。酶活定义为在规定条件下，每分钟催化生成或者消耗1μmol NADH所耗酶量为1个酶活力单位。

结果如图1所示，从结果上看，利用所检测的高通量检测平台对多种氧化还原酶同时进行酶活检测时，结果平行，同批次不同平行样间误差小，结果重现性好。利用统一平台所测得的结果与各酶在各自最优反应条件下所测得的结果相差无几，说明经统一优化各酶反应条件所建立的高通量检测平台的可靠性。发现巴利阿里假单胞杆菌(Pseudomonas balearica)的胺脱氢酶，对有机溶剂乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜具有良好的耐受性。

实施例2

1)巴利阿里假单胞杆菌(Pseudomonas balearica)培养：以1％的接种量，将菌种接入500mL 216L培养基中。216L培养基的组成为10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏，0.5g/L柠檬酸钠，0.2g/L NH₄NO₃，1.0g/L NaAc，用海水配置。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度40℃，摇床转速200rpm，培养时间24小时。

2)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞，配置成浓度为0.025～100g/L的细胞液用超声细胞破碎机破碎，收集上清液即获得粗酶液。

3)有机溶剂对海洋微生物中心碳代谢关键氧化还原酶酶活性影响测定：在平行条件下，在粗酶液中分别添加不同有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜等)，使各有机溶剂的终浓度至10～30％(v/v)，于50℃、200rpm的摇床中平行地震荡1h，测定剩余酶活力，从而测定海洋微生物中心碳代谢关键氧化还原酶(丙酮酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶)对不同有机溶剂的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作为对照。

4)有机溶剂对海洋微生物中心碳代谢关键氧化还原酶稳定性影响测定：在平行条件下，在粗酶液中分别添加不同有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜)，使各有机溶剂的终浓度至10～30％(v/v)，于50℃、200rpm的摇床中震荡，间隔时间取样测定酶活，测定剩余酶活力，从而测定海洋微生物中心碳代谢关键氧化还原酶(丙酮酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶)对不同有机溶剂的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作为对照。

5)海洋微生物中心碳代谢关键氧化还原酶酶活检测方法：向96微孔板中加入六种酶的反应体系，在所统一检测温度下温育5min。加入经适当稀释的所需检测酶液启动反应。使用酶标仪在340nm下监测一段时间内吸光度的变化，计算得到各酶的酶活。酶活定义为在规定条件下，每分钟催化生成或者消耗1μmol NADH所耗酶量为1个酶活力单位。

结果如图2至图7所示，从结果上看，利用所检测的高通量检测平台对多种氧化还原酶同时进行酶活检测时，结果平行，同批次不同平行样间误差小，结果重现性好。利用统一平台所测得的结果与各酶在各自最优反应条件下所测得的结果相差无几，说明经统一优化各酶反应条件所建立的高通量检测平台的可靠性。发现巴利阿里假单胞杆菌(Pseudomonas balearica)的中心碳代谢关键氧化还原酶，对有机溶剂乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜具有良好的耐受性。

实施例3

1)菌株培养：同实施例1步骤1)；

2)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗涤3次并重悬，配置成浓度为0.025～100g/L的细胞液用超声细胞破碎机破碎，收集上清液即获得粗酶液。

3)调节粗酶液的盐浓度：在粗酶液中加入氯化钠溶液，使其终浓度为1～3M。

4)有机溶剂对丙酮酸脱氢酶(不同盐浓度下)酶活性影响测定：在平行条件下，在粗酶液中分别添加不同有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜等)，使各有机溶剂的终浓度至30％(v/v)，于35℃、200rpm的摇床中平行地震荡1h，测定剩余酶活力，从而测不同盐浓度下丙酮酸脱氢酶对有机溶剂的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作为对照。结果见图8，说明不同浓度的氯化钠可以促进酶的正确折叠，不同程度上增强丙酮酸脱氢酶在有机溶剂体系中的活性。

5)盐浓度对丙酮酸脱氢酶有机溶剂体系中稳定性的影响：在平行条件下，在粗酶液中分别添加不同有机溶剂(异丙醇和环己烷)，使各有机溶剂的终浓度至30％(v/v),于35℃、200rpm的摇床中平行地震荡，间隔时间取样测定酶活，测定剩余酶活力，从而测定丙酮酸脱氢酶对不同有机溶剂的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作为对照。结果见图9，说明不同浓度的氯化钠可以不同程度上增强丙酮酸脱氢酶在有机溶剂体系中的稳定性，因而能够减少操作过程中酶失活，提高耐有机溶剂氧化还原酶的筛选效率。

实施例4

1)菌株培养：同实施例1步骤1)；

2)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗涤3次并重悬，配置成浓度为0.025～100g/L的细胞液用超声细胞破碎机破碎，收集上清液即获得粗酶液。

3)在粗酶液中加入分子量为2000Da的支链PEI溶液(pH 8.0)，使其终浓度为1～10mg/mL。

4)PEI浓度对有机溶剂对丙酮酸脱氢酶酶活性影响测定：在平行条件下，在粗酶液中分别添加不同有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜等)，使各有机溶剂的终浓度至30％(v/v)，于40℃、200rpm的摇床中平行地震荡1h，测定剩余酶活力，从而测不同盐浓度下丙酮酸脱氢酶对有机溶剂的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作为对照。结果如图10，说明不同浓度的PEI对酶活性哟轻微的抑制作用。

5)PEI浓度对丙酮酸脱氢酶耐有机溶剂稳定性影响测定：在平行条件下，在粗酶液中分别添加不同有机溶剂(异丙醇和环己烷)，使各有机溶剂的终浓度至30％(v/v),于40℃、200rpm的摇床中平行地震荡，间隔时间取样测定酶活，测定剩余酶活力，从而测定丙酮酸脱氢酶对不同有机溶剂的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作为对照。结果如图11，说明不同浓度的PEI溶液可以不同程度上增强丙酮酸脱氢酶在有机溶剂体系中的稳定性，因而能够减少操作过程中酶失活，提高耐有机溶剂氧化还原酶的筛选效率。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。