技术领域：本发明涉及一种液态芯片技术同时检测6种猪源食源菌的检测方法，主要涉及大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌6种常见食源菌的高通量的检测方法。
背景技术：
：大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌对人和动物具有广泛的致病性，是污染猪肉产品并引食物中毒的主要的食源性细菌，在公共卫生上具有重要意义。据WHO估计全球每年因食用微生物污染的食物和水导致200万人死亡。这些食源菌不仅威胁着人和动物的健康，而且造成了巨大的经济损失；为此，我国将这几种细菌的检验列为食品微生物检验中要求检验的项目。对于大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌的检测方法，传统的检测方法包括增菌、生化鉴定、血清学鉴定等，所需检验时间长。由于动物产品的保质期短、食源菌存在数量少的特殊性质，传统的挑取选择平板上可疑菌落的检测方法可能漏检、错检。因此，建立高灵敏度和高特异性的检测方法是提高动物产品食源菌检测水平的重要措施。食源性致病菌的检测方法有：GB4789.12010《食品微生物学检验》中的培养微生物后进行生化和血清型鉴定的检测方法；利用抗原抗体原理的酶联免疫吸附、乳胶凝集试验等的检测方法。随着分子生物学技术的快速发展，PCR、实时定量PCR及芯片技术等以灵敏度高、检测时间少等优点被应用到食品致病菌的检测。如，张键等以小肠结肠炎的16srRNA和ail基因为目的基因建立了多重PCR快速检测致病性小肠结肠炎耶尔森菌；程晓艳等建立了同时检测副溶血弧菌、金黄葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的多重PCR检测方法；范红英等应用多重PCR建立了沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、绿脓杆菌和副溶血弧菌检测方法。LiuJie等建立了可同时检测腹泻病人粪便中气单胞菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌、弧菌和耶尔森氏菌6种导致腹泻的病原菌的液态芯片检测方法,。液态芯片（LuminexxMAP）技术是把聚苯乙烯小球用荧光染色的方法编码，通过调节两种荧光染料的配比获得100种具有不同特征的荧光谱的微球，每种微球共价交联上针对特定检测物的核酸探针，在检测时，带有特异性核酸探针的编码微球混合，加入微量检测样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合后，用Luminex200仪器通过两束激光分别识别微球的编码和微球上报告分子的荧光强度进行分析。液态芯片技术有机地整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项最新科技成果，具有高通量、高速度、准确性高、灵敏度高、重复性好、线性范围广、无需洗涤、操作简便等优点。
技术实现要素：
：本发明对检测猪源动物产品大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌的液态芯片方法，是在其他研究成果基础上针对这几种属和种特异性基因设计出特异性引物建立的检测方法。该方法在一个孔内可以快速鉴定出大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和金黄色葡萄球菌。本发明根据这几种菌的种属特异性，分别设计了大肠埃希氏菌recA基因、O157侵袭基因eaeA基因，沙门氏菌连四硫酸盐还原酶ttrA基因，志贺氏菌广泛调控基因virA，小肠结肠炎耶尔森氏菌侵袭基因invA和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因nuc的特异性引物，其中每对引物的上游引物带有与特定微球结合的标签序列，下游引物带有生物素标记。用引物对这几种菌分别进行单菌种的PCR扩增和多菌种的多重PCR扩增后与混合微球杂交，杂交30min后在Luminex200仪器进行分析，建立了液态芯片检测方法。1.2.引物设计根据研究目的，经过同源性比较，以大肠埃希氏菌属特异性基因复制酶基因recA、O157侵袭素基因eaeA，沙门氏菌连四硫酸盐还原酶ttrA基因，志贺氏菌广泛调控基因virA基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌侵袭素invA基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因nuc分别设计引物，引物序列如下所示：2．细菌DNA的提取（1）水煮法提取：取经过增菌培养的培养基1mL在12,000rpm离心5min，沉淀用500μL无菌生理盐水洗1次后用100μL无菌超纯水重悬，煮沸10min，冰浴10min，12,000rpm离心5min取上清。（2）细菌基因组DNA小量试剂盒提取3.PCR扩增目的基因片段配制25μL体系：2×GoTaqGreenMasterMix12.5μL，引物EcorecA-F和EcorecA-R、EcoeaeA-F和EcoeaeA-R、SalttrA-F和SalttrA-R、ShivirA-F和ShivirA-R、YerinvA-F和YerinvA-R混合物2.5μL（每个引物浓度为2μM），dNTPs1μL，DNA模板5μL，用无菌超纯水将体系补足到25μL。反应程序：95°C预变性15min后，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s，循环35次，72°C延伸7min，产物在4°C保存。4.微球杂交取5μL扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球（125个/μL）和链霉素-亲和素藻红蛋白（SAPE）（6μg/mL）混合，在37°C孵育杂交25-30min。5.Luminex200仪器检测打开xPONENT，根据已有程序和检测样本数创建一个批次（batch），点击运行（run）按钮开始检测读数。检测结束后，根据数值判定样本的检测结果：大肠埃希氏菌Escherichia和O157的是阴性对照5倍或以上时为大肠埃希氏菌O157，只有Escherichia数值高于阴性对照6倍或以上时为非O157大肠埃希氏菌、当Escherichia和shigella的数值阴性对照6倍或以上时为志贺氏菌、当Sallmonea的数值高于阴性对照6倍或以上时为沙门氏菌，当Yersinina的数值高于阴性对照6倍或以上时为小肠结肠耶尔森氏菌，当staphylococcus的数值高于阴性对照6倍或以上时为金黄色葡萄球菌。6.特异性试验选取大肠埃希氏菌O157、非O157大肠埃希氏菌O18、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡球菌和单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、细小病毒、圆环病毒提取DNA模板进行液态芯片方法的检测。检测结果判定根据如下：Escherichia和O157的是阴性对照6倍或以上时为大肠埃希氏菌O157，只有Escherichia数值高于阴性对照6倍或以上时为非O157大肠埃希氏菌、当Escherichia和shigella的数值阴性对照6倍或以上时为志贺氏菌、当Sallmonea的数值高于阴性对照6倍或以上时为沙门氏菌，当Yersinina的数值高于阴性对照6倍或以上时为小肠结肠耶尔森氏菌，当staphylococcus的数值高于阴性对照6倍或以上时为金黄色葡萄球菌。而单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、细小病毒、圆环病毒的数值应与阴性对照的相差不大。7.广谱性试验选取非O157大肠埃希氏菌分离株、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、汤普逊沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡球菌分离株、小肠结肠炎耶尔森菌进行猪源食源菌液态芯片检测法鉴定，结果为：Escherichia的是阴性对照6倍和O157的是阴性对照6倍或以上时为大肠埃希氏菌O157，只有Escherichia数值高于阴性对照6倍或以上时为非O157大肠埃希氏菌、当Escherichia和shigella的数值阴性对照6倍或以上时为志贺氏菌、当Sallmonea的数值高于阴性对照6倍或以上时为沙门氏菌，当Yersinina的数值高于阴性对照6倍或以上时为小肠结肠耶尔森氏菌，当staphylococcus的数值高于阴性对照6倍或以上时为金黄色葡萄球菌。本发明利用所设计合成的引物用于猪源动物产品的微生物检测的液态芯片方法可以在一个体系中检测数种食源菌，在食品微生物检测中较传统的增菌分离培养后进行生化鉴定和玻片血清凝集试验的3-7天时间比，仅需要18-24h，大大缩短了检测时间。附图表说明图1猪源食源菌液态芯片法特异性检测结果图2猪源食源菌液态芯片法广谱性检测结果图3猪源食源菌液态芯片法在猪肉中的检测结果8.具体实施方式下面结合图表和具体实施方式对本发明进行详细描述。实施例1：（1）无菌操作挑取胰蛋白大豆胨平板大肠埃希氏菌O18、大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和金黄色葡萄球菌单菌落。无菌操作挑取单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌、链球菌单菌落，收集细小病毒、圆环病毒细胞培养物抽提DNA模板。（2）水煮法提取DNA模板：大肠埃希氏菌O18、大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌和链球菌菌落分别用500μL无菌生理盐水洗1次后用100μL无菌超纯水重悬，煮沸10min，冰浴10min，12,000rpm离心5min取上清。细小病毒、圆环病毒用Qiagen病毒DNA提取剂盒提取DNA模板。（3）PCR扩增目的基因片段：配制25μL体系：2×GoTaqGreenMasterMix12.5μL，引物EcorecA-F和EcorecA-R、EcoeaeA-F和EcoeaeA-R、SalttrA-F和SalttrA-R、ShivirA-F和ShivirA-R、YerinvA-F和YerinvA-R混合物2.5μL（每个引物浓度为2μM），dNTPs1μL，DNA模板2μL，用无菌超纯水将体系补足到25μL。反应程序：95°C预变性15min后，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s，循环35次，72°C延伸7min，产物在4°C保存。（4）微球杂交：取5μL扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球（125个/μL）和链霉素-亲和素藻红蛋白（SAPE）（6μg/mL）混合，在37°C孵育杂交25-30min。（5）Luminex200仪器检测：打开xPONENT，根据已有程序和检测样本数创建batch，点击run按钮开始检测读数。检测结束后，根据数值判定样本的检测结果：大肠埃希氏菌O157的读数为Escherichia和O157是阴性对照100倍以上，非O157大肠埃希氏菌O18的读数只有Escherichia数值高于阴性对照100倍以上，志贺氏菌的读数是Escherichia和shigella数值阴性对照50倍以上；沙门氏菌的Sallmonella的数值是阴性对照30倍以上；小肠结肠耶尔森氏菌的Yersinina数值高于阴性对照90倍以上，金黄色葡萄球菌的staphylococcus数值高于阴性对照200倍以上。而单增性李斯特菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、细小病毒、圆环病毒的数值与阴性对照的相差不大。实施例2（1）无菌操作挑取非O157大肠埃希氏菌分离株、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡球菌分离株、大肠埃希氏菌O157和小肠结肠炎耶尔森菌进行猪源食源菌液态芯片方法检测。（2）水煮法提取DNA模板：无菌操作挑取胰蛋白大豆胨平板上非O157大肠埃希氏菌分离株、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡球菌分离株、大肠埃希氏菌O157和小肠结肠炎耶尔森菌分别用500μL无菌生理盐水洗1次后用100μL无菌超纯水重悬，煮沸10min，冰浴10min，12,000rpm离心5min取上清。（3）PCR扩增目的基因片段：配制25μL体系：2×GoTaqGreenMasterMix12.5μL，引物EcorecA-F和EcorecA-R、EcoeaeA-F和EcoeaeA-R、SalttrA-F和SalttrA-R、ShivirA-F和ShivirA-R、YerinvA-F和YerinvA-R混合物2.5μL（每个引物浓度为2μM），dNTPs1μL，DNA模板2μL，用无菌超纯水将体系补足到25μL。反应程序：95°C预变性15min后，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s，循环35次，72°C延伸7min，产物在4°C保存。（4）微球杂交：取5μL扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球（125个/μL）和链霉素-亲和素藻红蛋白（SAPE）（6μg/mL）混合，在37°C孵育杂交25-30min。（5）Luminex200仪器检测：打开xPONENT，根据已有程序和检测样本数创建batch，点击run按钮开始检测读数。检测结束后，根据数值判定样本的检测结果：非O157大肠埃希氏菌分离株的读数只有Escherichia数值高于阴性对照8倍以上，志贺氏菌的读数是Escherichia和shigella数值阴性对照30倍以上；沙门氏菌的Sallmonella的数值是高于阴性对照45倍以上，金黄色葡萄球菌的staphylococcus数值高于阴性对照25倍以上，大肠埃希氏菌O157的读数为Escherichia和O157是阴性对照50倍以上，小肠结肠耶尔森氏菌的Yersinina数值为高于阴性对照45倍以上。实施例3：（1）无菌操作称取4份25g猪肉样品放入225mLLB的无菌均质袋中均质1-2min，分别接种大肠埃希氏菌O18、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和金黄色葡萄球菌后于37°C培养14-16h。无菌操作称取25g猪肉样品1份放入225mL含有新生霉素的志贺氏增菌肉汤的无菌均质袋中均质1-2min，接种志贺氏菌后于42°C厌氧培养14-16h。无菌操作称取25g猪肉样品1份放入225mL含有新生霉素的EC肉汤无菌均质袋中均质1-2min，接种O157大肠埃希氏菌后于37°C培养14-16h。（2）水煮法提取DNA模板：取经过增菌培养的培养基3mL在12,000rpm离心5min，沉淀用500μL无菌生理盐水洗1次后用100μL无菌超纯水重悬，煮沸10min，冰浴10min，12,000rpm离心5min取上清。（3）PCR扩增目的基因片段配制25μL体系：2×GoTaqGreenMasterMix12.5μL，引物EcorecA-F和EcorecA-R、EcoeaeA-F和EcoeaeA-R、SalttrA-F和SalttrA-R、ShivirA-F和ShivirA-R、YerinvA-F和YerinvA-R混合物2.5μL（每个引物浓度为2μM），dNTPs1μL，DNA模板2μL，用无菌超纯水将体系补足到25μL。反应程序：95°C预变性15min后，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s，循环35次，72°C延伸7min，产物在4°C保存。（4）微球杂交取5μL扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球（125个/μL）和链霉素-亲和素藻红蛋白（SAPE）（6μg/mL）混合，在37°C孵育杂交25-30min。（5）Luminex200仪器检测打开xPONENT，根据已有程序和检测样本数创建batch，点击run按钮开始检测读数。检测结束后，根据数值判定样本的检测结果：O157样本的Escherichia和O157的数值是阴性对照、空白对照10倍；O18的Escherichia数值高于阴性对照10倍，空白对照的80倍；志贺氏菌的Escherichia数值是阴性对照的2倍、空白对照的10倍，shigella的数值是阴性对照和空白对照的6倍；沙门氏菌的数值是阴性对照2倍、空白对照的7倍；小肠结肠耶尔森氏菌的数值高于阴性对照和空白对照的50倍；金黄色葡萄球菌的staphylococcus数值是阴性对照40倍，空白对照的50倍。序列表<110>中国动物卫生与流行病学中心<120>一种鉴别猪源食源菌的液态芯片方法<160>12<210>1<211>42<212>DNA<213>大肠埃希氏菌（Escherichia.coli）<220><223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。<400>1aactttctctctctattcttattt/iSpC12/aatcggcgactctcacat42<210>2<211>20<212>DNA<213>大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）<220><223>引物5'端带有生物素标记<400>2tacggatctggttgatgaag20<210>3<211>42<212>DNA<213>大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）O157<220><223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。<400>3atctcaattacaataacacacaaa/iSpC12/tcacctggcagaatgtct42<210>4<211>18<212>DNA<213>大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）O157<220><223>引物5'端带有生物素标记<400>4gtctgttgaccgcttgtt18<210>5<211>42<212>DNA<213>沙门氏菌（Salmonella）<220><223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。<400>5acactcatttaacactatttcatt/iSpC12/gctacgactgcttgaacc42<210>6<211>18<212>DNA<213>沙门氏菌（Salmonella）<220><223>引物5'端带有生物素标记<400>6gccttccacgacttcttc18<210>7<211>43<212>DNA<213>志贺氏菌（Shigella）<220><223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。<400>7tactacttctataactcacttaaa/iSpC12/atgcctgaacaacgagtta43<210>8<211>20<212>DNA<213>志贺氏菌（Shigella）<220><223>引物5'端带有生物素标记<400>8catgttatgtgcgatggtaa20<210>9<211>43<212>DNA<213>小肠结肠耶尔森氏菌（Y.enterocolitiea）<220><223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。<400>9ctacaaacacttaactttatcttt/iSpC12/aggtgaatggtgagcaatt43<210>10<211>18<212>DNA<213>小肠结肠耶尔森氏菌（Y.enterocolitiea）<220><223>引物5'端带有生物素标记<400>10gccgcataggatgatgtc18<210>11<211>44<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌（S.aureus）<220><223>iSp.C12表示12个碳原子，其功能是将标签序列和引物序列连接。<400>11atactttacaaacaaataacacac/iSpC12/ggatggctatcagtaatgtt44<210>12<211>19<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌（S.aureus）<220><223>引物5'端带有生物素标记<400>12ggatcttcagaaccacttc19