专利名称：肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双检试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠道病毒71型的检测试剂
品-o
背景技术：
肠道病毒 71 型(enterovirus71 ， EV71)是小 RNA病毒科 (Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员。EV71感染主要引起患 者手足口病(HFMD)，并且是该病的主要病原体。另外，EV71还可引起无 菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统相关疾病， 并可暴发流行，导致死亡，严重危害人类健康。
为了在EV71相关疾病暴发时能够迅速査明病因，从而及时采取正确、 有效的控制措施，亟需针对EV71的准确、快速、高灵敏度、高特异性、 高通量的新型诊断手段。肠道病毒感染具有"一因多病， 一病多因"的特 点，仅根据临床症状不易做出正确的诊断。例如，引发手足口病的肠道病 毒就有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、 4、 5、 9、 10型，B组的2、 5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以肠道病 毒71型和柯萨奇病毒A16型(CoxsakieA16，简称CoxA16)最为常见。肠 道病毒的传统检测方法是病毒分离、血清中和试验和分子生物学诊断技 术。病毒分离操作复杂、耗时长、费用高、分离率低。免疫学方法虽然比 分离培养法更加简便、快速，但是整个检测时间仍需1周左右的时间。病 人感染病毒后，血清中产生特异性抗体需要一段时间。另外，EV71感染 后只有2 10天(平均3 5天)的潜伏期，而传染力始于发病的前几天， 所以免疫学方法敏感度较低，尤其不适合早期诊断。毒株抗原变异、抗原 抗体交叉反应、患者个体差异等均在较大程度上影响了该法的准确性与特 异性。近年来，聚合酶链式反应(PCR)技术广泛应用于病毒特异性基因的 检测，尽管它也具有灵敏、特异、快速的优点，但结果判定需要电泳，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。
由此可见，目前常用的肠道病毒71型检测手段均存在较大的不足， 不能满足疾病暴发时对大量临床样本，尤其是早期样本准确、快速诊断的 要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有肠道病毒71型检测手段均存在较 大的不足的问题
为了解决上述问题，本发明公开了一种肠道病毒71型核酸扩增荧光 定量和液态芯片双检试剂盒，包括
一对EV71基因组特异性引物A和A，，其中A和/或A，的5'端 标记有生物素；
一对EV71基因组特异性引物B和B，，其中B和/或B，的5'端标 记有生物素；
一种交联与引物A和A'扩增片段序列配对的探针F的荧光编码微 球C;
一种交联与引物B和B'扩增片段序列配对的探针G的荧光编码微 球D;
一对EV71基因组特异性保守序列引物E和E';
一条5'端标记荧光基团和3'端标记BHQ的Taq-Man探针；
QRT-PCR试剂；
荧光物标记的亲和素。
本发明中，定义"EV71基因组特异性引物"是指以GeneBank中已公 开的EV71核酸序列为模板，本领域技术人员通过公知的引物设计软件得 到针对EV71基因组特异性引物序列，相应的引物可以通过核酸合成仪制 备得到。本发明中所述引物A和A， 、 B禾nB， 、 E禾BE，的序列均不 相同。
在一实施方式里，所述的荧光编码微球C为luminex公司的144微球。 在一实施方式里，所述的荧光编码微球D为luminex公司的146微球。 在一些实施方式里，所述荧光物标记的亲和素中荧光物选自异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、3价镧系螯
合物如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等中之一，其中优选藻红蛋白。 在一些实施方式里，所述的荧光基团是FAM， TET， VIC，或HEX。 在一实施方式里，所述的一对EV71基因组特异性保守序列引物E和 E'的核苷酸序列为5，-GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3，(SEQ ID NO:l) 和5，-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3， (SEQIDNO:2);所述标记荧光 基团的 T叫-Man 探针的核苷酸序列为 FAM画TCGCACAGCACAGCTGAGACCAC誦BHQ(SEQ ID NO:3)
在一实施方式里，所述的EV71基因组特异性引物A和A，的核苷酸 序列为5，-GCGGGTAGTGTGTCGTAAC-3 ，(SEQ ID NO:4)和5， -GGTGGTCACAGACTTCAAGGTT-3， (SEQ ID NO:5);所述与引物A和 A'扩增片段序列配对的探针F的核苷酸序列为5 ' 画NH-TTTTTTGGATTGGCCATCCGGTGTGCA-3'(SEQ ID NO:6)。
在一实施方式里，所述的EV71基因组特异性引物B和B，的核苷酸 序列为5，醫GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3，(SEQ ID NO:7)禾口 5，-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3， (SEQ ID NO:8);所述与引物B和 B'扩增片段序列配对的探针G的核苷酸序列为5 ' -NH-TTTTTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAC-3' (SEQ ID NO:9)。
本发明的思路基于肠道病毒71型基因组的保守区结构，设计特异
性引物及探针，通过荧光定量PCR与液态基因芯片进行双检诊断。荧光 定量PCR为阳性，定为阳性，无需再进行液态基因芯片检测。荧光定量 PCR为阴性，进行液态基因芯片检测。通过双检方法可以大大提高EV71 检出率。
荧光定量PCR EV71检测技术方案
(1) 引物与探针的设计针对EV71基因组特异性保守序列设计特 异性引物与探针。
(2) EV71 QRT-PCR反应液的制备将各反应成分按一定浓度混合 在一起。
(3) 病毒核酸检测取病毒RNA核酸加入QRT-PCR反应液及反应 酶进行荧光定量PCR反应。(4)结果判断根据扩增曲线Ct值，并与参照品比较，判断样品属性。
液态芯片EV71检测技术方案
(1) 引物与探针的设计设计两对EV71特异性引物及相应的杂交
探针对两个区域进行PCR扩增和检测。
(2) 探针与荧光编码微球的交联。
(3) EV71RT-PCR反应液的制备将各反应成分按一定浓度混合在一起。
(4) 病毒核酸检测通过PCR扩增，荧光编码微球探针与产物的杂
交，最后进行液态基因芯片检测。
(5) 结果判断，根据参照品检测数据计算Cutoff值，从而判断样品属性。
另一方面，本发明还公开了一种肠道病毒71型检测方法，包括荧光 定量PCR与液态基因芯片两种方法对病毒核酸联合检测，荧光定量PCR 为阳性，定为阳性，无需再进行液态基因芯片检测；荧光定量PCR为阴性， 再进行液态基因芯片检测。两种方法联合作用可以极大地降低漏检率。
本发明通过设计特异性扩增引物与探针(包括Taq-Man探针与荧光 编码微球探针)序列，高效的扩增反应与液芯检测体系及程序，最大程度 的实现了荧光定量PCR技术的高灵敏性，高特异性，定量精确性等特点， 操作简捷，单个反应从样品处理只需2-3 h。液态生物芯片检测不仅拥有 更为优异的特异性与灵敏度，更拥有常规检测技术不可能具有的特点高 通量， 一个体系内一次即可检测高达100个指标，同时结果稳定，重复性 好，操作简便。
另外，荧光定量PCR虽然也可以对病毒核酸敏感、特异的检测，但 因为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)及新亚型毒株的 出现，而常常出现假阴性。液态生物芯片采用多区域检测，可以显著地降 低假阴性。两种方法的检测结果可以相互佐证，相互补充，保证了检测结 果的准确性，最终符合当前肠道病毒临床检验的快速、灵敏、简便、准确、 高通量的要求。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和 百分比基于重量，除非特别说明。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
(一)荧光定量PCREV71检测试剂对临床样本的检测(液态芯片检 测同步进行，在此分开描述)
(1) 引物与探针的设计针对EV71基因组特异性保守序列设计一 对引物与一条Taq-Man探针，探针标记FAM基团。探针序列 FAM-TCGCACAGCACAGCTGAGACCAC-BHQ 。 上游引物 5'-GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3' ; 下 游 弓l 物 5,-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3，；
(2) EV71 QRT-PCR反应液的制备将各反应成分混合在一起，成 分及浓度(20pL体系)为2x反应Mix 10 )iL，上游引物终浓度0.4 pM， 下游引物终浓度0.2 ^M，探针终浓度0.4pM。
(3) 参照品的制备以肠道病毒71型的核酸为模板，通过RT-PCR 方法获得PCR产物后，稀释成特定浓度制成强阳性对照和临界阳性对照。 阴性对照以采用"金标"确认为EV71阴性结果的粪便标本制备而成。
(4) 病毒核酸抽提病毒核酸抽提由深圳市疾病预防控制中心(CDC) 提供(利用Promega病毒核酸磁珠抽提试剂盒在Beckman Biomek 3000 核酸自动提取仪上完成)，检测实验在该机构微生物检测中心完成。
(5) 病毒核酸检测取病毒RNA核酸9.3 jxL， QRT-PCR反应液10.2 |iL,反应酶0.5pL，同时设置临界阳性对照、强阳性对照、阴性对照。反 应条件50°C， 15min;95 。C ， 2 min; 95 。C ， 15 sec， 60°C ， 30 sec， 50个循环。采用StratageneMx3005 P荧光定量PCR仪，荧光信号收集时 设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在6(TC。
(6) 结果判断阈值(threshold)可以自动生成，也可根据仪器噪 音情况调整，设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规 则的噪音线)的最高点，且0值=50.0为准。检测样本中5〈Ct^50，样本报告为阳性；检测样本中Ct值为"No Ct"， 样本报告为阴性；对于较弱的扩增，单个曲线要单独分析，调整阈值线刚 好高过基线，如果扩增曲线高过阈值线，则该样品为阳性。
(二)液态芯片EV71检测试剂对临床样本的检测
(1) 引物与探针的设计设计两对EV71特异性引物，5'端标记有 生物素(biotin);另外还有一对相应的杂交探针，末端带有氨基。上游引 物 1 : 5'画Biotin画GCGGGTAGTGTGTCGTAAC画3，； 下游引物 1 : 5，-GGTGGTCACAGACTTCAAGGTT-3， ； 探 针 1 : 5'-NH-TTTTTTGGATTGGCCATCCGGTGTGCA-3'; 上游弓|物 2 : 5'-GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3，； 下 游 引 物 2 : 5'-Biotin-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3，； 探针 2 :
5 ，-NH-TTTTTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAC画3'。
(2) 探针与荧光编码微球的交联将两种特异探针分别与144和146 号荧光编码微球交联(交联过程略)。
(3) EV71RT-PCR反应液的制备将各反应成分混合在一起，成分 及浓度(20pL体系)为2x反应Mixl0pL,引物终浓度均为0.4 ^M。
(4) 病毒核酸检测
PCR扩增取病毒RNA核酸9.18 pL， RT-PCR反应液10.32 ^L，反 应酶0.5pL，同时设置临界阳性对照、强阳性对照、阴性对照(制备方法 同荧光定量)。反应条件50°C， 15min; 95 。C ， 2 min; 95 。C ， 15 sec， 55°C， 20sec， 72 。C ， 30 sec， 50个循环。
杂交取微球稀释液15 ^L与两种交联有探针的微球各2 pL混合， 然后加入上述扩增产物5pL，同时设置空白对照(空白对照为lxTE)。 杂交条件95°C， 5min， 55 °C ， 20min。
检测加入2吗/mL藻红蛋白(PE， Invitrogen) 36 pL， 55 。C孵育 30min。然后在液态芯片200分析仪(QIAGEN)上检测。样品板设置为 55。C;上样体积为50pL;取样时间(timeout)为75 sec; gate设置下 限7 500，上限15 000;单位为MFI;最少检测微球数为100;数据输出 为"data collection only"。整个过程依Luminex 200分析仪系统说明手册进行。
(5)结果判断中间荧光强度(Medium)值低于Cutoff值的样本为 阴性，中间荧光强度(Medium)值高于Cutoff值的样本为阳性，Cutoff 值-1.25xNTC平均值+15。
(三)结果与分析
临床试验结果如表l所示，30例EV71临床阳性样本，28例为 荧光定量PCR检测阳性，2例荧光定量PCR阴性样本液态芯片检测全部 为阳性。
由此可见，我们的试剂性能完全与文中相关描述相吻合，双检试剂中 的两种方法共同作用可以最大程度的降低漏检率，检测率远远高于已有同 类试剂。在临床检验中可以应用荧光定量试剂进行初检，继而利用敏感度 更高的液态芯片进一步检测漏检样本，既可以降低工作量，又能实现最佳 的诊断效果。
表1 EV71核酸扩增荧光定量与液态芯片双检试剂盒临床试验结果样本编号荧光定量Ct值144球读数146球读数结果判断
140.94376.5665.5阳性
242.2965137.5阳性
325.873870阳性
429.8729128.5阳性
531.21518204.5阳性
617.4446.5170阳性
38.54404351阳性
836.9732.5229阳性
935.2429550阳性
1032.1166349.5阳性
1125.2131254.5阳性
1242.79109.537.5阳性
1329.71134158阳性
1421.979.5141阳性
1525.1135564.5阳性
1629.69197174.5阳性
1738.31253.576阳性
1819.8690.5160.5阳性
1938.8528.58.5阳性
1036.3447159阳性
2123.73123128阳性
2227.53219198阳性
2321.92131647阳性
2433.1128143.5阳性
2536.2256221阳性
2634.07341480阳性
2724.58309565.5阳性
2824.6862.5338.5阳性
29No Ct619.5240.5阳性
30No Ct19238.5阳性
阴性对照No Ct33.5阴性
阳性对照28.01133476阳性
Blank一65阴性
注Ct值代表荧光定量PCR有明显扩增，"No Ct"表示无扩增。"-"表示没有检测。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为 阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和 组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述 和附图
可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要 求书的范围之内。序列表
〈110>上海佑安生物技术有限公司
〈120>肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双检试剂盒 <130〉序列表
〈歸 9
<170> Patentln version 3. 3
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<211〉 21
<212> DNA
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〈223〉 artificial sequence
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gattgagaca cgctgtgttc t 21
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<212> 腿
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<212〉 腿
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〈212〉 DNA
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〈223〉 artificial sequence
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ttttttggat tggccatccg gtgtgca 27
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〈212〉 DNA
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gattgagaca cgctgtgttc t 21
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gccttcaaga gggaggtcta tc 22
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ttttttcagc agagcgggat tagttggac 29
权利要求
1.一种肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双检试剂盒，包括一对EV71基因组特异性引物A和A’，其中A和/或A’的5’端标记有生物素；一对EV71基因组特异性引物B和B’，其中B和/或B’的5’端标记有生物素；一种交联与引物A和A’扩增片段序列配对的探针F的荧光编码微球C；一种交联与引物B和B’扩增片段序列配对的探针G的荧光编码微球D；一对EV71基因组特异性保守序列引物E和E’；一条5’端标记荧光基团和3’端标记BHQ的Taq-Man探针；QRT-PCR试剂；荧光物标记的亲和素。
2. 如权利要求1所述的肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双 检试剂盒，其特征在于所述一对EV71基因组特异性保守序列引物E和E， 的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:l和SEQ ID NO:2所示；所述标记荧光基团 的Taq-Man探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3. 如权利要求1所述的肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双 检试剂盒，其特征在于所述的EV71特异性引物A和A'的核苷酸序列如 SEQIDNO:4禾H SEQIDN0:5所示；所述与引物A和A，扩增片段序列配对 的探针F的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
4. 如权利要求1所述的肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双 检试剂盒，其特征在于所述的EV71特异性引物B和B，的核苷酸序列如SEQ IDN0:7和SEQIDNO:8所示；所述与引物B和B，扩增片段序列配对的探 针G的核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示。
5. 如权利要求1所述的肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双 检试剂盒，其特征在于所述的荧光编码微球C luminex公司的144微球。
6. 如权利要求1所述的肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双检试剂盒，其特征在于所述的荧光编码微球Dluminex公司的146微球。
7. 如权利要求1所述的肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双 检试剂盒，其特征在于所述荧光物标记的亲和素中荧光物选自异硫氰酸荧光 素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、或3价镧系螯合物 中之一。
8. 如权利要求4所述的肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双 检试剂盒，其特征在于所述的荧光物为藻红蛋白。
9. 如权利要求1所述的肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双 检试剂盒，其特征在于所述的荧光基团是FAM， TET， VIC，或HEX。
10. —种肠道病毒71型检测方法，包括荧光定量PCR与液态基因芯片 两种方法对病毒核酸联合检测，荧光定量PCR为阳性，定为阳性，无需再进 行液态基因芯片检测；荧光定量PCR为阴性，再进行液态基因芯片检测。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠道病毒71型的检测试剂盒。本发明公开了一种肠道病毒71型核酸扩增荧光定量和液态芯片双检试剂盒，包括一对5’端标记有生物素EV71基因组特异性引物A和A’；一对5’端标记有生物素EV71基因组特异性引物B和B’；一种交联与引物A和A’扩增片段序列配对的探针F的荧光编码微球C；一种交联与引物B和B’扩增片段序列配对的探针G的荧光编码微球D；一对EV71基因组特异性保守序列引物E和E’；一条5’端标记荧光基团和3’端标记BHQ的Taq-Man探针；QRT-PCR试剂和荧光物标记的亲和素。
文档编号C12Q1/70GK101665840SQ200810042339
公开日2010年3月10日 申请日期2008年9月1日 优先权日2008年9月1日
发明者朱文斯 申请人:上海佑安生物技术有限公司