专利名称：一种cd326基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种CD326基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种CD326基因的原位杂交检测试 剂盒及其检测方法和应用。
背景技术：
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡 人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800 万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。
2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度 报告，"认为人类在抗癌大战中是失败"，也就是说癌症死亡率没有降低，其列 举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性； 3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌 症的措施。
本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另二个重要原因是l.不 能做到真正的早期诊断;2.转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影像及和 其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属 于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一概念值得认真讨论。影像 医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度， 1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远 不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块， 其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在
这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实 一旦形 成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长； 一旦切除 原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以 2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病 灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这 是导致癌症死亡率不降的真正原因。
随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入 展开，至今，我们己有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或 癌细胞形成(单克隆)时或肿瘤干细胞的存在及突破血管壁早期转移时，就能 做到早期预测诊断。
多年前，研究人员已发现癌症转移患者及放、化疗后血液中CD326的浓度 要比正常人高得多，而且持续性增高，与中肿瘤的复发、转移密切相关。但一 直不知道它们在细胞当中的功能及癌细胞发生变化的相关性。近来的研究发 现，许多癌症(结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等癌的肿瘤干细胞都表达 很高水平CD326。肿瘤干细胞在肿瘤细胞中所占比例较低，自我更新和持续再 生为新肿瘤的能力很强。肿瘤干细胞对多种化疗都耐药，这可能是为什么目前 大多数治疗不能通过根除所有肿瘤细胞来根治肿瘤的主要原因。许多癌症的肿 瘤干细胞表达CD326, CD326是一个常见的高表达的肿瘤相关抗原，将它作为 肿瘤干细胞的存在靶标有非常重要的临床诊断意义。CD326在许多癌症中表达 过度。他作于癌症复发、转移的基因诊断早期指标有非常重要的临床意义。
目前对CD326基因的研究检测技术、方法多用于科研方面，不适应临床应 用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚未发现。根据现有的文献资料 CD326基因的检测试剂盒及相关技术未见报道。
原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术 结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的 技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条 件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫 细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分 子。
中国专利文献CN1556221公开了"IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠 癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒"。中国专利文献CN1769485公开了 "栉 孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒"。中国专利文 献CN1556410公开了 "一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法"。中国专利 文献CN1680597公开了"一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR 试剂盒"。中国专利文献CN2918435，公开了 "一种检测肥胖相关基因SNP的寡 核苷酸芯片及试剂盒"。但是，关于CD326基因的原位杂交检测试剂盒及其检 测技术未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种CD326基因的原位杂交检测试剂 盒及其检测方法和应用。
为了解决上述问题，本发明提供了一种CD326基因的原位杂交检测试剂盒 在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的癌症是肺癌、胃癌、乳腺 癌、结肠癌、前列腺癌、子宫癌、胰腺癌或膀胱癌，所述的试剂盒包括 杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQIDNO.l所示。CD326基 因序列见SEQ IDNO. 1， CD326基因的核苷酸序列长度是1528bp， CDS
是179. . 1123bp，位于染色体2p21"上。
作为可选的技术方案，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.l所示的RNA序列。
作为可选的技术方案，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 作为可选的技术方案，所述的放射性核素选自SH、 35S、 1251或3￥中的一种。
作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性
磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物优选自地高辛。 作为可选的技术方案，还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。 本发明还提供了一种CD326基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、
标记物，所述的杂交探针序列如SEQ IDNO. 1所示，所述的标记物选
自放射性核素或非放射性标记物。
本发明还提供了一种CD326基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下
步骤
a、 将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；
b、 检测a步骤得到的杂交复合体。
作为可选的技术方案，所述a步骤中形成杂交复合体的条件为核酸杂交 的温度为42。C;核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标 本或组织细胞标本。
本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以 CD326基因为检测对象，合成探针是CD326基因的DNA或RNA序列，检测的底 物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方
法能提供CD326基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色 判定以上基因的表达量，正常人CD326基因表达低或不表达，即不显色，CD326 基因在癌症病人和正常人有显著差异，该基因的表达量比正常人表达量都高。 本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组 成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是 标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其 中杂交的具体步骤包括 仪器操作
1) .将待测标本放入反应槽中；
2) .仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3) .仪器自动弃去液体，自动后固定；
4) .仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);
5) .仪器自动弃去液体，自动清洗；
6) .仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C);
7) .仪器自动弃去液体，自动清洗；
8) .仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9) .仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10) .取出封片镜检。
本发明优点在于
1、 本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。
2、 本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推 广。克服了目前对CD326基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方 法多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。
3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生和病理演变过程，本发 明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检査有显著 不同。本发明可以在基因水平上(癌变前期或癌细胞增殖、转移、扩散早期)
检测CD326基因异常表达，在影像医学检査未发现占位性癌转移病灶之前， 癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成转移肿瘤之前，能及早做到以上基因 表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期转移诊断以及治疗后转 移复发及早预测。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗， 有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。
图1是本发明实施例中癌症病人CD326过量表达图片。 图2是本发明实施例中正常人CD326表达图片。
具体实施方式
下面结合图对本发明提供的一种CD326基因的原位杂交检测试剂盒及其检 测方法和应用的具体实施方式
做详细说明。 实施例1
一种CD326基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增 效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ IDNO. 1所示。杂交探针用 地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下
消化液100u 1/管l管/盒无色透明液体
保护液100p1/管l管/盒无色透明液体
预杂交液1300 u 1/管2管/盒无色透明液体
正义杂交液10u 1/管l管/盒无色透明液体
反义杂交液10u 1/管l管/盒无色透明液体
封闭液1000 u 1/管l管/盒无色透明液体
碱性磷酸酶抗体ly 1/管l管/盒无色透明液体
显色剂A175u 1/管l管/盒黄色液体
显色剂B320ii 1/管l管/盒无色透明液体
缓冲液i 10x90ml/瓶l瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液n iox80ml/瓶l瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液iii 10x20m/瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液IV 10x90ml/瓶i瓶/盒浅黄色或无色透明液体
固定液90ml/瓶i瓶/盒无色透明液体
阳性对照标本6片/盒
上述试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)
1、 消化液20mg/ml蛋白酶K， 100mg蛋白酶K，加DEPC- H20 5ml;
2、 保护液0.2g的glycine加入lml的1X缓冲液I;
3、 预杂交液IX缓冲液II 7.5ml 50 XD 3ml
10mg/ml yest t-腿750ul llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0.04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml
4、 封闭液0.03g的bloking (购买自罗氏公司)加入lml IX缓冲液
III;
5、 lOx缓冲液I: (PH7. 1-7. 4)
NaCl 80g
Na2HP04. 12H20 3 60g KC1 2g KH2P04 2g
加三蒸水至ll,并高压灭菌；
6、 lOx缓冲液II: (PH7. 0) NaCl 175.3g
柠檬酸钠88.2g HCl 几滴
加三蒸水至ll，并高压灭菌；
7、 缓冲液III: (PH7.9) Tris 121. lg
NaCl 87.66g HCl 60ml左右 加三蒸水至ll，并高压灭菌；
8、 缓冲液IV:
1M Tris-HCl (PH9. 5): Tirs 121. lg加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH 至9.5，加水至ll，并高压灭菌；
1M NaCl: NaCl 58. 44加水至11，并高压灭菌；
0. 5M MgCl2: 101. 65g MgCl2. 6H20加水至11，并高压灭菌；
9、 固定液多聚甲醛40g加1X缓冲液I至11，稍加热(约50-60度)搅 拌至溶解；
10、 显色剂A: NBT lg加70%DMF11.44ml; 11 、 显色剂B: BCIP lg加100%DMF30ml 。 本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。 实施例2
一种CD326基因的原位杂交检测方法及试剂盒应用 一、标本处理
1、用10ml的离心管，装4. 5ml淋巴细胞分离液，再将3 ml抗凝血缓慢 加入含有淋巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液=1:1.5)的离心管 中，2000r/min离心10 min;
2、 吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1X缓冲液 I，混匀，1500g/min离心10 min;
3、 弃上清.沉淀加入约两倍的1X缓冲液I，混匀，1500g/min离心10 min;
4、 弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴 在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3 ml血，可以 做4张片子；
5、 用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X缓冲液I洗5min。 每缸可以放16片；
6、 标本可保存在-2(TC,或继续做实验。
二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度
1、 将10X缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1X缓冲液I ;
2、 将20 X缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2 X缓冲液II;
按1:100稀释成0. 2 X缓冲液II ;按1:200稀释成0. 1 X缓冲液II;
3、 将IOX缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成lX缓冲液m;
4、 IOX缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成X缓冲液IV (取1#， 2tt， 3#各
lOml，加水至100ml既可)。 三、实验歩骤
1、 取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张
(每次实验做一对阳性对照)；
2、 在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1X缓冲液199. 9ml，即为使用浓 度)20 ml。 37。C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37。C处理12 min，再用1 X缓冲液I洗5min;
3、 用0. 2%的保护液(保护液lml加1 X缓冲液199ml即为使用浓度)洗10min， 三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；
4、 将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放 在42。C恒温水浴箱中3h以上；
5、 取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%， 90%， 95%的乙醇各洗 2min ，自然干燥；
6、 将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张， 一张加正义杂交液20ul/片， 另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42。C恒温水浴 箱中16-24h;
7、 取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内
在42"C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min 在42X:恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min 在42X:恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min;
8、 用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9、 将玻片放入保湿盒内，加0. 5%1封闭液(lml封闭液加5mllX缓冲液I工I) 100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min;
10、 取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；
11、 将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8mllX缓冲液 ni)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min;
12、 取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;
13、 1 X缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73. 3ul，显色剂B157. 5ul加 到30mllX缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；
14、 用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的1X缓冲液I混匀)封片 镜检。
四、结果判断
在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。 阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。 所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。
癌症病人CD326过量表达图片见图1。正常人CD326表达图片见图2。 地高辛标记的cDNA、 RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优 点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等 缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫 组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断 目的基因的表达量。
本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中 的CD326基因表达量，用来确定癌症是否发生转移及残存的肿瘤干细胞，临床 研究表明，CD326基因是肿瘤干细胞的相关抗原，因为CD326基因在正常人中 低表达或不表达，如果CD326基因表达高，说明癌症己经发生转移，从而获得 癌症的诊断信息。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING 〈110〉芮屈生物技术(上海)有限公司
〈120〉 一种CD326基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 〈130〉 / 〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3. 1 〈210〉 1 〈211〉 1528 <212〉 醒
〈213〉 智人(Homo sapiens) 〈400〉 1
cggcgagcga gcaccttcga cgcggtccgg
60
ggaccccctc gtcgctgtcc tcccgacgcg
gacccgcgtg ccccaggcct cgcgctgccc ggccggctcc tcgtgtccca ctcccggcgc 120
acgccctccc gcgagtcccg ggcccctccc gcgcccctct tctcggcgcg cgcgcagcat 180
ggcgcccccg caggtcctcg cgttcgggct tctgcttgcc gcggcgacgg cgacttttgc 240
cgcagctcag gaagaatgtg tctgtgaaaa ctacaagctg gccgt肌act gctttgtgaa 300
taata^tcgt caatgccagt gtacttcagt tggtgcacaa aatactgtca tttgctcaaa 360
gctggctgcc肌stgtttgg tgstgaaggc 3gaaatg3at ggctc犯a^c ttgggagaag 420
gLgc肌aacct gaaggggccc tccagaacaa tgatgggctt t3tgatcctg actgcgatgs 480
gsgcgggctc tttaaggcca agcagtgca^ cggcacctcc acgtgctggt gtgtg肌cac 540
tgctggggtc agaagaacag ac肌ggacac tgaa^t肌cc tgctctgsgc g3gtgsg肌c 600
cta^ctgg^tc atcattgaac taa^ax:ax;a^ 3gc^g3g犯aaa^ccttetg 3t3gt肌犯g 660
tttgcggact gcacttcaga aggagatcac aacgcgttat caactggatc caaaatttat 720
cacgagtatt ttgtatgaga ataatgttat cactattgat ctggttcaaa attcttctca 780
aaaaactcag aatgatgtgg acatagctga tgtggcttat tattttgaaa aagatgttaa 840
&ggtgaatcc ttgtttcatt ctaBg肌犯t ggacctgaca gt肌atgggg ^ca^ctgg3 900
tctggatcct ggtcaaactt taatttatta tgttgatgaa aaagcacctg aattctcaat %0
gcagggtcta aaagctggtg ttattgctgt tattgtggtt gtggtgateg cagttgttgc 1020<formula>formula see original document page 17</formula>
权利要求
1.一种CD326基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的癌症是肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫癌、胰腺癌或膀胱癌，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针 序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的标记 物选自放射性核素或非放射性标记物。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的放射性核 素选自3H、 35S、 1251或32P中的一种。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的非放射性 标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的 一种。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。
7. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
8. —种CD326基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物， 其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ IDNO. 1所示，所述的标记 物选自放射性核素或非放射性标记物。
9. 一种CD326基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接 触，形成杂交复合体； b、检测a步骤得到的杂交复合体。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于a步骤中形 成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间 为16 — 24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种CD326基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种CD326基因的原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的癌症是肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫癌、胰腺癌或膀胱癌。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101363050SQ20081004226
公开日2009年2月11日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司