辅助鉴定马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的引物，试剂盒及鉴定方法与流程

本发明涉及蟎类鉴定和蟎类监测领域，具体涉及一种辅助鉴定两种捕食蟎，马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的方法及其专用引物对。

背景技术：
螨类是属于蛛形纲Arachinida、蜱螨亚纲Acari的一大类群微小节肢动物。多生活在仓储物、粮食储藏和加工厂、中药材、枯枝落叶等场所。储粮螨类分布广泛，种类繁多，粉螨亚目、辐螨亚目、革螨亚目和甲螨亚目螨类是储粮螨类的重要组成部分。储粮螨类中既有危害储粮品质的害螨，也有捕食害螨和害虫的捕食螨。普通肉食螨和马六甲肉食蟎是粮库中分布广、数量多的最常见捕食螨种类，主要以植食性蟎(如粉蟎、食酪蟎等)，小型昆虫(如书虱)和储粮害虫的卵和低龄幼虫为食，在一定程度上可以利用其进行生物防治。国内外研究中，已经有利用普通肉食螨和马六甲肉食蟎控制仓储害虫/蟎的相关报道，对粉蟎、害蟎、土耳其扁谷盗、赤拟谷盗和嗜卷书虱等均有一定的防治作用，能达到“以蟎治蟎，以蟎治虫”的效果。粮食的贸易、调运可能促进储藏物蟎类的扩散和传播，从粮库或仓储物中所获得的蟎类以及在国内农业生产疫情监测中所诱捕到的蟎类样品，需对其进行快速、准确的种类鉴定。捕食蟎体型微小，肉眼很难观察到，且有些蟎类存在雌雄异型现象，传统的蟎类鉴定技术是以成虫形态特征为依据，运用形态特征分类方法对其种类进行鉴定，尤其是一些近缘种的鉴定，缺乏清晰可鉴的特征，且一些分类特征一直备受争议，如马六甲肉食蟎与强壮肉食蟎和转开肉食蟎的鉴定等，仅依靠须肢胫节爪上齿的个数、足I跗节支持毛和感棒w1的长短比例，蟎类基于形态特征的鉴定其分类系统中一直不够完善。因此随着分子技术的发展和完善以及DNA条形码的提出和应用，蟎类的鉴定也在尝试分子技术的方法。Osakabe&Sakagami(1994)运用RFLP技术对全爪螨属的几种蟎类进行了鉴定，Owain等(1997)借助RAPD谱带分析技术，鉴别区分出三种不同的盲走螨品系。近几年来，南昌大学夏斌教授的研究团队运用分子技术，对几种常见的肉食蟎的系统发育进行了研究报道，分别运用18SrRNA、28SrRNA、线粒体COI和12SrRNA基因对5种肉食蟎(马六甲肉食蟎、强壮肉食蟎、转开肉食蟎及磷翅触足蟎及中华真扇毛螨)的系统关系进行分析，并基于线粒体COI序列分析中国东南地区马六甲肉食螨的系统地理结构，认为马六甲肉食蟎与强壮肉食蟎为同物异名种。目前还没有针对捕食蟎设计的特异引物的报道，怎么从仓储蟎类中快速、准确、经济的区分捕食蟎是利用其防治害虫/蟎的第一步。运用常规的分子技术进行鉴定，需要对获得的蟎类样品提取基因组DNA、PCR扩增(这里需要测试目标基因如线粒体COI或核糖体RNA基因的可行性)、测序、序列的校正、比对和分析。这个过程需要有一定分子技术背景的人员操作，同时测序需要较大的资金，后期对序列的处理分析也需要时间，是一个费时耗财的过程。设计捕食蟎的特异引物，并形成试剂盒，仅需提取基因组DNA和PCR扩增两个过程便能快速准确鉴定，为捕食蟎检测和应用的奠定基础。

技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的辅助鉴定两种捕食蟎，即马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的引物。本发明的第二个目的是提供快速、准确、使用方便的辅助鉴定马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的PCR鉴定试剂盒。本发明的第三个目的是提供一种辅助鉴定马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一组辅助鉴定马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的引物，包括用于鉴定马六甲肉食蟎的引物对和用于鉴定普通肉食蟎的引物对，具体如下：用于鉴定马六甲肉食蟎的引物对的核苷酸序列如下(靶序列长度约为403bp；因个体差异性靶序列长度处于380-420bp范围内)：Cma-F:5’-AGATTAAGATTTATCATCCGTAGC-3’(SEQIDNO：1)；Cma-R:5’-GAGATGAAATTGATAGATGAAATG-3’(SEQIDNO：2)。用于鉴定普通肉食蟎的引物对的核苷酸序列如下(靶序列长度约为421bp；因个体差异性靶序列长度处于400-450bp范围内)：Cer-F:5’-ACATCCCATGCCATTATTATAATC-3’(SEQIDNO：3)；Cer-R:5’-AAAGAGAGTAAAAGAAGGATAGTG-3’(SEQIDNO：4)。进一步地，本发明提供一种辅助鉴定马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒具有如下(a)和/或(b)所述的功能：(a)辅助鉴定马六甲肉食蟎和/或普通肉食蟎；(b)辅助鉴定两种形态相似的肉食蟎，马六甲肉食蟎和普通肉食蟎。具体地，该试剂盒包括上述用于鉴定马六甲肉食蟎的引物对和用于鉴定普通肉食蟎的引物对，进一步，该试剂盒还包括完成PCR反应所需的PCR缓冲液(含Mg2+)、dNTPs、DNA聚合酶、DEPC水等。其中上述组分可以单独包装，也可以根据需要任意组合。本发明还提供了一种辅助鉴定马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的方法：(1)提取待测蟎类的基因组DNA，可以使用现有技术中已知的商业化试剂盒或方法进行提取；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应；其中所述PCR扩增反应使用的引物如序列表中SEQIDNO：1至SEQIDNO：4所示，其中序列SEQIDNO：1和SEQIDNO：2为用于鉴定马六甲肉食蟎的引物对，序列SEQIDNO：3和SEQIDNO：4为用于鉴定普通肉食蟎的引物对；进一步地，PCR扩增反应条件为95℃预变性3min；95℃变性30sec、60℃退火和延伸1min，30个循环；60℃5min；(3)结果判定，用所述马六甲肉食蟎引物对进行PCR扩增，如果得到380-420bp的PCR扩增产物，例如403bp，所述待测蟎类为候选的马六甲肉食蟎；用所述普通肉食蟎特异引物对进行PCR扩增，如果得到400-450bp的PCR扩增产物，例如421bp，所述待测蟎类为候选的普通肉食蟎；如果没有得到目标片段的PCR扩增产物，所述待测蟎类为候选的非马六甲肉食蟎和普通肉食蟎。在本发明中，所述待测蟎类为普通肉食蟎Cheyletuseruditus,Schrank、马六甲肉食蟎CheyletusmalaccensisOudemans、粗脚粉蟎AcarussiroL.、腐食酪蟎Tyrophagusputrescentiae(Schrank)、线嗜酪蟎TyroborusliniOudemans、椭圆食粉蟎Aleuroglyphusovatus(Troupeau)、害嗜鳞蟎Lepidoglyphusdestructor(Schrank)、家食甜蟎Glycyphagusdomesticus(DeGeer)、拱殖嗜渣蟎Chortoglyphusarcuatus(Troupeau)、甜果蟎Carpoglyphuslactis(L.)。本发明还要求保护上述引物或试剂盒在辅助鉴定马六甲肉食蟎或普通肉食蟎中的应用。本发明还要求保护上述引物或试剂盒在辅助鉴定待测储藏物，如粮食及其产品，中药材等是否存在马六甲肉食蟎和普通肉食蟎中的应用。本发明具有如下优点：(1)实现了两种捕食满(马六甲肉食蟎和普通肉食蟎)快速鉴定，解决了其非成虫态样品的鉴定问题，开辟了两种形态相似肉食蟎(马六甲肉食蟎和普通肉食蟎)鉴定的新途径；(2)操作简便，经济易行，传统形态鉴定方法一般需要玻片标本制作技能，对样品完整性等要求高，而特异引物分子鉴定方法可标准化，操作简便，便于无专业分类学知识背景的工作人员操作与运用，在实际工作中容易推广应用；(3)检测灵敏度高，耗时短，且所需费用较低。附图说明图1为马六甲肉食蟎特异引物对特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图。图2为普通肉食蟎特异引物对特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图。图3为马六甲肉食蟎特异引物对灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M对应DNA相对分子量标准，泳道1-5依次对应DNA稀释液75ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL，泳道6对应阴性对照。图4为普通肉食蟎特异引物对灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M对应DNA相对分子量标准，泳道1-5依次对应DNA稀释液75ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL，泳道6对应阴性对照。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、特异引物对的设计一、实施过程首先收集粮库及仓储物上常见的蟎类样品，其中包括形态相似的马六甲肉食蟎和普通肉食蟎。通过基因组DNA提取和PCR扩增获取其线粒体细胞色素氧化酶亚基I条形码(mtDNACOIbarcode)序列，同时收集BOLD数据库和GenBank中螨类的mtDNACOI条形码基因序列。在此基础上，采用DNAMAN软件对不同种的mtDNACOI条形码进行比对分析，查找马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的特异序列区段。采用人工设计马六甲肉食蟎和普通肉食蟎的特异引物对，并用Oligo软件和Blast程序对引物进行评估检查。在标准的PCR反应体系和反应条件下，对特异引物进行筛选，仅对该引物所对应的目标种——马六甲肉食蟎或普通肉食蟎为阳性反应(产生特异性条带)，对其余种类均为阴性反应(无特异性条带产生)的引物即为马六甲肉食蟎或普通肉食蟎的特异引物对。二、结果用于鉴定马六甲肉食蟎的引物对的核苷酸序列如下(靶序列长度约为403bp；因个体差异性靶序列长度处于380-420bp范围内)：Cma-F:5’-AGATTAAGATTTATCATCCGTAGC-3’(SEQIDNO：1)；Cma-R:5’-GAGATGAAATTGATAGATGAAATG-3’(SEQIDNO：2)。用于鉴定普通肉食蟎的引物对的核苷酸序列如下(靶序列长度约为421bp；因个体差异性靶序列长度处于400-450bp范围内)：Cer-F:5’-ACATCCCATGCCATTATTATAATC-3’(SEQIDNO：3)；Cer-R:5’-AAAGAGAGTAAAAGAAGGATAGTG-3’(SEQIDNO：4)。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成三、关于引物设计1.DNA提取选取天根生化科技有限公司生产的微量基因组DNA提取试剂盒，将蟎类样品清洗晾干后，加入提取液，在体视显微镜下用研磨棒研磨，根据提取程序进行，最后在DNA的洗脱上采用TE两次洗脱，每次为25μL。2.COI序列的筛选和获得截至目前，没有关于蟎类特异引物的报道，关于仓储蟎类的DNA序列报道较少，缺乏参考数据。在获取供试10种蟎类COI序列时，我们选取了3对通用引物见表1。发现LWCOI_U/LWCOI_L引物扩增400bp左右的片段，在10种蟎种差异性极小，4种蟎的该片段区域完全一致(家食甜螨、腐食酪螨和甜果螨)，无法进行特异引物设计。而引物对LCO-1490/HCO-2198在10种蟎中扩增的通用性不强，仅扩增出了马六甲肉食蟎、粗脚粉蟎、椭圆食粉螨和家食甜螨，无法获得所有蟎类该片段的序列，不能进行特异引物设计。引物LEP-F1/LEP-R1对仓储蟎类的扩增通用性好，扩增序列长度为650bp，含有各种蟎类的特异位点，适合做特异引物设计。表1本实施例中使用的COI序列引物3.特异引物设计和筛选在获得的引物LEP-F1/LEP-R1对扩增出的10种蟎的COI序列后，筛选出了特异位点，针对普通肉食蟎设计了5条上游引物和4条下游引物；马六甲肉食蟎设计了4条上游引物和5条下游引物，通过各自上下游引物两两配对，最终筛选出普通肉食蟎P-4F/P-4R(Cer-F/Cer-R)引物对和马六甲肉食蟎M-2F/M-5R(Cma-F/Cma-R)引物对是各自理想的特异引物。表2普通肉食蟎和马六甲肉食蟎特异引物设计实施例2试剂盒的组成和使用该试剂盒包括实施例1设计的用于鉴定马六甲肉食蟎的引物对(Cma-F/Cma-R)和用于鉴定普通肉食蟎的引物对(Cer-F/Cer-R)，10×PCR缓冲液(含Mg2+)、dNTPs、TaqDNA聚合酶和DEPC水，以上试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。试剂盒的使用：(1)提取待测蟎类的基因组DNA，可以使用现有技术中已知的商业化试剂盒或方法进行提取；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用以上两对引物分别进行PCR扩增反应；反应体系(25μL)：Taq酶(5U/μL)0.2μL、10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL、dNTPs(2.5μM)2μL、上下游引物各0.5μL(一个PCR加入引物对Cma-F/Cma-R，另一个PCR加入引物对Cer-F/Cer-R)、模板2μL、ddH2O补至25μL。(3)结果判定，用所述马六甲肉食蟎引物对进行PCR扩增，如果得到380-420bp的PCR扩增产物，例如403bp，所述待测蟎类为候选的马六甲肉食蟎；用所述普通肉食蟎特异引物对进行PCR扩增，如果得到400-450bp的PCR扩增产物，例如421bp，所述待测蟎类为候选的普通肉食蟎；如果没有得到目标片段的PCR扩增产物，所述待测蟎类为候选的非马六甲肉食蟎和普通肉食蟎。其中，常规PCR的扩增程序一般是3步法，即94-95℃变性、退火和延伸，本研究中通过摸索创新，采用了2步法，即把退火和延伸设为一个温度，结果显示目标条带唯一清晰，基本没有引物二聚体和其它非特异扩增，引物特异性强。PCR扩增2步法的循环参数：95℃预变性3min；95℃变性30sec、60℃退火和延伸1min，30个循环；60℃5min。实施例3、特异性实验普通肉食蟎Cheyletuseruditus,Schrank、马六甲肉食蟎CheyletusmalaccensisOudemans、粗脚粉蟎AcarussiroL.、腐食酪螨Tyrophagusputrescentiae(Schrank)、线嗜酪螨TyroborusliniOudemans、椭圆食粉螨Aleuroglyphusovatus(Troupeau)、害嗜鳞螨Lepidoglyphusdestructor(Schrank)、家食甜螨Glycyphagusdomesticus(DeGeer)、拱殖嗜渣螨Chortoglyphusarcuatus(Troupeau)、甜果螨Carpoglyphuslactis(L.)：保存于国家粮食局科学研究院。一、实验样本10种仓储螨类样本均采集于我国和捷克粮库，其中马六甲肉食蟎来源于我国海南海口粮库，其余蟎类样品均来自于捷克，样品于2012年收集后于-80℃条件下保存在无水乙醇中，其中普通肉食蟎和马六甲肉食蟎为实验室饲养活虫，具体信息见表2。表2本实施例中使用的10种蟎类样本二、特异引物对的特异性将10种螨类，普通肉食蟎和马六甲肉食蟎各8头样品(5头成虫，3头卵)，其余种类各5头样本分别进行如下实验：1、提取单头蟎的基因组DNA，同实施例1。2、以步骤1的基因组DNA为模板，参照实施例2对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增采取2步法，的循环参数：95℃预变性3min；95℃变性30sec、60℃退火和延伸1min，30个循环；60℃5min。3、取5μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶系统中观察并成像分析。马六甲肉食蟎的结果见图1，泳道M对应DNA相对分子量标准(D2000)，泳道1-2为马六甲肉食蟎(成虫)，3-4为马六甲肉食蟎(卵)，5-6为普通肉食蟎(5为成虫，6为卵)，7-8为粗脚粉蟎，9-10为腐食酪螨，11-12为线嗜酪螨，13-14椭圆食粉螨，15-16害嗜鳞螨，17-18家食甜螨，19-20拱殖嗜渣螨，21-22甜果螨，23-24阴性对照。普通肉食蟎的结果见图2，泳道M对应DNA相对分子量标准(D2000)，泳道1-2为普通肉食蟎(成虫)，3-4为普通肉食蟎(卵)，5-6为马六甲肉食蟎(5为成虫，6为卵)，7-8为粗脚粉蟎，9-10为腐食酪螨，11-12为线嗜酪螨，13-14椭圆食粉螨，15-16害嗜鳞螨，17-18家食甜螨，19-20拱殖嗜渣螨，21-22甜果螨，23为阴性对照。马六甲肉食蟎无论是成虫还是卵，均在380bp-420bp之间显示一条特异性条带；普通肉食蟎无论是成虫还是卵，均在400bp-450bp之间显示一条特异性条带，其它蟎均不显示所述特异性条带。4、回收各个特异性条带并进行测序验证，马六甲肉食蟎各个特异性条带均为403bp，普通肉食蟎各个特异性条带均为421bp。实施例4、灵敏度实验1、提取表2中的样本1的基因组DNA。2、将步骤1提取的基因组DNA用TE缓冲液进行系列稀释，得到5种稀释液；稀释液1至稀释液5中的基因组DNA浓度依次为：75ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL。3、分别以每种稀释液为模板(水为阴性对照)，参照实施例2对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。4、取5μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶系统中观察并成像分析。马六甲肉食蟎和普通肉食蟎结果分别见图3和图4，泳道M对应DNA相对分子量标准，泳道1-5依次对应稀释液1至稀释液5，泳道6对应阴性对照。结果表明，针对两种捕食蟎，只要模板中DNA浓度为1ng/μL以上，均可显示所述特异性条带，普通肉食蟎DNA浓度到达一定高度后，所述特异性条带亮度不随其浓度的升高而增加。所设计的两种捕食蟎的特异引物扩增灵敏度高，能够检测到模板浓度为1ng/μL及以上样品。