咖啡酰奎宁酸衍生物及作为神经元修复及保护药物的应用的制作方法

本发明属生物制药领域，特别是涉及一种咖啡酰奎宁酸衍生物，该衍生物具有对神经元修复和保护的作用。

背景技术：
：

神经退行性疾病是一种大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态。大脑和脊髓由神经元组成，神经元有不同的功能，如控制运动，处理感觉信息，并作出决策。大脑和脊髓的细胞一般是不会再生的，所以过度的损害可能是毁灭性的，不可逆转的。神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，导致功能障碍。初步治疗取决于具体疾病的诊断。目前，仅有少数几个药物可用于一些神经退行性疾病。因此，寻找安全有效的治疗药物迫在眉睫。

牛蒡，为菊科牛蒡属二年生草本植物，又名“恶实”、白肌人参或蒡翁菜等。作为抗衰老、降血糖的特种保健蔬菜和经济作物，牛蒡在中国有广泛种植。牛蒡根在《药性论》、《本草拾遗》等典籍中多有记载，有抗氧化防衰老的作用，但没有形成中草药类的商品，多作为牛蒡子的副产品而废弃不用。近年来，国内外学者研究发现，牛蒡根对人体具有多种药理作用,包括保肝，抗炎和抗氧化等，这些功效与其含有大量的咖啡酰奎宁酸化合物有关。但牛蒡根中具有何种结构的咖啡酰奎宁酸衍生物对神经元所起到的作用却未见报道。

技术实现要素：
：

发明目的：本发明的目的在于提供一种咖啡酰奎宁酸衍生物，这些衍生物均为新的化合物。

本发明的另一目的在于提供一种咖啡酰奎宁酸衍生物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种咖啡酰奎宁酸衍生物制备用于神经元修复和保护药物的应用。

本发明的再一目的在于提供一种含有上述咖啡酰奎宁酸衍生物的药物组合物，和一种以上药学可接受的载体。

技术方案：

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种咖啡酰奎宁酸衍生物，具体包括具有下式结构的化合物或其药学上可接受的盐：

所述的药学上可接受的盐可以是酸加成盐、碱加成盐或两性离子存在。

例如：乙酸盐、盐酸盐、硫酸盐、苯甲酸盐等。

本发明含有上述咖啡酰奎宁酸衍生物的药物组合物，和一种以上药学可接受的载体。

所述载体包括各种药用辅料、包材等。根据制剂需要进行选择。例如辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂等，可以适用于口服、吸入、非肠胃给药或表面给药；剂型包括但不限于注射剂、溶液剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等。

一种如上所述咖啡酰奎宁酸衍生物，可制备用于神经元修复和保护药物的应用。所述咖啡酰奎宁酸衍生物的应用，可以是神经退行性疾病、创伤性脑损伤、中风疾病药物。

一种如上所述咖啡酰奎宁酸衍生物的制备方法，其特征在于：取牛蒡根药材，8-20倍量的质量百分比为55％乙醇水溶液浸泡，加热回流提取3次，第一次2h，后两次1h；合并提取液，减压回收溶剂得到浓缩浸膏；将浸膏分散于适量水中，用乙酸乙酯萃取；减压回收溶剂得到乙酸乙酯萃取物，运用色谱分离手段，对乙酸乙酯层萃取物进行提取分离，得到所述的咖啡酰奎宁酸衍生物；结合理化性质和现代波谱学手段，鉴定结构式如下：

优点及效果：本发明的二咖啡酰奎宁酸衍生物具有显著的神经元修复和保护活性，可开发用于神经退行性疾病、创伤性脑损伤、中风疾病等疾病的治疗，为此类疾病的治疗提供潜在的机会。

附图说明：

1、附图1为本发明两个新化合物的结构图；

2、附图2为MTT[3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-苯基溴化四氮唑蓝]法测定的咖啡酰奎宁酸衍生物对过氧化氢介导的SH-SY5Y细胞损伤的修复结果示意图；注：纵坐标为细胞存活率，横坐标：con组代表空白组，其他组均加入400μM的过氧化氢，其中7.5，15，30和15,30,60分别代表不同浓度的给药组。下同。

3、附图3为LDH(乳酸脱氢酶)法测定的咖啡酰奎宁酸衍生物 对过氧化氢介导的SH-SY5Y细胞损伤的修复结果示意图。

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的描述，但发面的实施例方式不限于此。

下面通过以下实施例进一步详细说明本发明。

实施例1：咖啡酰奎宁酸衍生物A和B的制备。

牛蒡根药材10.0kg，8-20倍量的质量百分比55％乙醇水溶液浸泡过夜，加热回流提取3次，第一次2h，后两次1h。合并提取液，减压回收溶剂得到浓缩浸膏。将浸膏分散于适量水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。减压回收溶剂得到石油醚萃取物(15.6g)，二氯甲烷萃取物(43.1g)，乙酸乙酯萃取物(256.8g)和正丁醇萃取物(843.2g)。经检测，乙酸乙酯层活性最佳。将乙酸乙酯萃取物(256.8g)过硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇洗脱(100：1-1:100)，得到15个流份。将流份Fr.12(10g)用ODS柱色谱分离,洗脱溶剂甲醇水(10:90-100:0)，得到18个流份。流份Fr.12-10用ODS柱色谱分离,洗脱溶剂甲醇水(10:90-100:0)，得到10个流份。流份Fr.12-10-4(800mg)用制备液相制备，色谱条件(JASCO制备型高效液相色谱仪，YMC-Pack Pro ODS-A C18,Ф250×10mm,10μm，水：乙腈：三氟乙酸＝77.5：22.5：1)，得到A(18mg,rt＝65min)和B(80mg,rt＝48min)。

化合物A的HR-MS数据和NMR数据：HR-TOF-MS m/z(rel.int.):645.1453[M-H⁺]^-(calcd.645.1456for C₃₀H₂₉O₁₆)；¹H-NMR(600MHz,CD3OD):δ:7.60，7.55(each 1H,d,J＝15.8Hz,H-7″,7″′),7.07,7.05(each 1H,d,J＝1.9Hz,H-2″,2″′),6.98,6.96(each 1H,dd,J＝1.9,8.1Hz,H-6″,6″′),6.79,6.77(each 1H,d,J＝8.1Hz,H-5″,5″′),6.32,6.23(each 1H,d,J＝15.8Hz,H-8″,8″′),5.58(1H,m,H-5),5.10(1H,dd,J＝3.2,8.5Hz,H-4),4.54(1H,m,H-3′),4.44(1H,m,H-3),3.70(OCH₃),2.78(1H,d,J ＝5.2,16.0Hz,H-2′a),2.60(1H,d,J＝5.2,16.0Hz,H-2′b),2.60(1H,m,H-6a),2.50(1H,m,H-2a),2.50(1H,m,H-2b),2.16(1H,m,H-6b).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ:174.9(C-1′),171.2(C-7),169.9(C-4′),168.1(C-9″),168.0(C-9″′),149.7(C-4″),149.1(C-4″′),147.7(C-7″),147.7(C-7″′),146.8(C-3″),146.8(C-3″′),127.8(C-1″),127.7(C-1″′),123.1(C-6″),123.1(C-6″′),116.5(C-5″),116.5(C-5″′),115.3(C-2″),115.2(C-2″′),115.1(C-8″),114.7(C-8″′),80.5(C-1),75.5(C-4),68.4(C-2′),68.3(C-5),67.2(C-3),52.8(OCH₃),40.2(C-3′),37.4(C-6),35.7(C-2).

化合物B的HR-MS数据和NMR数据：HR-TOF-MS m/z(rel.int.):669.1439[M+Na]⁺(calcd.669.1432for C₃₀H₃₀O₁₆Na)；¹H-NMR(600MHz,CD₃OD):δ:7.62，7.61(each 1H,d,J＝15.8Hz,H-7″,7″′),7.10,7.07(each 1H,d,J＝1.9Hz,H-2″,2″′),7.00,6.96(each1H,dd,J＝1.9,8.3Hz,H-6″,6″),6.81,6.79(each 1H,d,J＝8.2Hz,H-5″,5″′),6.35,6.30(each 1H,d,J＝15.8Hz,H-8″,8″′),5.47(1H,m,H-3),5.43(1H,m,H-5),4.47(1H,m,H-2')3.95(each 1H,dd,J＝3.7,9.4Hz,H-4),3.56(OCH₃),2.77(1H,m,H-2a)2.71(2H,m,H-3'),2.62(1H,m,H-6a),2.45(1H,m,H-2b),2.00(1H,m,H-6b).¹³C-NMR(150MHz,CD₃OD):δ:175.0(C-1′),174.0(C-7),171.3(C-4′),168.6(C-9″′),167.7(C-9″),149.8(C-4″),149.6(C-4″′),148.1(C-7″),147.4(C-7″′),146.8(C-3″),146.7(C-3″′),127.7(C-1″),127.6(C-1″′),123.3(C-6″),123.0(C-6″′),115.3(C-8″),115.3(C-2″),115.2(C-8″′),115.2(C-2″′),115.0(C-5″),114.9(C-5″′),80.5(C-1),73.2(C-3),71.6(C-4),71.0(C-5),68.2(C-2′),52.8(OCH₃),40.3(C-3′),37.9(C-6),32.7(C-2).

实施例2：咖啡酰奎宁酸衍生物体外神经细胞的修复和保护活性研究。

本发明采用MTT和LDH活性测试法测定咖啡酰奎宁酸衍生物对过氧化氢介导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，结果表明咖啡酰奎宁酸衍生物具有显著的修复神经细胞的作用，因此可以用于研究开发治疗神经退行性疾病、中风及创伤性脑损伤药物。

(1)仪器与试剂：DMEM培养基购自Hyclone公司，胎牛血清为Hyclone产品；CKX31型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)；5810R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；全自动酶标仪(美国Biotek集团)；过氧化氢(国药集团化学试剂有限公司)；LDH试剂盒(南京建成)

(2)细胞培养：将复苏后的细胞转移至培养瓶中，37℃培养箱中培养(5％CO₂，相对湿度90％)，隔天更换培养液。待细胞长满瓶壁的80-90％左右时，进行传代或下步试验，控制细胞密度在1×10⁵cells/mL左右。

(3)MTT法测定生物活性：取指数生长期的SH-SY5Y细胞，接种于96孔培养板中，细胞数密度为1×10⁵个/mL，每孔加入100μL，置37℃，5％CO₂孵箱中培养12h，细胞贴壁后每孔加入100ul400umol/L过氧化氢损伤8h，损伤结束后弃去培养液，分别加入不同浓度(20ug/ml,40ug/ml,80ug/ml)的新化合物培养液200ul，每个浓度设3个复孔，置37℃、5％CO₂孵箱中培养24h。24h后每孔加入MTT(5mg/mL)20μl，继续在孵箱中孵育4h。弃去上清，每孔加入150μlDMSO，在490nm处测定吸光值(OD值)。按照下式计算活细胞的比例：

活细胞所占比例(Cell Viability)＝(加药组OD值)/(对照组OD)值×100％

结果如下：如图2所示，与损伤组相比较，加药组的细胞生存率明显高于损伤组，化合物A在7.5，15和30μM浓度下的细胞存活率为52％，64％和78％；化合物B在15，30和60μM浓度下的细胞存活率为58％，69％和82％。

(4)LDH法测定活性：取指数生长期的SH-SY5Y细胞，接种于 96孔培养板中，细胞数密度为1×10⁵个/mL，每孔加入100μL，置37℃，5％CO₂孵箱中培养12h，细胞贴壁后每孔加入100ul 400umol/L过氧化氢损伤6h，损伤结束后弃去培养液，分别加入不同浓度(20ug/ml,40ug/ml,80ug/ml)的新化合物的培养液200ul，每个浓度设3个复孔，置37℃、5％CO₂孵箱中培养24h。24h后取上清液，按照LDH试剂盒说明书要求进行反应。反应结束后，在酶标仪450nm处测定OD值。

LDH释放量的结果表示为相当于空白组的百分数。

结果显示：如图3所示，与损伤组相比较，加药组的LDH释放量明显低于损伤组，化合物A在7.5，15和30μM浓度下的LDH释放量为230％，130％和110％；化合物B在15，30和60μM浓度下的LDH释放量为294％，231％和139％。

上述结果表明：咖啡酰奎宁酸衍生物均具有较好的神经细胞修复活性，且在一定剂量范围内呈现良好的剂量依赖性关系。

实施例3：药物组合物的制备

化合物A 6.5g

糊精 80g

按常规方法，将上述物质混合均匀后，分1000等份分别装入普通明胶胶囊，得到1000颗胶囊。

实施例4：药物组合物的制备

化合物B 6.5g

糊精 80g

按常规方法，将上述物质混合均匀后，分1000等份分别装入普通明胶胶囊，得到1000颗胶囊。

上述实施例3、4所述载体为糊精，载体也可以包括各种药用辅料、包材等。根据制剂需要进行选择，例如辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂等，可以适用于口服、吸入、非肠胃给药或表面给药；剂型包括但不限于注射剂、溶液剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的框架包含范围之内。