一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌的制作方法

本发明涉及微生物领域中一株具有高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌黑附球菌(Epicoccum nigrum)。

背景技术：

植物的代谢产物可分为两类，即初生代谢产物和次生代谢产物。初生代谢产物是指维持植物体正常生命活动所必需的物质和能量代谢，如脂类、氨基酸、核酸以及它们的多聚体等，这些物质的分子量一般很大，又称为大分子化合物。次生代谢产物是由次生代谢产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物(习惯上称为天然产物)，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、甾体及其甙、生物碱七大类。内生真菌的研究日益成为天然产物化学研究者关注的热点之一，内生真菌次级代谢产物的种类繁多，包括生物碱类、甾体类、萜类、苯并吡喃和苯并呋喃类、香豆素和异香豆素类、醌类、黄酮类、酚和酚酸类、内酯类、脂肪族化合物、氨基酸、肽类等，其药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核、抗氧化等作用。

野生大豆野大豆具有许多优良形状，如耐盐碱、抗寒、抗病等，与大豆是近缘种，而大豆是中国主要的油料及粮食作物、故在农业育种上可利用野大豆进一步培育优良的大豆品种。齐墩果酸具有护肝降酶、促进肝细胞再生、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤等作用，还具有降血糖、降血脂、镇静的作用，是开发治疗肝病和降血糖等药物有效成分。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌，为齐墩果酸原料的生产提供新的方法和途径。

本发明一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌，它为黑附球菌(Epicoccum nigrum)已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号2015393，保藏地点武汉市武汉大学，保藏日期2015年6月19日。

本发明一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌，它在PDA培养基上培养，菌落平展，初点状生长，棉絮状，白色，后期粉红色、红色、黄褐色或灰褐色，有时在一个菌落上可以同时产生几种颜色。

8.本发明一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌，它为黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1，属壳霉目，杯霉科，半知菌亚门附球菌属。

本发明一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌，它为为黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1，依据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》。可见YsyS1菌株的菌落特征和孢子形态与黑附球菌特征极为相近。

本发明一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌，它为黑附球菌(Epicoccum nigrum)，其序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA6.0软件构建系统进化树。YsyS1菌株序列与黑附球菌(Epicoccum nigrum)菌株的同源序列到了99％以上。结合形态学观察结果。鉴定YsyS1菌株为黑附球菌(Epicoccum nigrum)

本发明一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌，它为黑附球菌(Epicoccum nigrum)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号2015393，保藏地点武汉市武汉大学，保藏日期2015年6月19日。

本发明从野生大豆的叶片中分离得到野生大豆内生真菌，它为黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1，采用HPLC法对野生大豆内生真菌YsyS1的发酵代谢产物进行测定，结果显示，野生大豆内生真菌YsyS1次生代谢产物中含有齐墩果酸，该成分不仅具有广谱抗菌性，而且还具有护肝降酶、促进肝细胞再生、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤等作用，还具有降血糖、降血脂、镇静的作用，是开发治疗肝病和降血糖等药物有效成分。

本发明中的野生大内生真菌黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1，其次生代谢产物中含有齐墩果酸，因此可采用发明的野生大豆内生真菌YsyS1发酵法生产齐墩果酸，为齐墩果酸原料的生产提供新的方法。

保藏说明

菌种名称：黑附球菌属

拉丁名：(Epicoccum nigrum)

菌株编号：YsyS1

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国武汉武汉大学

保藏日期：2015年6月19日

保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 2015393

附图说明

图1为生长5天的黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1在10倍光学显微镜下的菌丝形态。

图2为生长7天的黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1在40倍光学显微镜下的菌丝形态。

图3为生长15天的黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1的菌落形态。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

具体实施方式一：

本实施方式一株高产齐墩果酸的野生大豆内生真菌，它为黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC M 2015393，保藏地点武汉市武汉大学，保藏日期2015年6月19日。

本实施方式中黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1，它在PDA固体培养基上培养，菌落平展，初点状生长，棉絮状，白色，后期粉红色、红色、黄褐色或灰褐色，有时在一个菌落上可以同时产生几种颜色(如图1和图2)。

本实施方式中黑附球菌(Epicoccum nigrum)YsyS1，其生长温度为28℃，生长pH值自然。

本实施方式中黑附球菌(Epicoccum nigrum)YysS1，该菌株分离自然健康的野生大豆的叶片。实验材料分别于与2012年及2013年6月30日、7月30日采自黑龙江省阿城区亚沟林场沟边地区，并经东北农业大学生命科学院吴秀菊教授鉴定为野生大豆植株。样本现在存于东北农业大学生命科学院植物生物工程研究室；它按一下过程进行分离培养：

将野生大豆叶片(采自中国黑龙江省阿城区亚沟林场)进行消毒。将氯霉素加入2％麦芽粉琼脂培养基使其含量为50mg/L，得到麦芽粉氯霉素平板；用PDA固体培养基制成PDA固体平板。将上述消毒后的野生豌豆叶片切成0.5cm²的小块放在麦芽粉氯霉素平板上，25℃黑暗培养5天。将从野生大豆叶片组织切口边缘处长出的内生真菌菌丝逐个用接种环接至PDA固体平板上进行菌种纯化。将筛选到的其中一株内生真菌命名为内生真菌YsyS1。

马铃薯培养基(PDA)：每L由200g的马铃薯、20g的蔗糖和余量的水组成，pH自然，121℃高压灭菌30min；其中马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤。

马铃薯培养基(PDA)：每L由200g的马铃薯、20g的蔗糖，16g的琼脂粉和余量的水组成，pH自然，121℃高压灭菌30min；其中马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤。

斜面固体培养基：取5ml。马铃薯固体培养基装于试管中，121℃高压灭菌30min，铺成斜面冷却，以备保存菌种。

试验主要仪器设备和试剂见表1：

表1

从健康的野生大豆的茎秆中分离出内生真菌YsyS1，并且阴性对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。

具体实施二、内生真菌YsyS1的鉴定

从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的内生真菌YsyS1：

2.1形态学鉴定

将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的内生真菌YsyS1进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘特征(是否整齐、不规则、放射状等)，产孢时间等。菌落外观形态特征采集使用佳能60D相机(18-200mm IS，日本)，技术参数为：APS-C规格数码单反；1800万有效像素；10倍光学变焦。对处于对数生长期的所述内生真菌YsyS1，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌丝的形态，包括菌丝的表面状态、菌丝的显微结构(如子座、分生孢子梗、分生孢子等)。菌落显微观察使用正立生物显微镜Axioskop2plusFL(蔡司，德国)，技术参数：消色差－消球差多功能聚光镜；照明系统为100W卤素灯，柯勒照明；五档荧光分光器；

HB050，HB0103光源。采用Axioplan 2 imaging MOT软件进行图像采集与分析。结果表明(图1、图2和图3)，上述步骤一分离并纯化得到的内生真菌YsyS1具有如下形态特征：培养5天时菌落中央为红色，边缘透明，白色菌丝，棉絮状，疏松；培养7天时中央红色菌丝变为黄色，四周为红色菌丝环，外周为白色菌丝，背面中央为深红色，外围白色。体视镜下清晰可见紧密着生在球形分生孢子座上的黑色分生孢子。菌丝体表生或埋生。菌丝无色或淡褐色，具隔膜，分枝或少数不分枝，光滑，宽1.5－2.5μm。分生孢子座垫状，有时培养中并不明显。分生孢子梗常短粗，直立或弯曲，0－2隔膜，光滑，无色或极淡褐色，3－5×1－2μm。分生孢子从分生孢子梗顶端膨大处生出，初无色或极淡黄色，无隔膜，后黄褐色、褐色或黑色。

2.2分子生物学鉴定

用CTAB法提取内生真菌YsyS1基因组DNA。以上述提取的内生真菌YSYS1基因组DNA作为扩增模板，以真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1：5′-CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA-3′和ITS4：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3′为引物进行PCR反应。反应程序为：94℃变性40s、55℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环。对得到的PCR产物进行测序，测序结果表明内生真菌YsyS1的rDNA-ITS序列如SEQ ID No.1所示，将该序列与NCBI和EzTaxon数据库中已公开的rDNA-ITS序列进行在线同源性比对，结果显示内生真菌YsyS1与黑附球菌(Epicoccum nigrum)真菌核酸序列同源性最高，相似性为100％。

根据上述形态、分子生物学分析和rDNA-ITS序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的内生真菌YsyS1鉴定为黑附球菌，定名为黑附球菌(Epicoccum nigrum)。该内生真菌YsyS1已于2015年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC M 2015393。内生真菌YsyS1的全称为黑附球菌YsyS1(Epicoccum nigrum.YsyS1)CCTCC NO：M CCTCC M 2015393，简称为黑附球属(Epicoccum nigrum)YsyS1。

2.3黑附球菌YsyS1(Epicoccum nigrum.YsyS1)的菌种保藏

将液体保藏培养基灭菌(液体保藏培养基：溶质及其浓度为：15％(体积百分比浓度)甘油，葡萄糖10g/L，酵母提取物1g/L，酪蛋白水解物1g/L；溶剂为去离子水；pH自然)，在无菌的1.5mL离心管中加入1mL液体保藏培养基，挑取黑附球菌YsyS1(Epicoccum nigrum.YsyS1)菌落边缘菌丝接种至保藏液中，盖好离心管盖并用封口膜封口，放入4℃冰箱预冷后，再放入-80℃冰箱中保藏即可。

2.4黑附球菌YsyS1(Epicoccum nigrum.YsyS1)最适摇瓶发酵条件的研究和菌丝体生长速率测定

以菌丝体生物量(干重)作为衡量指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线，对黑附球属(Epicoccum nigrum.)YsyS1菌株最适摇瓶发酵条件进行研究。结果表明黑附球菌YsyS1(Epicoccum nigrum.YsyS1)的适宜发酵条件为：采用PDA液体培养基在三角瓶中进行摇瓶发酵培养，发酵培养的培养温度可为20℃-30℃。采用250mL三角瓶作为发酵容器，250mL三角瓶中PDA液体培养基的装液量可为100mL-150mL，进行旋转震荡培养，摇床的转速可为120rpm-180rpm，旋转半径为13mm，发酵培养的培养时间具体可为8天-15天。

黑附球菌YsyS1(Epicoccum nigrum.YsyS1)的最适摇瓶发酵条件为：采用PDA液体培养基在三角瓶中进行摇瓶发酵培养，发酵培养的培养温度25℃。采用250mL三角瓶作为发酵容器，250mL三角瓶中PDA液体培养基的装液量为120mL，进行旋转震荡培养，摇床的转速160rpm，旋转半径为13mm，发酵培养的培养时间为10天。

结果表明：在上述最适摇瓶发酵条件下发酵培养黑附球菌YsyS1(Epicoccum nigrum.YsyS1)，10天后离心发酵液，收集菌丝体，将得到的菌丝体命名为菌丝体1；将菌丝体1置于锡箔纸上在烘箱中60℃烘干至恒重得到的菌丝体命名为菌丝体2。菌丝体2放入干燥器内冷却再称量，即为菌丝体生物量(干重)。结果表明，分析天平称量菌丝体2的生物量(干重)为2.2g，计算可得菌丝体生长速率为0.22g/d。

具体实施三、黑附球菌YsyS1(Epicoccum nigrum.YsyS1)菌丝体中次生代谢产物齐墩果酸含量测定

3.1准确称取齐墩果酸对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司)2.5mg于25ml容量瓶中，95％乙醇水溶液溶解并定容至25ml，配成0.1mg/mL齐墩果酸母液。精确吸取齐墩果酸母液0.025ml、0.1ml、0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml分别置于5ml容量瓶中，95％乙醇水溶液定容至5ml。分别取100μl置于10ml离心管中，70℃水浴蒸干。向上述离心管中加入200μl的5％香草醛-冰乙酸(溶质及其浓度为：香草醛50.0g/L；溶剂：冰乙酸；pH：自然)和800μl高氯酸(天津华特化研科技公司产品)，70℃水浴15min，迅速放入冰中冷却后用乙酸乙酯定容到5ml。用分光光度计分别测定各浓度标准溶液在551nm处的吸光度值，3次重复。以齐墩果酸含量(mg/mL)为横坐标，OD551值为纵坐标，绘制齐墩果酸标准曲线。所得齐墩果酸测定标准曲线为x＝43.044y-0.6438(R2＝0.9970)，其中y为OD551值，x为齐墩果酸含量(mg/mL)，齐墩果酸含量在0.5-50mg/L线性关系良好。试验结果表明YSYS1含量最高，可达18.25mg/g。