本发明涉及土壤修复领域，具体地，涉及一种二氯喹啉酸污染土壤的原位生物修复制剂和修复方法。
背景技术：
：二氯喹啉酸(3,7-二氯-8-喹啉羧酸)是由BASF公司开发的一种高选择性激素型除草剂，在许多水稻种植国家被广泛用来控制单子叶和双子叶杂草，尤其对于防除稻田稗草具有良好的效果。但由于一些用户对二氯喹啉酸的除草特性缺乏足够的认识，盲目应用和增大剂量，导致其在土壤中大量残留并对下茬作物产生药害。二氯喹啉酸对烟草的致畸药害最为显著，该问题主要发生在我国南方的烟稻轮作地区。例如2009年仅湖南省因除草剂造成的药害面积据就达1万亩以上，最严重的导致平均每户烟农近百亩烟田绝收，造成了严重的经济损失。目前，对二氯喹啉酸的降解研究仍主要集中于实验室阶段。王一茹等研究发现，在254nm的紫外光照射下二氯喹啉酸在稻田水中的半衰期可缩短至8小时。Lucia等研究发现添加二氧化钛等光催化剂可在10小时内使稻田水中的二氯喹啉酸的降解率到达26-54％。受光照条件限制，上述技术未能应用于对土壤的修复，且添加光催化剂等物质存在对农耕用地造成二次化学的隐患。因此，实践中急需一种行之有效的可大规模应用于生产耕地的对二氯喹啉酸污染土壤进行修复的制剂和方法。技术实现要素：为了解决在二氯喹啉酸污染土壤的修复中，现有的降解二氯喹啉酸的方法易受光照条件的限制和容易造成对耕地的二次化学试剂污染的问题，本发明提出了一种用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂和一种二氯喹啉酸污染土壤的原位生物修复方法。本发明的发明人在研究中意外地发现，一些真菌(例如黑曲霉(Aspergillusniger)、多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)、灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae))和细菌(例如脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)具有降解二氯喹啉酸的能力，而且不需要光照条件，同时培养上述真菌和细菌的培养基也不含对土壤造成有害的化学污染的物质，从而避免了光化学降解法中的化学试剂对耕地的二次污染问题。而且，发明人还发现，当将真菌和细菌组合使用、或不同的真菌组合使用、以及不同的细菌组合使用时，比单独使用某一种真菌或细菌相比，能够取得更好的修复效果。此外，发明人还发现，当配合使用微生物生长促进剂和肥料时，能更有利于修复二氯喹啉酸污染土壤，从而完成了本发明。本发明提供了一种用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂，该制剂含有具有二氯喹啉酸降解能力的真菌和/或细菌；其中，所述真菌为保藏编号为CGMCCNo.11113的黑曲霉(Aspergillusniger)、保藏编号为CGMCCNo.11114的多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)和保藏编号为CGMCCNo.11115的灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)中的至少一种；所述细菌为保藏编号为CGMCCNo.10845的脱氮假单胞菌、保藏编号为CGMCCNo.10854的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)和保藏编号为CGMCCNo.10856的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中的至少一种。本发明还提供了一种二氯喹啉酸污染土壤的原位生物修复方法，该方法包括使用用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂对二氯喹啉酸污染土壤进行原位修复。采用本发明提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂对二氯喹啉酸污染的土壤进行原位生物修复时，由于所采用的真菌和/或细菌不需光照条件、不采用污染环境的化学试剂，因而克服了光化学降解法易受光照条件的限制和容易造成对耕地的二次化学试剂污染的问题，同时辅以微生物生长促进剂和肥料，使得可以充分利用真菌和/或细菌分解代谢土壤中残留的二氯喹啉酸，从而解决了土壤中高残留的二氯喹啉酸严重危及食品安全的问题，同时改善了土壤的微生态，使土壤更加快速的恢复耕作能力，而且该方法成本较低，从而具有广阔的应用前景。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物保藏本发明的菌株如下：1、黑曲霉(Aspergillusniger)，于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11113。2、多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)，于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11114。3、灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)，于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11115。4、脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.10845。5、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.10854。6、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.10856。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂，该制剂含有具有二氯喹啉酸降解能力的真菌和/或细菌；其中，所述真菌为：保藏编号为CGMCCNo.11113的黑曲霉(Aspergillusniger)、保藏编号为CGMCCNo.11114的多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)和保藏编号为CGMCCNo.11115的灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)中的至少一种；所述细菌为：保藏编号为CGMCCNo.10845的脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)、保藏编号为CGMCCNo.10854的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)和保藏编号为CGMCCNo.10856的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中的至少一种。根据本发明提供的制剂，所述制剂中可以不含细菌，且真菌的总含量可以为20-90mg干重/mL，优选50-80mg干重/mL。当所述制剂中不含细菌时，所述制剂可以为黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉三者之中的任意一种、任意两种的组合或三种的组合。在一种优选的实施方式中，所述制剂同时含有黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉，且黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉的干重比为1：(0.01-100)：(0.01-100)，优选1：(0.2-5)：(0.2-5)。根据本发明提供的制剂，所述制剂中可以不含真菌，且细菌的总含量可以为1013-1019个/mL，优选1015-1017个/mL。当所述制剂中不含真菌时，所述制剂可以为脱氮假单胞菌、伯克霍尔德氏菌和粘质沙雷氏菌三者之中的任意一种、任意两种的组合或三种的组合。在一种优选的实施方式中，所述制剂同时含有脱氮假单胞菌、伯克霍尔德氏菌和粘质沙雷氏菌，且脱氮假单胞菌、伯克霍尔德氏菌和粘质沙雷氏菌的数量比为1：(10-6-106)：(10-6-106)，优选1：(10-2-102)：(10-2-102)。根据本发明提供的制剂，所述制剂中可以同时含有真菌和细菌，且真菌的总含量可以为10-80mg干重/mL，优选40-50mg干重/mL；细菌的总含量为1010-1018个/mL，优选1014-1015个/mL。当所述制剂中同时含有真菌和细菌时，所述制剂中的真菌可以为黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉三者之中的任意一种、任意两种或三种；所述制剂中的细菌可以为脱氮假单胞菌、伯克霍尔德氏菌和粘质沙雷氏菌三者之中的任意一种、任意两种或三种。在一种优选的实施方式中，所述制剂同时含有上述三种真菌和上述三种细菌，且黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉的干重比为1：(0.01-100)：(0.01-100)，优选1：(0.2-5)：(0.2-5)；脱氮假单胞菌、伯克霍尔德氏菌和粘质沙雷氏菌的数量比为1：(10-6-106)：(10-6-106)，优选1：(10-2-102)：(10-2-102)。所述制剂中还可以含有微生物生长促进剂和/或肥料。所述微生物生长促进剂可以为葡萄糖、淀粉、酵母膏、酵母粉、蛋白胨和氯化钠中的至少一种。所述微生物生长促进剂可以促进原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂中的微生物在土壤中的生长。所述微生物生长促进剂的含量可以为10-80g/mL，优选30-50g/mL。所述肥料可以为有机肥、尿素、磷酸二铵和硫酸钾中的至少一种。所述肥料可以帮助被污染的土壤恢复肥力，并在一定程度上促进所施加微生物的生长。所述肥料的含量可以为1-10g/mL，优选4-6g/mL。根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种二氯喹啉酸污染土壤的原位生物修复方法，该方法包括使用上述用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂对二氯喹啉酸污染土壤进行原位修复。其中，当所述制剂中不含细菌时，真菌的使用量可以为使得二氯喹啉酸污染土壤中真菌的总含量达到4-18g干重/m3，优选10-16g干重/m3。当所述制剂中不含真菌时，细菌的使用量可以为使得二氯喹啉酸污染土壤中细菌的总含量达到1015-1021个/m3，优选1017-1019个/m3。当所述制剂中同时含有真菌和细菌时，真菌的使用量可以为使得二氯喹啉酸污染土壤中真菌的总含量达到2-16g干重/m3，优选8-10g干重/m3，细菌的使用量为使得二氯喹啉酸污染土壤中细菌的总含量达到1012-1020个/m3，优选1016-1017个/m3。当所述制剂中还含有微生物生长促进剂和/或肥料时，所述微生物生长促进剂的使用量可以为使得二氯喹啉酸污染土壤中微生物生长促进剂的含量达到20-160g/m3，优选60-100g/m3。所述肥料的使用量为使得二氯喹啉酸污染土壤中肥料的含量达到2-20g/m3，优选8-12g/m3。根据本发明的二氯喹啉酸污染土壤的原位生物修复方法，所述原位修复的过程可以在土壤水份含量为5重量％-30重量％、温度为15-40℃下操作5-30天，优选7-14天。根据本发明的二氯喹啉酸污染土壤的原位生物修复方法，可以采用灌溉和翻耕操作使得土壤水份含量为5重量％-30重量％。其中翻耕操作的周期可以为1-4周1次。采用翻耕操作可以为土壤中微生物的生长提供充足的氧气。可以采用覆盖多孔地膜的操作保持土壤中的温度为15-40℃，水分含量为5重量％-30重量％，以提供真菌和/或细菌生长所需的温度和湿度，从而为微生物的生长繁殖提供适宜的环境。以下将通过具体的实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，土壤中的二氯喹啉酸含量(单位g/kg土壤)按照以下方法测定：称取20g土壤样品置于250mL具塞锥形瓶中，加入60mL的0.05mol/L氢氧化钠溶液，浸泡2h后振荡提取30min，5000r/min离心5min，取30mL上清液用磷酸调pH<2.5，加入乙酸乙酯激烈振荡萃取2次，每次使用30mL乙酸乙酯，振荡5min，收集合并乙酸乙酯相，过无水硫酸钠去残余水分，在40℃真空旋转蒸发器上浓缩至尽干，用甲醇定容至1mL，过0.45μm有机系滤膜后进液相色谱仪检测分析。液相色谱检测条件：釆用AthanaC18色谱柱，流动相为甲醇：0.2％乙酸水溶液＝60:40(体积比)，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长240nm，进样量20μL。二氯喹啉酸的土壤清除率为：(处理前的土壤中二氯喹啉酸的含量-用本发明提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂处理之后的土壤中的二氯喹啉酸的含量)/处理前的土壤中二氯喹啉酸的含量×100％。以下实施例中，制剂中各成分的含量均以每mL用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂为基准。实施例1本实施例用于说明本发明提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂，以及使用该制剂对二氯喹啉酸污染土壤进行原位修复的方法。本实施例提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂的组成如下：保藏编号为CGMCCNo.11113的黑曲霉(Aspergillusniger)，含量为13mg干重/mL；保藏编号为CGMCCNo.11114的多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)，含量为13mg干重/mL；保藏编号为CGMCCNo.11115的灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)，含量为14mg干重/mL；保藏编号为CGMCCNo.10845的脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)，含量为1015个/mL；保藏编号为CGMCCNo.10854的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)，含量为1015个/mL；保藏编号为CGMCCNo.10856的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，含量为1015个/mL；葡萄糖的含量为10g/mL，淀粉的含量为5g/mL，酵母膏的含量为5g/mL，酵母粉的含量为5g/mL，蛋白胨的含量为10g/mL，氯化钠的含量为10g/mL；有机肥的含量为2g/mL，尿素的含量为1g/mL，磷酸二铵的含量为1g/mL，硫酸钾的含量为1g/mL。将上述制剂均匀施用于二氯喹啉酸含量为0.5mg/kg土壤的被二氯喹啉酸污染的土壤中，使得土壤中黑曲霉(Aspergillusniger)的含量达到2.6g干重/m3，多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)的含量达到2.6g干重/m3，灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)的含量达到2.8g干重/m3，脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)的含量达到1017个/m3，伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)的含量达到1017个/m3，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的含量达到1017个/m3，微生物生长促进剂的含量达到90g/m3，肥料的含量达到10g/m3。在土壤表面覆盖多孔地膜，使得土壤温度保持在25±2℃。每周灌溉和翻耕土壤，使得土壤中水份含量保持在20重量％-30重量％。14天后，测得土壤中二氯喹啉酸含量为0.022mg/kg土壤，二氯喹啉酸的土壤清除率达到95.6％。实施例2-16本实施例用于说明本发明提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂，以及使用该制剂对二氯喹啉酸污染土壤进行原位修复的方法。实施例2-16提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂的组成中，除了表1-1和1-2中的组分的含量外，其余组分(微生物生长促进剂和肥料)的含量均和实施例1相同。将实施例2-16提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂均匀施用于二氯喹啉酸含量为1g/kg土壤的被二氯喹啉酸污染的土壤中，使得土壤中除了真菌和细菌的含量达到表2-1和2-2中所示的含量外，其它组分(微生物生长促进剂和肥料)的含量均和实施例1相同。实施例2-16中，使用实施例2-16提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂对被二氯喹啉酸污染的土壤进行处理的方式均和实施例1相同。14天后，测得的土壤中二氯喹啉酸的含量和二氯喹啉酸的土壤清除率如表3所示。表1-1制剂中真菌和细菌组分的含量实施例12345678黑曲霉1320----35----10多变根毛霉132025--30--75-灰色小克银汉霉14--25----70---解淀粉芽孢杆菌10151014--1016----10101018地衣芽孢杆菌101510141012----10171010-简单芽孢杆菌1015--10121016--1017---表1-2制剂中真菌和细菌组分的含量实施例910111213141516黑曲霉----60----------多变根毛霉45----65--------灰色小克银汉霉--80----75------脱氮假单胞菌----------1015----伯克霍尔德氏菌1011----------1016--粘质沙雷氏菌--1015----------1017表1-1和1-2中，黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉的含量单位为“mg干重/mL”；脱氮假单胞菌、伯克霍尔德氏菌和粘质沙雷氏菌的含量单位为“个/mL”。表2-1土壤中真菌和细菌的含量实施例12345678黑曲霉2.64----7----2多变根毛霉2.645--6--15-灰色小克银汉霉2.8--5----14---脱氮假单胞菌10171016--1018----10121020伯克霍尔德氏菌101710161014----10191012-粘质沙雷氏菌1017--10141018--1019---表2-2土壤中真菌和细菌的含量实施例910111213141516黑曲霉----12----------多变根毛霉9----13--------灰色小克银汉霉--16----15------脱氮假单胞菌----------1017----伯克霍尔德氏菌1013----------1018--粘质沙雷氏菌--1017----------1019表2-1和2-2中，黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉的含量单位为“g干重/m3”；脱氮假单胞菌、伯克霍尔德氏菌和粘质沙雷氏菌的含量单位为“个/m3”。表3处理后土壤中二氯喹啉酸的含量和二氯喹啉酸的土壤清除率由实施例1-16和表3可见，使用本发明提供的用于原位修复二氯喹啉酸污染土壤的制剂对二氯喹啉酸污染的土壤进行原位修复，可以高效率地清除土壤中的二氯喹啉酸，不仅解决了土壤中高残留的二氯喹啉酸严重危及食品安全的问题，改善了土壤的微生态，使土壤更加快速的恢复耕作能力，克服了光化学降解法易受光照条件的限制和容易造成对耕地的二次化学试剂污染的问题。同时，当将真菌和细菌组合使用、或不同的真菌组合使用、以及不同的细菌组合使用时，与单独使用某一种真菌或细菌相比，具有更好的修复效果。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 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