富硒猫棒束孢培养物及其培养方法与流程

本发明涉及猫棒束孢培养物及其培养方法，特别在其中添加了微量元素硒的猫棒束孢培养物及其培养方法。

背景技术：

冬虫夏草是滋补名贵中药材，性味甘，温。功能补肺益肾，化痰止咳。可用之于久咳虚喘，产后虚弱、阳痿阴冷等“虚”的病症。冬虫夏草主要含有冬虫夏草素、虫草酸、腺苷和多糖等成分；冬虫夏草素能抑制链球菌、鼻疽杆菌炭疽杆菌等病菌的生长，又是抗癌的活性物质，对人体的内分泌系统和神经系统有好的调节作用；虫草酸能改变人体冬虫夏草微循环，具有明显的降血脂和镇咳祛痰作用；虫草多糖是免疫调节剂，可增强机体对病毒及寄生虫的抵抗力。

猫棒束孢是从天然冬虫夏草虫草体中分离得到的菌株，培养后可作为冬虫夏草的人工替代品，已被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（保藏号：CGMCC NO.0706），在分类上属于半知菌纲、丛梗孢目、棒束孢属。

硒元素是人体必需的微量元素，它对人体的正常代谢起着重要的调节作用，能清除自由基、抗氧化、强力抑制过氧化脂质的产生、增强免疫功能（２０倍至３０倍）、保护生物细胞膜、增强前列腺调节功能、防止血凝块、清除胆固醇，具有与胰岛素相同的作用，能明显促进细胞摄取糖的能力、血液循环防止皮肤老化、降低致癌物质的诱癌性、消除体内突变的癌细胞、阻止癌细胞的分裂与生长等。缺硒会导致人体免疫力下降，癌症、心血管病、肝病、白内障、胰脏疾病、糖尿病、生殖系统疾病等都与缺硒有关。但硒摄入过量对机体可产生急、慢性毒性作用，同时出现硒（亚硒酸钠）的遗传毒性等多方面的毒副作用，无机硒亚硒酸钠的毒性更大。

技术实现要素：

本发明提供一种富硒猫棒束孢培养物及其培养方法，以至少解决在猫棒束孢中添加有机硒的问题。

为了解决以上技术问题，根据本发明的一个方面，提供了一种富硒猫棒束孢的培养方法，包括步骤：

制备培养基，培养基配方组分包括小米800-900份 ，葡萄糖35-50份 ，亚硒酸钠0.06-0.14份；先将葡萄糖溶于水中加热到沸腾，再加入小米和亚硒酸钠，继续加热煮沸至小米成固态时停止加热，晾至室温，灭菌备用；

接种，猫棒束孢菌丝作为菌种置于20±2℃，相对湿度45-50%的通风环境中培养，待培养完全后取出备用，猫棒束孢选用保藏号是CGMCC NO.0706的菌株；

烤干，将培养完全后的菌丝和培养基一同置于烤干容器内，分两次烤干成菌丝块，第一天95-110℃烤5h；第2d天80-90 ℃烤6h。

进一步地，培养基配方组分包括小米840份，葡萄糖42份 ，亚硒酸钠0.07-0.14份。

进一步地，烤干的菌丝块粉碎成粉末后制成胶囊。

进一步地，本发明所述方法包括步骤：

砂锅中加水并加入葡萄糖，加热到沸腾，加入小米和亚硒酸钠水溶液，搅匀后盖好锅盖，3min后用铲子搅动，继续加热煮沸15-20分钟，并不断地搅拌，待小米成固体姿态时关火，放置到室温；

用铲子将培养基分成小块，分装于瓶中，用牛皮纸块封口，并用棉绳缠紧；

将培养基置于高压锅内，共2层；接种针置于大试管中封口，牛皮纸装入信封中封口，均用棉绳缠好；保持试管口向上，置于放好的培养基缝隙中；121℃、40min高压灭菌，灭菌后放于超净台中，备用。

选取已接种培养10-20天，生长状态良好的猫棒束孢菌丝作为菌种，待培养基完全冷却，紫外消毒30min后接种；

接种结束后，在培养基牛皮纸盖上方重叠一层有孔塑料膜，并用棉绳缠紧，将接种好的培养基置于20±2℃，湿度45-50%的通风环境中培养；

待菌丝长满整个培养基，视为培养完全；

培养完全后，将瓶内菌丝和培养基一同取出搅匀，小堆均匀铺在不锈钢盘上；

将菌丝和培养基置于干燥箱中烤干成菌丝块，第1天95-110℃烤5h；第2天 80-90 ℃烤6h；

取下烤干菌丝块，用粉碎机打成药粉；

装入胶囊，装瓶密封，阴凉处存放。

根据本发明的另一方面，提供一种根据以上方法制备得到的富硒猫棒束孢培养物。

本发明在真菌培养过程中将无机硒加入培养基中，经过微生物的发酵，使无机硒变为更易被机体吸收的有机硒，不但可以提高硒的生理活性和吸收率，而且还可以降低其毒性。人们在服用人工虫草的同时增加了硒元素的补充，使得人工培养虫草增加了硒的补充功能。

附图说明

图1是HPLC-ICP-MS检测结果。

具体实施方式

利用生物方法将无机硒转化为有机硒，不但可以提高硒的生理活性和吸收率，而且还可以降低其毒性。为此，本发明一种富硒猫棒束孢的培养方法和根据所述的培养方法制得的制备富硒猫棒束孢。

在本发明的一种典型的实施方式中，一种富硒猫棒束孢的培养方法，包括步骤制备培养基、接种和烤干，其中，

培养基，培养基配方组分包括小米800-900份 ，葡萄糖35-50份 ，亚硒酸钠0.07-0.14份；先将葡萄糖溶于水中加热到沸腾，再加入小米和亚硒酸钠，继续加热煮沸至小米成固态时停止加热，晾至室温，灭菌备用；

接种，猫棒束孢菌丝作为菌种置于20±2℃，相对湿度45-50%的通风环境中培养，待培养完全后取出备用，猫棒束孢选用保藏号是CGMCC NO.0706的菌株；

烤干，将培养完全后的菌丝和培养基一同置于烤干容器内，分两次烤干成菌丝块，第一天95-110℃烤5h；第2d天80-90 ℃烤6h。

上述方法将亚硒酸钠作为培养基的组分制成培养基，以猫棒束孢作为菌种培养，用生物方法将无机硒亚硒酸钠转化成有机硒。实验表明：硒元素的转化率可以达到20%以上。硒元素的生理活性和吸收率都得到了提高，硒的毒性进一步降低。培养物中有机硒和猫棒束孢不仅保留了各自的活性成分，更为关键的是具有协同增效的效果，进一步增强了机体免疫力。

优选地，培养基配方组分包括小米840份，葡萄糖42份 ，亚硒酸钠0.06-0.14份，可以更有效的实现预期效果。

优选地，烤干的菌丝块粉碎成粉末后制成胶囊，便于服用。服用方法：每天一次，每次0.3-1.0克，饭后服用。

在一种相对具体的实施方式中，包括步骤：

砂锅中加水并加入葡萄糖，加热到沸腾，加入小米和亚硒酸钠水溶液，搅匀后盖好锅盖，3min后用铲子搅动，防止粘锅，继续加热煮沸15-20分钟，并不断地搅拌，防止糊锅，待小米成固体姿态时关火，放置到室温。

用铲子将培养基分成小块，分装于瓶中，装瓶量为3/4。此过程需注意：尽量不要碰到瓶口，如有碰到，必须清理干净。然后用牛皮纸块封口，并用棉绳缠紧。此过程要注意牛皮纸质量，无漏无破。

将培养基置于高压锅内，共2层；接种针置于大试管中封口，牛皮纸装入信封中封口，均用棉绳缠好；保持试管口向上，置于放好的培养基缝隙中；121℃、40min高压灭菌，灭菌后放于超净台中，备用。

选取已接种培养10-20天，该接种培养是在本发明所述的培养基中进行，生长状态良好的猫棒束孢菌丝作为菌种，待培养基完全冷却，紫外消毒30min后接种。

用酒精棉球清洁双手，点燃酒精灯，再拆开培养基瓶口处缠绕的棉绳，酒精灯火焰处打开菌种瓶盖和装有接种针的试管盖。一人将培养基牛皮纸盖半打开，瓶口45°倾斜，一人持接种针取菌种，取出后，立即用转圈的方法多处接种于培养基上，盖好培养基盖。逐个接种。

接种结束后，在培养基牛皮纸盖上方重叠一层有孔塑料膜，并用棉绳缠紧。将接种好的培养基放于大盒内，标明接种日期。置于20±2℃，湿度45-50%的通风环境中培养；

待菌丝长满整个培养基，视为培养完全，此过程需要60-70天。

培养完全后，将瓶内菌丝和培养基一同取出搅匀，小堆均匀铺在不锈钢盘上。

将菌丝和培养基置于干燥箱中烤干成菌丝块，第1天95-110℃烤5h；第2天 80-90 ℃烤6h，意外地发现，采用两次烤干，更有利于发挥猫棒束孢的药物活性以及提高硒的吸收率。

取下烤干菌丝块，用粉碎机打成药粉；

装入胶囊，装瓶密封，阴凉处存放。

在本发明一种典型的实施方式中，还提供采用上述方法制备得到的富硒猫棒束孢培养物。该培养物用于补充人体所需的硒元素，同时具有猫棒束孢的功能，即本领域技术人员所知的冬虫夏草的功能。

以下结合具体实施例进一步说明本发明的制备方法及其在转化无机硒方面的有益效果，实施例中猫棒束孢选用保藏号是CGMCC NO.0706的菌株。

实施例1

（一）培养基

配方：小米840份，葡萄糖42份 ，亚硒酸钠0.10份。亚硒酸钠加水100ml配成水溶液。

砂锅中加水2000ml并加入葡萄糖，加热到沸腾，加入小米和亚硒酸钠水溶液，搅匀后盖好锅盖，3min后用铲子搅动，继续加热煮沸20分钟，并不断地搅拌，待小米成固体姿态时关火，放置到室温。用铲子将培养基分成小块，分装于瓶中，用牛皮纸块封口，并用棉绳缠紧。将培养基置于高压锅内，共2层；接种针置于大试管中封口，牛皮纸装入信封中封口，均用棉绳缠好；保持试管口向上，置于放好的培养基缝隙中；121℃、40min高压灭菌，灭菌后放于超净台中，备用。

（二）接种

选取已接种培养15天，生长状态良好的猫棒束孢菌丝作为菌种，待培养基完全冷却，紫外消毒30min后接种。用酒精棉球清洁双手，点燃酒精灯，再拆开培养基瓶口处缠绕的棉绳，酒精灯火焰处打开菌种瓶盖和装有接种针的试管盖。一人将培养基牛皮纸盖半打开，瓶口45°倾斜，一人持接种针取菌种，取出后，立即用转圈的方法多处接种于培养基上，盖好培养基盖。逐个接种。接种结束后，在培养基牛皮纸盖上方重叠一层有孔塑料膜，并用棉绳缠紧。将接种好的培养基放于大盒内，标明接种日期。置于22℃，湿度50%的通风环境中培养。待菌丝长满整个培养基，视为培养完全，此过程需要70天。

（三）烤干

培养完全后，将瓶内菌丝和培养基一同取出搅匀，小堆均匀铺在不锈钢盘上。将菌丝和培养基置于干燥箱中烤干成菌丝块，第1天100℃烤5h；第2天 85 ℃烤6h。

（四）打粉及制胶囊

取下烤干菌丝块，用粉碎机打成药粉。装入胶囊，装瓶密封，阴凉处存放。

实施例2

（一）培养基

配方：小米800份，葡萄糖35份 ，亚硒酸钠0.07份。亚硒酸钠加水100ml配成水溶液。

先将葡萄糖溶于2000ml水中加热到沸腾，再加入小米和亚硒酸钠，继续加热煮沸至小米成固态时停止加热，晾至室温，灭菌备用。

（二）接种

猫棒束孢菌丝作为菌种置于22℃，相对湿度45%的通风环境中培养，待培养完全后取出备用。

（三）烤干

将培养完全后的菌丝和培养基一同置于烤干容器内，分两次烤干成菌丝块，第一天110℃烤5h；第2d天80℃烤6h。

实施例3

（一）培养基

配方：小米900份，葡萄糖50份 ，亚硒酸钠0.14份。亚硒酸钠加水100ml配成水溶液。

先将葡萄糖溶于2000ml水中加热到沸腾，再加入小米和亚硒酸钠，继续加热煮沸至小米成固态时停止加热，晾至室温，灭菌备用。

（二）接种

猫棒束孢菌丝作为菌种置于18℃，相对湿度50%的通风环境中培养，待培养完全后取出备用。

（三）烤干

将培养完全后的菌丝和培养基一同置于烤干容器内，分两次烤干成菌丝块，第一天95℃烤5h；第2d天90 ℃烤6h。

实施例4

（一）培养基

配方：小米840份，葡萄糖42份 ，亚硒酸钠0.10份。亚硒酸钠加水100ml配成水溶液。

砂锅中加水2000ml并加入葡萄糖，加热到沸腾，加入小米和亚硒酸钠水溶液，搅匀后盖好锅盖，3min后用铲子搅动，继续加热煮沸15分钟，并不断地搅拌，待小米成固体姿态时关火，放置到室温。用铲子将培养基分成小块，分装于瓶中，用牛皮纸块封口，并用棉绳缠紧。将培养基置于高压锅内，共2层；接种针置于大试管中封口，牛皮纸装入信封中封口，均用棉绳缠好；保持试管口向上，置于放好的培养基缝隙中；121℃、40min高压灭菌，灭菌后放于超净台中，备用。

（二）接种

选取已接种培养20天，生长状态良好的猫棒束孢菌丝作为菌种，待培养基完全冷却，紫外消毒30min后接种。用酒精棉球清洁双手，点燃酒精灯，再拆开培养基瓶口处缠绕的棉绳，酒精灯火焰处打开菌种瓶盖和装有接种针的试管盖。一人将培养基牛皮纸盖半打开，瓶口45°倾斜，一人持接种针取菌种，取出后，立即用转圈的方法多处接种于培养基上，盖好培养基盖。逐个接种。接种结束后，在培养基牛皮纸盖上方重叠一层有孔塑料膜，并用棉绳缠紧。将接种好的培养基放于大盒内，标明接种日期。置于20℃，湿度45%的通风环境中培养。待菌丝长满整个培养基，视为培养完全，此过程需要60天。

（三）烤干

培养完全后，将瓶内菌丝和培养基一同取出搅匀，小堆均匀铺在不锈钢盘上。将菌丝和培养基置于干燥箱中烤干成菌丝块，第1天95℃烤5h；第2天 80 ℃烤6h。

（四）打粉及制胶囊

取下烤干菌丝块，用粉碎机打成药粉。装入胶囊，装瓶密封，阴凉处存放。

实施例5

（一）培养基

配方：小米870份，葡萄糖40份 ，亚硒酸钠0.12份。亚硒酸钠加水100ml配成水溶液。

砂锅中加水2000ml并加入葡萄糖，加热到沸腾，加入小米和亚硒酸钠水溶液，搅匀后盖好锅盖，3min后用铲子搅动，继续加热煮沸18分钟，并不断地搅拌，待小米成固体姿态时关火，放置到室温。用铲子将培养基分成小块，分装于瓶中，用牛皮纸块封口，并用棉绳缠紧。将培养基置于高压锅内，共2层；接种针置于大试管中封口，牛皮纸装入信封中封口，均用棉绳缠好；保持试管口向上，置于放好的培养基缝隙中；121℃、40min高压灭菌，灭菌后放于超净台中，备用。

（二）接种

选取已接种培养10天，生长状态良好的猫棒束孢菌丝作为菌种，待培养基完全冷却，紫外消毒30min后接种。用酒精棉球清洁双手，点燃酒精灯，再拆开培养基瓶口处缠绕的棉绳，酒精灯火焰处打开菌种瓶盖和装有接种针的试管盖。一人将培养基牛皮纸盖半打开，瓶口45°倾斜，一人持接种针取菌种，取出后，立即用转圈的方法多处接种于培养基上，盖好培养基盖。逐个接种。接种结束后，在培养基牛皮纸盖上方重叠一层有孔塑料膜，并用棉绳缠紧。将接种好的培养基放于大盒内，标明接种日期。置于20℃，湿度50%的通风环境中培养。待菌丝长满整个培养基，视为培养完全，此过程需要60天。

（三）烤干

培养完全后，将瓶内菌丝和培养基一同取出搅匀，小堆均匀铺在不锈钢盘上。将菌丝和培养基置于干燥箱中烤干成菌丝块，第1天110℃烤5h；第2天 90 ℃烤6h。

（四）打粉及制胶囊

取下烤干菌丝块，用粉碎机打成药粉。装入胶囊，装瓶密封，阴凉处存放。

以下是有机硒检测的方法结果。

目的：比较各样品间有机硒含量的不同

实验材料：待测样品1（实施例1富硒猫棒束孢菌丝胶囊）、待测样品2（非富硒虫草）、离心管、脂肪酶、蛋白酶、冰块、0.45um有机滤膜等

仪器设备：

往复式水浴恒温振荡器：SHZ-88A型，太仓实验设备厂，中国。

离心机：CF15RXⅡ型，日立公司，日本。

高效液相色谱仪：1200型，安捷伦公司，美国。

电感耦合等离子体质谱仪：X 2 series，赛默飞世尔公司，美国。

实验方法：称取样品 + 酶 → 溶解→ 恒温水浴振荡→ 冰水迅速冷却→离心→ 取上清液过膜→ HPLC-ICP-MS检测

实验结果图1和表1。

转化率为：（21.72+23.3+3.76）/228=21.39%。计算方法：按每840克小米中加亚硒酸钠140mg计算，可产出药粉为280克，即每克产品中亚硒酸钠的含量为140÷280=0.5mg，亚硒酸钠中硒的含量为45.6%，按此计算无机硒的含量为0.5×0.456=0.228mg，所测样品中有机硒的总含量为21.72+23.30+3.76=48.78，则有机硒的含量为：48.78÷228=21.39%。