制备乳酸链球菌素的方法与流程

本发明涉及制备乳酸链球菌素的方法。

背景技术：

乳酸链球菌素(Nisin)亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成。由于乳酸链球菌素可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。食用后在人体的生理pH条件和α—胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。

目前Nisin产品的生产是通过乳酸菌进行发酵得到的，然而由于成熟的Nisin能够破坏细菌的细胞膜，导致细胞破裂，从而导致目前利用微生物全合成Nisin的工艺产量偏低。并且，虽然在Nisin生产菌种体内存在其免疫机制，即NisEFG和NisI蛋白能够保护细菌本身，但是这种免疫机制是有限的，无法改变微生物全合成Nisin工艺产量偏低的现状。

因而，目前的乳酸链球菌素制备工艺仍有待改进。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种适合大规模培养，能够打破原有的细胞压力，得到产品产量和纯度高的Nisin生产方式。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前的微生物全合成Nisin工艺，微生物体内的合成途径如下：由nisA/Z基因(或别的基因，如nisQ、nisF、nisU等)编码前体肽(Nisin precursor)，该前体肽再由nisB和nisC基因编码的NisB和NisC蛋白对前体肽进行修饰，其中NisB作用为对特定的丝氨酸和苏氨酸进行脱水，而NisC作用为形成羊毛硫环，再由nisP基因产物NisP蛋白对修饰后的蛋白进行切割，最后形成成熟的NisinA/NisinZ产物。

发明人发现，在微生物体内大量表达半成熟的Nisin前体肽，然后将这些未成熟的前体肽在体外利用nisP蛋白或者其他能识别nisP切割位点的蛋白进行酶解，即可得到大量有活性的成熟Nisin，并且在微生物体内所得到的蛋白(即半成熟的Nisin前体肽)没有生物活性，不会引起细胞的破裂，可以突破通过微生物全合成Nisin的瓶颈。这种生产方式更适合于大规模培养，能够打破原有的细胞压力，得到的产品不仅产量高、纯度也更纯，是一种全新的 Nisin生产方式。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备乳酸链球菌素的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用微生物表达获得乳酸链球菌素前体肽；利用NisB蛋白和NisC蛋白将所述乳酸链球菌素前体肽进行修饰，以便获得经过修饰的乳酸链球菌素前体肽；以及利用能够识别NisP切割位点的蛋白对所述经过修饰的乳酸链球菌素前体肽进行体外酶解，以便获得乳酸链球菌素，其中，所述NisB蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述NisC蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

发明人惊奇地发现，利用本发明的制备乳酸链球菌素的方法，在微生物体内大量表达半成熟的Nisin前体肽，然后利用能够识别NisP切割位点的蛋白对半成熟的Nisin前体肽进行体外酶解，即可得到大量有活性的成熟Nisin，并且在微生物体内所得到的蛋白(即半成熟的Nisin前体肽)没有生物活性，不会引起细胞的破裂，可以突破通过微生物全合成Nisin的瓶颈。并且，根据本发明的实施例，本发明的方法能够打破现有微生物全合成Nisin工艺的细胞压力，得到的产品不仅产量高、纯度也更纯，是一种全新的Nisin生产方式，并且适于工业化大规模生产。

其中，NisB蛋白的序列如下所示：

MIKSSFKAQPFLVRNTILSPNDKRSFTEYTQVIETVSKNKVFLEQLLLANPKLYDVMQKYNAGLLKKKRVKKLFESIYKYYKRSYLRSTPFGLFSETSIGVFSKSSQYKLMGKTTKGIRLDTQWLIRLVHKMEVDFSKKLSFTRNNANYKFGDRVFQVYTINSSELEEVNIKYTNVYQIISEFCENDYQKYEDICETVTLCYGDEYRELSEQYLGSLIVNHYLISNLQKDLLSDFSWNTFLTKVEAIDEDKKYIIPLKKVQKFIQEYSEIEIGEGIEKLKEIYQEMSQILENDNYIQIDLISDSEINFDVKQKQQLEHLAEFIGNTTKSVRRTYLDDYKDKFIEKYGVDQEVQITELFDSTFGIGAPYNYNHPRNDFYESEPSTLYYSEEEREKYLSMYVEAVKNHNVINLDDLESHYQKMDLEKKSELQGLELFLNLAKEYEKDIFILGDIVGNNNLGGASGRFSALSPELTSYHRTIVDSVERENENKEITSCEIVFLPENIRHANVMHTSIMRRKVLPFFTSTSHNEVLLTNIYIGIDEKEKFYARDISTQEVLKFYITSMYNKTLFSNELRFLYEISLDDKFGNLPWELIYRDFDYIPRLVFDEIVISPAKWKIWGRDVNSKITIRELIQSKEIPKEFYIVNGDNKVYLSQENPLDMEILESAIKKSSKRKDFIELQEYFEDENIINKGQKGRVADVVVPFIRTRALGNEGRAFIREKRVSVERREKLPFNEWLYLKLYISINRQNEFLLSYLPDIQKIVANLGGNLFFLRYTDPKPHIRLRIKCSDLFLAYGSILEILKRSRKNRIMSTFDISIYDQEVERYGGFDTLELSEAIFCADSKIIPNLLTLIKDTNNDWKVDDVSILVNYLYLKCFFQNDNKKILNFLNLVSPKKVKENVNEKIEHYLKLLKVNNLGDQIFYDKNFKELKHAIKNLFLKMIAQDFELQKVYSIIDSIIHVHNNRLIGIERDKEKLIYYTLQRLFVSEEYMK(SEQ ID NO：1)，

NisC蛋白的序列如下所示：

MNKKNIKRNVEKIIAQWDERTRKNKENFDFGELTLSTGLPGIILMLAELKNKDNSKIYQKKIDNYIEYIVSKLSTYGLLTGSLYSGAAGIALSILHLREDDEKYKNLLDSLNRYIEYFVREKIEGFNLENITPPDYDVIEGLSGILSYLLLINDEQYDDLKILIINFLSNLTKENKGLISLYIKS ENQMSQSESEMYPLGCLNMGLAHGLAGVGCILAYAHIKGYSNEASLSALQKIIFIYEKFELERKKQFLWKDGLVADELKKEKVIREASFIRDAWCYGGPGISLLYLYGGLALDNDYFVDKAEKILESAMQRKLGIDSYMICHGYSGLIEICSLFKRLLNTKKFDSYMEEFNVNSEQILEEYGDESGTGFLEGISGCILVLSKFEYSINFTYWRQALLLFDDFLKGGKRK(SEQ ID NO：2)。

另外，根据本发明上述实施例的制备乳酸链球菌素的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述乳酸链球菌素前体肽为选自NisA蛋白、NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白的至少之一，其中，所述NisA蛋白具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述NisZ蛋白具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述NisQ蛋白具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述NisF蛋白具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述NisU蛋白具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述NisU2蛋白具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。由此，使微生物表达NisA蛋白、NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白的至少之一，均能够有效获得乳酸链球菌素前体肽。

具体地，NisA蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCNCSIHVSK(SEQ ID NO：3)，

NisZ蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCNCSIHVSK(SEQ ID NO：4)，

NisQ蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKTDSGASTRITSISLCTPGCKTGVLMGCNLKTATCNCSVHVSK(SEQ ID NO：5)，

NisF蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCNCSVHVSK(SEQ ID NO：6)，

NisU蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSKSLCTPGCKTGILTGCPLKTATCGCHFG(SEQ ID NO：7)，

NisU2蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRVTSKSLCTPGCKTGILTGCPLKTATCGCHFG(SEQ ID NO：8)。

根据本发明的实施例，所述NisA蛋白由SEQ ID NO：12所示的核酸序列编码，所述NisZ蛋白由SEQ ID NO：13所示的核酸序列编码，所述NisQ蛋白由SEQ ID NO：14所示的核酸序列编码，所述NisF蛋白由SEQ ID NO：15所示的核酸序列编码，所述NisU蛋白由SEQ ID NO：16所示的核酸序列编码，所述NisU2蛋白由SEQ ID NO：17所示的核酸序列编码。由此，蛋白表达效率高，从而能够高效地获得各种乳酸链球菌素前体肽。

具体地，NisA蛋白的编码基因为nisA基因，其序列如下所示：

atgagtacaaaagattttaacttggatttggtatctgtttcgaagaaagattcaggtgcatcaccacgcattacaagtatttcgctatgtacacccggttgtaaaacaggagctctgatgggttgtaacatgaaaacagcaacttgtaattgtagtattcacgtaagcaaataa(SEQ ID NO：12)，

NisZ蛋白的编码基因为nisZ基因，其序列如下所示：

ATGAGTACAAAAGATTTTAACTTGGATTTGGTATCTGTTTCGAAGAAAGATTCAGGTGCATCACCACGCATTACAAGTATTTCGCTATGTACACCCGGTTGTAAAACAGGAGCTCTGATGGGTTGTAACATGAAAACAGCAACTTGTAATTGTAGTATTCACGTAAGCAAATAA(SEQ ID NO：13)，

NisQ蛋白的编码基因为nisQ基因，其序列如下所示：

ATGAGCACCAAGGACTTCAACCTGGATCTGGTGAGCGTTAGCAAAACCGACAGCGGCGCGAGCACCCGTATCACCAGCATTAGCCTGTGCACCCCGGGTTGCAAGACCGGCGTGCTGATGGGTTGCAACCTGAAAACCGCGACCTGCAACTGCAGCGTGCACGTTAGCAAGTAA(SEQ ID NO：14)，

NisF蛋白的编码基因为nisF基因，其序列如下所示：

ATGAGCACCAAGGACTTCAACCTGGATCTGGTGAGCGTTAGCAAGAAAGACAGCGGTGCGAGCCCGCGTATCACCAGCATTAGCCTGTGCACCCCGGGTTGCAAGACCGGCGCGCTGATGGGTTGCAACATGAAAACCGCGACCTGCAACTGCAGCGTGCACGTTAGCAAATAA(SEQ ID NO：15)，

NisU蛋白的编码基因为nisU基因，其序列如下所示：

ATGAGCACCAAGGACTTCAACCTGGATCTGGTGAGCGTTAGCAAGAAAGACAGCGGTGCGAGCCCGCGTATCACCAGCAAGAGCCTGTGCACCCCGGGTTGCAAAACCGGCATTCTGACCGGTTGCCCGCTGAAAACCGCGACCTGCGGTTGCCACTTTGGTTAA(SEQ ID NO：16)，

NisU2蛋白的编码基因为nisU2基因，其序列如下所示：

ATGAGCACCAAGGACTTCAACCTGGATCTGGTGAGCGTTAGCAAGAAAGACAGCGGTGCGAGCCCGCGTGTGACCAGCAAGAGCCTGTGCACCCCGGGTTGCAAAACCGGCATCCTGACCGGTTGCCCGCTGAAAACCGCGACCTGCGGTTGCCACTTTGGTTAA(SEQID NO：17)。

根据本发明的实施例，所述NisB蛋白由SEQ ID NO：10所示的核酸序列编码。也即，NisB蛋白的编码基因为nisB基因其序列如下所示：

atgataaaaagttcatttaaagctcaaccgtttttagtaagaaatacaattttatctccaaacgataaacggagttttactgaatatactcaagtcattgagactgtaagtaaaaataaagtttttttggaacagttactactagctaatcctaaactctatgatgttatgcagaaatataatgctggtctgttaaagaagaaaagggttaaaaaattatttgaatctatttacaagtattataagagaagttatttacgatcaactccatttggattatttagtgaaacttcaattggtgttttttcgaaaagttcacagtacaagttaatgggaaagactacaaagggtataagattggatactcagtggttgattcgcctagttcataaaatggaagtagatttctcaaaaaagttatcatttactagaaataatgcaaattataagtttggagatcgagtttttcaagtttataccataaatagtagt gagcttgaagaagtaaatattaaatatacgaatgtttatcaaattatttctgaattttgtgagaatgactatcaaaaatatgaagatatttgtgaaactgtaacgctttgctatggagacgaatatagagaactatcggaacaatatcttggcagtctgatagttaatcattatttgatctctaatttacaaaaagatttgttgtcagatttttcttggaacacttttttgactaaagttgaagcaatagatgaagataaaaaatatataattcctctgaaaaaagttcaaaagtttattcaagaatactcagaaatagaaattggtgaaggtattgagaaactgaaagaaatatatcaggaaatgtcacaaattcttgagaatgataattatattcaaattgatttaattagtgatagtgaaataaattttgatgttaaacaaaagcaacaattagaacatttagctgagtttataggaaatacgacaaaatctgtaagaagaacatatttggatgactataaggataaatttatcgaaaaatatggtgtagatcaagaagtacaaataacagaattatttgattctacatttggcataggagctccatataattataatcatcctcgaaatgacttttatgagtccgaaccgagtactctatactattcagaagaggagagagaaaagtacctcagcatgtatgtagaagccgttaaaaatcataatgtaattaatcttgacgacttagagtctcattatcaaaaaatggacttagaaaagaaaagtgaacttcaagggttagaattatttttgaatttggcaaaggagtatgaaaaagatatttttattttaggggatatcgttggaaataataatttgggaggggcatcaggtagattttctgcactctctccggagttaacaagttatcatagaacgatagtagattctgtcgaaagagaaaatgagaataaagaaattacatcgtgtgaaatagtatttcttccagaaaatatcagacatgctaacgttatgcatacatcaattatgaggaggaaagtacttccattttttacaagtacaagtcacaatgaagttctgttaactaatatctatattggaatagacgaaaaagaaaaattttatgcacgagacatttcaactcaagaggtattgaaattctacattacaagcatgtacaataaaacgttattcagtaatgagctaagatttctttacgaaatttcattagatgacaagtttggtaatttaccttgggaacttatttacagagactttgattatattccacgtttagtatttgacgaaatagtaatatctcctgctaaatggaaaatttggggaagggatgtaaatagtaagattacaataagagaacttattcaaagcaaagaaattcccaaagagttttatattgtcaatggagataataaagtttatttatcacaggaaaacccattggatatggaaattttagagtcggcgataaagaagagctcaaaaagaaaagattttatagagctacaagaatattttgaagatgaaaatatcataaataaaggacaaaaggggagagttgccgatgttgtagtgccttttattagaacgagagcattaggtaatgaagggagagcatttataagagagaaaagagtttcggttgaacggcgtgaaaaattgccctttaacgagtggctttatctcaagttgtacatttctataaatcgtcaaaatgaatttttactgtcgtatcttccagatattcagaaaatagtagcaaacctgggtggaaatctattcttcctaagatatactgatcctaaaccacatattagattgcgtataaaatgttcagatttatttttagcttacggatctattcttgaaatcttaaaaaggagtcggaaaaataggataatgtcaacttttgatatttctatttatgatcaagaagtagaaagatatggtggatttgatactttagagttatccgaagcaatattttgtgccgattctaaaattattccaaatttgcttacattgataaaagatactaataatgattggaaagtcgatgatgtatcaatcttggtgaattatttatatctgaaatgcttctttcagaatgataacaaaaagattcttaattttttgaatttagttagtcctaaaaaggttaaagaaaatgtcaatgaaaagattgaacattatcttaagcttctgaaagttaataatctaggtgaccaaattttttatgacaagaattttaaagaattaaagcatgccataaaaaatttatttttaaaaatgatagctcaagattttgaacttcagaaagtttattcaattattgacagtatcattcatgtccataataaccgactaattggtattgaacgagataaagagaaattaatttattacacacttcaaaggttgtttgtttcggaagaatacatgaaatga(SEQ ID NO：10)。

由此，能够高效地表达NisB蛋白，并且利用该NisB蛋白能够有效将所述乳酸链球菌素前体肽的特定丝氨酸和苏氨酸进行脱水，完成第一步修饰。

根据本发明的实施例，所述NisC蛋白由SEQ ID NO：11所示的核酸序列编码。也即，NisC蛋白的编码基因为nisC基因，其序列如下所示：

atgaataaaaaaaatataaaaagaaatgttgaaaaaattattgctcaatgggatgagagaactagaaaaaataaagaaaacttcgatttcggagagttgactctctctacaggattgcctggtataattttaatgttagcggagttaaaaaataaagataactcaaagatatatcagaaaaagatagacaattatattgaatatattgttagcaaactttcaacatatgggcttttaacaggatcactttattcgggagcagctggcattgcattaagtatcctacatttacgagaagatgacgaaaaatataagaatcttcttgatagcctaaatagatatatcgaatatttcgtcagagaaaaaattgaaggatttaatttggaaaacattactcctcctgattatgacgtgattgaaggtttatctgggatactttcctatctattattaatcaacgacgagcaatatgatgatttgaaaatactcattatcaattttttatcaaatctgactaaagaaaacaaaggactaatatcgctttacatcaaatcggagaatcagatgtctcaatcagaaa gtgagatgtatccactaggctgtttgaatatgggattagcacatggacttgctggagtgggctgtatcttagcttatgcccacataaaaggatatagtaatgaagcctcgttgtcagctttgcaaaaaattatttttatttatgaaaagtttgaacttgaaaggaaaaaacagtttctatggaaagatggacttgtagcagatgaattaaaaaaagagaaagtaattagggaagcaagtttcattagagatgcatggtgctatggaggtccaggtattagtctgctatacttatacggaggattagcactggataatgactattttgtagataaagcagaaaaaatattagagtcagctatgcaaaggaaacttggtattgattcatatatgatttgccatggctattctggtttaatagaaatttgttctttatttaagcggctattaaatacaaaaaagtttgattcatacatggaagaatttaatgttaatagtgagcaaattcttgaagaatacggagatgaaagtggcacgggttttcttgaaggaataagtggctgtatactggtattatcgaaatttgaatattcaatcaattttacttattggagacaagcactgttactttttgacgattttttgaaaggagggaagaggaaatga(SEQ ID NO：11)。

由此，能够高效地获得NisC蛋白，且利用该NisC蛋白能够有效使经过NisB修饰的乳酸链球菌素前体肽形成羊毛硫环，完成第二步修饰。

根据本发明的实施例，利用NisB蛋白和NisC蛋白将所述乳酸链球菌素前体肽进行修饰，是通过选自下列方式的至少一种实现的：

(1)使所述微生物同时表达所述乳酸链球菌素前体肽、NisB蛋白和NisC蛋白，以便在所述微生物体内完成对所述乳酸链球菌素前体肽的修饰，获得经过修饰的乳酸链球菌素前体肽；

(2)使所述微生物同时表达所述乳酸链球菌素前体肽以及NisB蛋白和NisC蛋白中的其中一种，然后将NisB蛋白和NisC蛋白中的另一种与表达产物进行体外混合，以便获得经过修饰的乳酸链球菌素前体肽；

(3)将所述NisB蛋白、所述NisC蛋白与所述乳酸链球菌素前体肽进行体外混合，以便获得经过修饰的乳酸链球菌素前体肽。

由此，通过上述多种方式均能够实现对所述乳酸链球菌素前体肽的修饰。

根据本发明的实施例，所述体外酶解是通过将能够识别NisP切割位点的蛋白与所述经过修饰的乳酸链球菌素前体肽进行体外混合实现的。由此，不会损伤微生物细胞，且方便快捷，还能有效降低生产成本。

根据本发明的实施例，所述能够识别NisP切割位点的蛋白为NisP蛋白，所述NisP蛋白具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。具体地，NisP蛋白的序列如下所示：

VKKILGFLFIVCSLGLSATVHGETTNSQQLLSNNINTELINHNSNAILSSTEGSTTDSINLGAQSPAVKSTTRTELDVTGAAKTLLQTSAVQKEMKVSLQETQVSSEFSKRDSVTNKEAVPVSKDELLEQSEVVVSTSSIQKNKILDNKKNRANFVTSSQLIKEKPSNSKDASGVIDNSASPLSYRKAKEVVSLRQPLKNQKVEAQPLLISNSSEKKASVYTNSHDFWDYQWDMKYVTNNGESYALYQPSKKISVGIIDSGIMEEHPDLSNSLGNYFKNLVPKGGFDNEEPDETGNPSDIVDKMGHGTEVAGQITANGNILGVAPGITVNIYRVFGENLSKSEWVARAIRRAADDGNKVINISAGQYLMISGSYDDGTNDYQEYLNYKSAINYATAKGSIVVAALGNDSLNIQDNQTMINFLKRFRSIKVPGKVVDAPSVFEDVIAVGGIDGYGNISDFSNIGADAIYAPAGTTANFKKYGQDKFVSQGYYLKDWLFTTTNTGWYQYVYGNSFATPKVSGALALVVDKYGIKNPNQLKRFLLMNSPEVNGNRVLNIVDLLNGKNKAFSLDTDKGQDDAINHKSMENLKESRDTMKQEQDKEIQRNTNNNFSIKNDFHNISKEVISVDYNINQKMANNRNSRGTVSVRSQEILPVTGDGEDFLRAL GIVCISILGILKRKTKN(SEQ ID NO：9)。由此，能够高效地实现对经过修饰的乳酸链球菌素前体肽的体外酶解，有效获得乳酸链球菌素。

根据本发明的实施例，所述NisP蛋白由SEQ ID NO：18所示的核酸序列编码。具体地，NisP蛋白的编码基因为NisP基因，其序列如下所示：

gtgaaaaaaatactaggtttcctttttatcgtttgttcgttgggtttatcagcaactgtgcatggggagacaacaaattcacaacagttactctcaaataatattaatacggaattaattaatcataattctaatgcaattttatcttcaacagagggatcaacgactgattcgattaatctaggggcgcagtcacctgcagtaaaatcgacaacaaggactgaattggatgtaactggtgctgctaaaactttattacagacatcagctgttcaaaaagaaatgaaagtttcgttgcaagaaactcaagttagttctgaattcagtaagagagatagcgttacaaataaagaagcagttccagtatctaaggatgagctacttgagcaaagtgaagtagtcgtttcaacatcatcgattcaaaaaaataaaatcctcgataataagaagaatagagctaacttcgttacttcctctcagcttattaaggaaaaaccatcaaattctaaagatgcatctggtgtaattgataattctgcttctcctctatcttatcgtaaagctaaggaagtggtatctcttagacaacctttaaaaaatcaaaaagtagaggcacaacctctattgataagtaattcttctgaaaagaaagcaagtgtttatacaaattcacatgatttttgggattatcagtgggatatgaaatatgtgacaaataatggagaaagctatgcgctctaccagccctcaaagaaaatttctgttggaattattgattcaggaatcatggaagaacatcctgatttgtcaaatagtttaggaaattattttaaaaatcttgttcctaagggagggtttgataatgaagaacctgatgaaactggaaatccaagtgatattgtcgacaaaatgggacacgggacggaagtcgcaggtcagattacagcaaatggtaatattttaggagtagcaccagggattactgtaaatatatacagagtatttggtgaaaatctttcgaaatcggaatgggtagctagagcaataagaagagctgcggatgatgggaacaaggtcatcaatataagtgctggacagtatcttatgatttcaggatcgtatgatgatggaacaaatgattatcaagagtatcttaattataagtcagcaataaattatgcaacagcaaaaggaagtattgttgtcgcagctcttggtaatgatagtttaaacatacaagataaccaaacaatgataaactttcttaagcgtttcagaagtataaaggttcctggaaaagttgtagatgcaccgagtgtatttgaggatgtaatagccgtaggtggaatagatggttatggtaatatttctgattttagtaatattggagcggatgcaatttatgctcctgctggcacaacggccaattttaaaaaatatgggcaagataaatttgtcagtcagggttattatttgaaagattggctttttacaactactaatactggctggtaccaatatgtttatggcaactcatttgctactcctaaagtatctggggcactggcattagtagttgataaatatggaataaagaatcctaaccaactaaaaaggtttcttctaatgaattctccagaagttaatgggaatagagtattgaatattgttgatttattgaatgggaaaaataaagcttttagcttagatacagataaaggtcaggatgatgctattaaccataaatcaatggagaatcttaaagagtctagggatacaatgaaacaggaacaagataaagaaattcaaagaaatacaaataacaatttttctatcaaaaatgattttcataacatttcaaaagaagtaatttcagttgattataatattaatcaaaaaatggctaataatcgaaattcgagaggtactgtttctgtacgaagtcaagaaattttacctgttactggagatggagaagattttttacgggctttaggtatagtgtgtatctcaatccttggtatattgaaaagaaagactaaaaattga(SEQ ID NO：18)。

根据本发明的实施例，所述能够识别NisP切割位点的蛋白为胰蛋白酶，优选Trypsin。由此，能够高效地实现对经过修饰的乳酸链球菌素前体肽的体外酶解，有效获得乳酸链球菌素，且胰蛋白酶获得容易，便于本发明方法的产业化和规模化推广。

根据本发明的实施例，所述微生物不具备天然的乳酸链球菌素合成途径。这是因为，具备天然的乳酸链球菌素合成途径的微生物，其天然合成的乳酸链球菌素也会破坏自身细胞破裂，影响本发明的方法的实施。根据本发明的一些优选实施例，所述微生物为选自大肠杆菌、木霉、酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉菌的至少一种。

根据本发明的实施例，利用选自大肠杆菌、木霉、酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉菌的至少一种表达获得所述NisB蛋白。由此，能够高效地生产NisB蛋白。

根据本发明的实施例，利用选自大肠杆菌、木霉、酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌和米曲 霉菌的至少一种表达获得所述NisC蛋白。由此，能够高效地生产NisC蛋白。

根据本发明的实施例，利用选自大肠杆菌、木霉、酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉菌的至少一种表达获得所述NisP蛋白。由此，NisP蛋白产量高，质量好，能够有效用于上述体外酶解。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL300的结构示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL301的结构示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL302的结构示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL303的结构示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL304的结构示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的pRL305质粒的结构示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例的pRL306质粒的结构示意图；

图8显示了根据本发明一个实施例的pRL307质粒的结构示意图；

图9显示了根据本发明一个实施例的pRL308质粒的结构示意图；

图10显示了根据本发明一个实施例的pRL309质粒的结构示意图；

图11显示了根据本发明一个实施例的pRL310质粒的结构示意图；

图12显示了根据本发明一个实施例的pRL311质粒的结构示意图；

图13显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL312的结构示意图

图14显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL313的结构示意图；

图15显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL314的结构示意图；

图16显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL315的结构示意图；

图17显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL316的结构示意图；以及

图18显示了根据本发明一个实施例的质粒pRL316的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1制备乳酸链球菌素

一、合成半成熟的Nisin前体肽

按照以下步骤，分别在酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉和木霉中合成半成熟的Nisin前体肽：

1、在酿酒酵母中合成半成熟的Nisin前体肽

在nisA、nisB和nisC基因前端分别添加GAL7、GAL10和GAL1启动子，并在这三个基因后面分别添加终止子，再将这三个表达框克隆在去除原始启动子的酿酒酵母表达载体pYes2上，形成质粒pRL300，质粒图如图1。将这个质粒转化进入酿酒酵母INVSC1中，得到酿酒酵母表达菌RL300。

从选择平板上挑取RL300单克隆至5mL SC-U选择培养基中(含有2％葡萄糖),30℃摇瓶过夜后，将其转入50mL SC-U选择培养基中(含有2％葡萄糖)，30℃摇瓶培养6小时后，培养测量过夜培养物的OD值。计算满足300mL诱导培养基OD为0.4所需的菌液量。计算方法如下：过夜培养的菌液OD为a。300mL选择培养基所需要的菌液量为(120/a)mL。取上述步骤所需量的菌液，4℃、1500rpm离心5分钟，收集菌体。用1-2mL诱导培养基(SC-U，含2％棉籽糖)重悬菌体，加入300mL诱导培养基(SC-U，含2％棉籽糖)中，30℃摇瓶培养1-2小时，加入1％的半乳糖进行诱导，在诱导后24小时后收集菌体，再将菌体破碎后得到未成熟的Nisin蛋白。

2、在链霉菌中合成半成熟的Nisin前体肽

将nisA与nisB之间通过引物设计添加RBS序列，将两端序列通过PCR扩增在一起，同时再在后面添加RBS序列和nisC序列，将这一整段序列克隆在载体pIB139上，构成链霉菌表达载体pRL301，质粒图如图2。将这个质粒通过结合转移进入链霉菌FR008宿主细胞中，形成链霉菌表达菌RL301.

从选择平板上挑取经验证成功的RL301至5mL TSBY培养基中,28℃摇瓶过夜后，将其转入50mL TSBY培养基中，28℃继续摇瓶培养待菌长浓后再按照2％的转接量转入300mL的TSBY培养基中培养36小时，收集菌体，再将菌体破碎后得到未成熟的Nisin蛋白。

3、在枯草芽孢杆菌中合成半成熟的Nisin前体肽

从pRL301中扩增nisA、nisB、nisC共表达的基因片段，将其克隆在枯草芽孢杆菌表达载体pHT43上，构成枯草芽孢杆菌表达载体pRL302，质粒图如图3。将这个质粒转化进入枯草芽孢杆菌WB800N中，形成枯草芽孢杆菌表达菌RL302.

挑取成功验证的RL302菌株接种于5mL含有10ug/mL LB培养基中，置于摇床在37度过夜培养，按1％的接种量将上述过夜的一级培养液分别接种于500mL含抗生素的LB培养基中，37度培养至OD达到0.8左右，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，温度降为28度。在诱导后24小时从发酵液中提取得到未成熟的Nisin蛋白。

4、在米曲霉表达菌株RL303中合成半成熟的Nisin前体肽

在nisA、nisB和nisC三个基因前面分别加上来自构巢曲霉的gpdA启动子，来自黑曲霉的pkiA启动子和来自构巢曲霉的trpC启动子，并分别加上构巢曲霉的trpC终止子，米曲霉 的agdA终止子和黑曲霉的glaA终止子，同时从质粒pYH-WA-pyrG-KI上克隆构巢曲霉的pyrG基因片段，将这四个片段首尾相连后克隆到pMD-18T载体上形成质粒pRL303，质粒图如图4。将质粒酶切线性化之后转入米曲霉营养缺失型菌株(pyrG-)中，得到米曲霉表达菌株RL303。

将RL303菌株接种到PDB培养基中，28℃，220rpm培养3-4天，过滤收集菌体提取蛋白。

5、在里氏木霉中合成半成熟的Nisin前体肽

在nisA、nisB和nisC三个基因前面分别加上里氏木霉(Trichoderma reesei)cbhI基因的启动子，长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)egl1基因的启动子和微紫青霉(Penicillium janthinellum)egl2基因的启动子，并分别加上构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC终止子和Nos终止子，将这三个表达框均克隆到更换了潮霉素抗性基因启动子的pCambia1301上，得到质粒pRL311(见图12)。将质粒pRL311转化到根癌农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化里氏木霉(Trichoderma reesei)，得到重组菌株RL311。

将此重组菌株RL311接种到含5g/L的葡萄糖，10g/L的纤维物质和10g/L的微晶纤维素的30mL基础发酵培养基(BFM)培养基中，250mL的摇瓶，200rpm，28℃，pH5-6，振荡培养5d，使用10％的氨水调节pH，发酵结束后收集蛋白。

二、表达纯化NisP蛋白

利用大肠杆菌蛋白表达纯化系统，将nisP基因通过NdeI和XhoI位点克隆在pET28(a)质粒上，形成质粒pRL304，质粒图如图5。将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中形成大肠杆菌表达菌RL304。

将RL304在含有卡那霉素的5mL LB培养基37℃，200rpm培养12小时，按1％接种量将大肠杆菌过夜培养物转接入300mL含有卡那霉素LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养约2小时至OD值约为0.6，加入0.25mM IPTG进行诱导，诱导后温度降为18℃继续培养18小时后收集菌体。将菌体悬浮在Tris缓冲液中通过超声破碎后，收集上清，将上清通过镍柱，NisP蛋白会结合在镍柱上，最后再用含有咪唑的洗脱缓冲液将NisP蛋白从镍柱上洗脱下来，即为纯化得到的NisP蛋白。

三、合成Nisin前体肽：NisA蛋白、NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白

(一)合成NisA蛋白

按照以下步骤，分别在酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉中合成NisA蛋白：

1、在酿酒酵母中合成NisA蛋白

将nisA克隆在酿酒酵母表达载体pYes2上，形成质粒pRL305,质粒图如图6。将这个质粒转化进入酿酒酵母INVSC1中，得到酿酒酵母表达菌RL305。

从选择平板上挑取RL305单克隆至5mL SC-U选择培养基中(含有2％葡萄糖)，30℃摇 瓶过夜后，将其转入50mL SC-U选择培养基中(含有2％葡萄糖)，30℃摇瓶培养6小时后，培养测量过夜培养物的OD值。计算满足300mL诱导培养基OD为0.4所需的菌液量。计算方法如下：过夜培养的菌液OD为a。300mL选择培养基所需要的菌液量为(120/a)mL。取上述步骤所需量的菌液，4℃1500rpm离心5分钟，收集菌体。用1-2mL诱导培养基(SC-U，含2％棉籽糖)重悬菌体，加入300mL诱导培养基(SC-U，含2％棉籽糖)中，30℃摇瓶培养1-2小时，加入1％的半乳糖进行诱导，在诱导后24小时后收集菌体，从中得到NisA蛋白。

2、在链霉菌中合成NisA蛋白

将nisA基因克隆在载体pIB139上，构成链霉菌表达载体pRL306，质粒图如图7。将这个质粒通过结合转移进入链霉菌FR008宿主细胞中，形成链霉菌表达菌RL306。

从选择平板上挑取经验证成功的RL306至5mL TSBY培养基中,28℃摇瓶过夜后，将其转入50mL TSBY培养基中，28℃继续摇瓶培养待菌长浓后再按照2％的转接量转入300mL的TSBY培养基中培养36小时，收集菌体，再将菌体破碎后得到NisA蛋白。

3、在枯草芽孢杆菌中合成NisA蛋白

将nisA基因克隆在枯草芽孢杆菌表达载体pHT43上，构成枯草芽孢杆菌表达载体pRL307，质粒图如图8。将这个质粒转化进入枯草芽孢杆菌WB800N中，形成枯草芽孢杆菌表达菌RL307。

挑取成功验证的RL307菌株接种于5mL含有10ug/mL LB培养基中，置于摇床在37度过夜培养，按1％的接种量将上述过夜的一级培养液分别接种于500mL含抗生素的LB培养基中，37度培养至OD达到0.8左右，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，温度降为28度。在诱导后24小时从发酵液中提取得到NisA蛋白。

4、在米曲霉合成NisA蛋白

在nisA基因前后分别加上来自构巢曲霉的gpdA启动子和trpC终止子，同时从质粒pYH-WA-pyrG-KI上克隆构巢曲霉的pyrG基因片段，将这四个片段首尾相连后克隆到pMD-18T载体上形成质粒pRL308，质粒图如图9。将质粒酶切线性化之后转入米曲霉营养缺失型菌株(pyrG-)中，得到米曲霉表达菌株RL308。

将RL308菌株接种到PDB培养基中，28℃，220rpm培养3-4天，过滤收集菌体提取蛋白NisA。

5、在毕赤酵母中合成NisA蛋白

将nisA克隆到pGAPZ-α质粒上，使基因A处于α-信号肽和AOX1终止子之间，利用组成型GAP启动子进行表达，得到质粒pRL312，质粒图如图13。将pRL312转化到毕赤酵母GS115中，筛选得到重组菌株RL312。

将重组菌株RL312接种到YPD培养基中，30℃，220rpm培养96小时后，收集发酵液提取蛋白NisA。

(二)分别合成NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白

将nisZ基因克隆在pET28(a)质粒上，形成质粒pRL313，质粒图如图14。将该质粒导入 大肠杆菌BL21(DE3)中形成大肠杆菌表达菌RL313。

将nisQ基因克隆在pET28(a)质粒上，形成质粒pRL314，质粒图如图15。将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中形成大肠杆菌表达菌RL314。

将nisF基因克隆在pET28(a)质粒上，形成质粒pRL315，质粒图如图16。将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中形成大肠杆菌表达菌RL315。

将nisU基因克隆在pET28(a)质粒上，形成质粒pRL316，质粒图如图17。将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中形成大肠杆菌表达菌RL316。

将nisU2基因克隆在pET28(a)质粒上，形成质粒pRL317，质粒图如图18。将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中形成大肠杆菌表达菌RL317。

分别将菌株RL313、RL314、RL315、RL316、RL317在含有卡那霉素的5mL LB培养基37℃，200rpm培养12小时，按1％接种量将大肠杆菌过夜培养物转接入300mL含有卡那霉素LB培养基中，37℃,200rpm摇床培养约2小时至OD值约为0.6，加入0.25mM IPTG进行诱导，诱导后温度降为18℃继续培养18小时后收集菌体。破碎后即可得到相应的蛋白。

四、表达纯化NisB蛋白

利用大肠杆菌蛋白表达纯化系统，将nisB基因克隆在pET28(a)质粒上，形成质粒pRL309，质粒图如图10。将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中形成大肠杆菌表达菌RL309。

将RL309在含有卡那霉素的5mL LB培养基37℃，200rpm培养12小时，按1％接种量将大肠杆菌过夜培养物转接入300mL含有卡那霉素LB培养基中，37℃,200rpm摇床培养约2小时至OD值约为0.6，加入0.25mM IPTG进行诱导，诱导后温度降为18℃继续培养18小时后收集菌体。将菌体悬浮在Tris缓冲液中通过超声破碎后，收集上清，将上清通过镍柱，NisB蛋白会结合在镍柱上，最后再用含有咪唑的洗脱缓冲液将NisB蛋白从镍柱上洗脱下来，即为纯化得到的NisB蛋白。

五、表达纯化NisC蛋白

利用大肠杆菌蛋白表达纯化系统，将nisC基因克隆在pET28(a)质粒上，形成质粒pRL310，质粒图如图11。将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中形成大肠杆菌表达菌RL310。

将RL310在含有卡那霉素的5mL LB培养基37℃，200rpm培养12小时，按1％接种量将大肠杆菌过夜培养物转接入300mL含有卡那霉素LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养约2小时至OD值约为0.6，加入0.25mM IPTG进行诱导，诱导后温度降为18℃继续培养18小时后收集菌体。将菌体悬浮在Tris缓冲液中通过超声破碎后，收集上清，将上清通过镍柱，NisC蛋白会结合在镍柱上，最后再用含有咪唑的洗脱缓冲液将NisC蛋白从镍柱上洗脱下来，即为纯化得到的NisC蛋白。

六、用NisP蛋白体外酶解半成熟的Nisin前体肽

针对步骤一中在不同微生物中分别合成的几种半成熟的Nisin前体肽，均分别进行以下操作：

利用0.5M磷酸缓冲液悬浮半成熟的Nisin前体肽，并添加步骤二中纯化获得的NisP蛋白，然后于30摄氏度下避光反应5小时后，收集产物进行质谱鉴定。结果，均得到了成熟的Nisin蛋白。

七、用胰蛋白酶Trypsin体外酶解半成熟的Nisin前体肽

针对步骤一中在不同微生物中分别合成的几种半成熟的Nisin前体肽，均分别进行以下操作：

将半成熟的Nisin前体肽用0.5M磷酸缓冲液悬浮，添加Trypsin并于30摄氏度下避光反应5小时后，收集产物进行质谱鉴定。结果，均得到了成熟的Nisin蛋白。

八、用NisB、NisC和NisP蛋白体外酶解Nisin前体肽

针对步骤三中在不同微生物中分别合成的几种Nisin前体肽(即NisA蛋白、NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白)，均分别进行以下操作：

将Nisin前体肽用0.5M磷酸缓冲液悬浮，添加纯化步骤四中获得的NisB蛋白、步骤五中获得的NisC蛋白、以及步骤二中获得的NisP蛋白，并于30摄氏度下避光反应10小时后，收集产物进行质谱鉴定。结果，均得到了成熟的Nisin蛋白。

九、Nisin蛋白产量和质量检测

参照文献Aeration and fermentation strategies on nisin production.Biotechnology Letters.2015,olume 37,Issue 10,pp 2039-2045中报道的检测方法，检测步骤六、七、八中Nisin蛋白的产量，结果发现，获得的Nisin的产量均显著高于目前报道的利用乳酸菌生产Nisin的产量。例如上述的文献Aeration and fermentation strategies on nisin production.Biotechnology Letters.2015,olume 37,Issue 10,pp 2039-2045中的Nisin产量为15400IU/mL，而本发明上述步骤六、七、八中Nisin蛋白的产量显著高于15400IU/mL。由此，表明本发明相对于现有技术能够生产更多的Nisin，也即产量更高。

通过质谱分析发现，本发明上述步骤六、七、八中得到的Nisin蛋白的纯度均高于目前市售的Nisin应用产品(不包括标准品)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本 发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。