酮还原酶的制作方法

技术特征：

1.酮还原酶，其包含与SEQ ID NO:2具有至少72％同源性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的酮还原酶，其能够立体选择性地将通式(I)的酮底物还原为仲醇

或者其能够将通式(I')的醛底物还原为伯醇

其中X和Y各自独立地选自饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族或脂环族C_1-12-烃残基；未取代或单取代或多取代的C_6-10-芳香族烃残基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基与CO-部分桥连；未取代或单取代或多取代的杂芳烃残基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基与CO-部分桥连；以及包含单糖、双糖或寡糖的糖残基或包含单糖、双糖或寡糖的脱氧糖残基；

其中单取代或多取代意指独立地被选自以下的一种或多种官能团取代：-卤素、-OH、＝O、-OC_1-12-烷基、-OC_6-10-芳基、-O-杂芳基、-OCOC_1-12-烷基、-OCOC_6-10-芳基、-OCO-杂芳基、-SH、-SC_1-12-烷基、-SC_6-10-芳基、-S-杂芳基、-S(＝O)_1-2OH、-NO、-NO₂、-N₃、-NH₂、-NH(C_1-12-烷基)、-N(C_1-12-烷基)₂、-NH(C_6-10-芳基)、-N(C_6-10-芳基)₂、-NH(杂芳基)、-N(杂芳基)₂、-CN、-CHO、-CO₂H、CO-C_1-2-烷基、-CO-C_6-10-芳基和-CO-杂芳基。

3.根据权利要求2所述的酮还原酶，其中所述酮底物选自下组：

(i)根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物

其中

R₁和R₂各自独立地选自下组：-H；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的-C_3-8-环烷基；未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；或者未取代或单取代或多取代的杂芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；或者，可选择地，其中

R₁和R₂连同其连接的氮原子一起形成未取代或单取代或多取代的C_2-8-杂环烷基环或未取代或单取代或多取代的杂芳基环；

R₃、R₄、R₅和R₆各自独立地选自：-H；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；或其中R₃和R₄一起为＝O；

R₇为未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基；或未取代或单取代或多取代的杂芳基；

(ii)根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物

其中

R₈为未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；或者未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；

R₉为-H；-卤素；-CN；或-OR₁₁，其中R₁₁为氢或保护基；

R₁₀为-H；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；或者未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；

(iii)根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物

其中

R₁₂、R₁₃、R₁₄、R₁₅和R₁₆各自独立地选自下组：-H；-卤素；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；未取代或单取代或多取代的-杂芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；以及-OR₁₈，其中R₁₈为-H，未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基，或者未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；

R₁₇为-H；-卤素；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；未取代或单取代或多取代的-杂芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；-OR₁₉，-NH₂，-NHR₁₉或-NR₁₉R₂₀，其中R₁₉和R₂₀各自独立地选自未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；或未取代或单取代或多取代的-杂芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；

(iv)根据通式(V)的苯甲酰-衍生物

其中

R₂₁和R₂₂各自独立地选自未取代或单取代或多取代的C_6-10-芳基和未取代或单取代或多取代的杂芳基；

(v)根据通式(VI)的开环二酮-衍生物

其中

R₂₃和R₂₄各自独立地选自-H和-C_1-12-烷基；以及

(vi)3-奎宁环酮；

(vii)乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；以及

(viii)乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯；

(ix)酮糖；

或者其中所述醛底物选自下组：

(x)2-丁醛；以及

(xi)1-庚醛；

其中在各种情况下单取代或多取代意指独立地被选自以下中的一种或多种官能团取代：-卤素，＝O，-OH，-OC_1-12-烷基，-OC_6-10-芳基，-O-杂芳基，-OCOC_1-12-烷基，-OCOC_6-10-芳基，-OCO-杂芳基，-SH，-SC_1-12-烷基，-SC_6-10-芳基，-S-杂芳基，-S(＝O)_1-2OH，-NO，-NO₂，-N₃，-NH₂，-NH(C_1-12-烷基)，-N(C_1-12-烷基)₂，-NH(C_6-10-芳基)，-N(C_6-10-芳基)₂，-NH(杂芳基)，-N(杂芳基)₂，-CN，-CHO，-CO₂H，CO-C_1-2-烷基，-CO-C_6-10-芳基和-CO-杂芳基。

4.根据前述权利要求中任一项所述的酮还原酶，其

(i)以0.01-100U/mg酮还原酶的冻干物的速率将异丙醇转化为丙酮；和/或

(ii)相对于其孵育前的活性，于30℃在50％的水性异丙醇中孵育48小时后，展示至少1％的残余活性。

5.根据前述权利要求中任一项所述的酮还原酶，其不与SEQ ID NO:2的肽相同，且其与SEQ ID NO:2的肽相比展示提高的比活性、温度稳定性和/或立体选择性。

6.根据权利要求5所述的酮还原酶，其中在选自以下位置的至少一个或多个位置上工程化SEQ ID NO:2：Y21、V23、S33、L39、R40、A43、P68、V89、G95、P97、T98、D103、G109、V119、L121、V124、Y125、I149、L150、S154、E155、T157、A158、T163、H190、Y193、L198、L199、A201、A206、Y207、V229和V247。

7.根据权利要求5或6所述的酮还原酶，其中在选自以下位置的至少一个或多个位置上工程化SEQ ID NO:2：

8.根据权利要求5-7中任一项所述的酮还原酶，

(i)其中所述酮还原酶的比活性高于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的比活性；和/或

(ii)其中所述酮还原酶的温度稳定性高于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的温度稳定性；和/或

(iii)其中所述酮还原酶的立体选择性高于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的立体选择性。

9.根据前述权利要求中任一项所述的酮还原酶，其包含与以下序列具有至少85％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93。

10.用于以下的方法：

-将酮底物还原为仲醇；

-将醛底物还原为伯醇；

-将仲醇底物氧化为酮产物；

-将伯醇底物氧化为醛；和/或

-将醛底物氧化为羧酸；

其中所述方法包括在权利要求1-9中任一项所述的酮还原酶的存在下使所述底物与适合的辅因子反应的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述底物如权利要求2或3中所限定。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中

(i)所述底物为乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯，用包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酮还原酶将其立体选择性地还原为乙基(3S)-4-氯-3-羟基-丁酸酯；

(ii)所述底物为叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯，用包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的酮还原酶将其立体选择性地还原为叔丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基-己酸酯；

(iii)所述底物为N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺，用包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的酮还原酶将其立体选择性地还原为(1S)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇；

(iv)所述底物为(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯，用包含SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:91的氨基酸序列的酮还原酶将其立体选择性地还原为(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基-己酸酯；

(v)所述底物为乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)，用包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的酮还原酶将其立体选择性地还原为17-β-开环醇(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14-酮-17-β-醇)；或

(vi)所述底物为N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺，用包含SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:87的氨基酸序列的酮还原酶将其立体选择性地还原为(1S)-3-(甲氨基)-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇。

13.权利要求1-9中任一项所述的酮还原酶用于以下用途：

-将酮底物还原为仲醇；

-将醛底物还原为伯醇；

-将仲醇底物氧化为酮产物；

-将伯醇底物氧化为醛；和/或

-将醛底物氧化为羧酸。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述酮底物如权利要求2或3中所限定。

15.增加具有可与SEQ ID NO:2匹配的氨基酸序列的酮还原酶的热稳定性的方法，所述方法包括在选自与SEQ ID NO:2的位置V89、Y125和V229对应的位置中的至少一个氨基酸位置上工程化所述酮还原酶。