酮还原酶的制作方法

酮还原为仲醇对工业应用具有极大的兴趣，因为前手性羰基化合物被立体选择性地还原为手性醇。在一些工业应用中，也需要用于外消旋化合物的手性拆分的仲醇向酮的立体选择性转化，例如可使对映异构体分离。在工业应用中，伯醇向醛的酶促氧化和醛向伯醇的酶促还原通常被认为具有较低的相关性，但也可由KRED催化。可通过调节酶反应的化学平衡影响相同的KRED分别在氧化反应或还原反应中的使用。

KRED催化的还原需要还原型辅因子(reduced cofactor)作为电子供体。一些KRED使用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为辅因子，其他KRED使用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，一些酮还原酶可使用NADH和NADPH两者。KRED催化的氧化相应地需要氧化型辅因子作为电子受体。对于该反应，KRED使用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADP⁺)或者NAD⁺和NADP⁺两者。

KRED是在生命的所有界中发现的普遍存在的酶。已知的商购可得的KRED来自马肝(HLADH)、面包酵母(YADH)和细菌，例如布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii，TBADH)和开啡尔乳杆菌(Lactobacillus kefir，LKADH)。

基于其序列一致性和生化特性，KRED可分为不同的蛋白质家族。SDR-家族(短链-脱氢酶/还原酶)的成员展示短链酶，其不含有任何金属离子。相反，MDR-家族(中链-脱氢酶/还原酶)的成员展示中链酶，其取决于Zn²⁺。KRED的另一组展示取决于Fe²⁺的长链酶(供查阅：K.Drauz,H.O.May,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis,Wiley VCH,Weinheim,2012)。

对于工业应用，可取的是使用具有高比活性(specific activity)和立体选择性的KRED。工业使用KRED的另一个重要标准是长加工稳定性，其通常与高温下的高稳定性和高溶剂稳定性相关。如果底物已经是手性的，则还需要使用具有高立体定向性的KRED。

可通过酶工程实现酶的改进。该技术涉及开发具有改进性质的起始酶的变体(供查阅：S.Lutz,U.T.Bornscheuer,Protein Engineering Handbook,Wiley VCH,Weinheim,2009)。

在还原过程中KRED的体外使用需要NAD(P)H的再生系统。常见的再生系统是葡萄糖脱氢酶(GDH)或甲酸脱氢酶，其与KRED联合使用。也可通过共底物(通常是伯醇或仲醇，例如异丙醇氧化为丙酮)的伴随氧化由KRED本身进行辅因子再生。KRED作为还原催化剂与辅因子再生系统的伴随使用需要同时接受酮底物和用于辅因子再生的共底物。特异性共底物的选择可取决于用于这种共底物的KRED的比活性和在特定辅因子再生条件下的KRED稳定性。

除了醛的可逆还原，还有一些关于酮还原酶催化醛氧化成相应的酸的报道。然而，该反应被认为是副反应而不是主要反应(供查阅：K.Drauz,H.O.May,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis,Wiley VCH,Weinheim,2012)。

KRED的工业应用以产生有价值的化合物的实例为通过红平红球菌(Rhodococcus erythroplis)KRED的1-苯基-2-丙酮的还原、通过短乳杆菌(Lactobacillus brevis)KRED的乙酰乙酸乙酯的还原或通过来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的KRED的6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸乙酯的还原(供查阅：A.Liese,K.Seelbach,C.Wandrey,Industrial Biotransformations,WileyVCH,Weinheim,2006)。

即使文献中描述了大量的催化不对称还原的KRED，但是仅有少数KRED用于专利方法中。许多方法含有来自开菲尔酸乳杆菌(LKADH)或其变体的酮还原酶。US 8,426,178公开了通过LKADH的变体将N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺立体选择性地还原为(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺的方法。US 8,512,973描述了通过来自开菲尔酸乳杆菌、短乳杆菌或小乳杆菌(Lactobacillus minor)的KRED变体将2',6'-取代的乙酰苯立体选择性地还原为相应取代的(S)-1-苯乙醇的方法。US7,977,078中公开了通过LKADH变体将3-酮四氢噻吩(3-ketothiolane)立体选择性地还原为(R)-3-羟基四氢噻吩的方法。US 8,617,853描述了通过来自开菲尔酸乳杆菌、短乳杆菌或小乳杆菌的KRED的变体将底物2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯立体选择性的还原为(S,E)-甲基2-(3-(3-(2-(7-氯喹啉-2-基)乙烯基)苯基)-3-羟丙基)苯甲酸酯的方法。US 8,273,554公开了通过LKADH变体将5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1,3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1,5-二酮立体选择性地还原为(4S)-3[(5S)-5-(4氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-恶唑烷-2-酮的方法。US 6,645,746中描述了通过木兰假丝酵母(Candida magnolia)的酮还原酶将叔丁基(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯不对称地还原为叔丁基(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸酯的方法。US 7,393,667公开了丙-2-醇的制备，例如使用安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)的酮还原酶通过相应的氧代化合物的立体选择性还原制备1-[4-(4-卤代-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基-吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基]-丙-2-醇。US 8,288,131涉及通过LKADH的变体立体选择性地将2-甲基戊醛还原为(R)-2-甲基戊醇的方法。WO2011/022548公开了通过LKADH变体将1-(3-羟苯基)-2-(甲基氨基)乙酮立体选择性地转化为(R)-苯肾上腺素的方法。WO 2012/046254中公开了用于使用来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)或大肠杆菌(E.coli)的KRED制备(S)或(R)-3-羟基-l-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[l,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-l-酮的4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H-基)-1-(2,4,5-三氟-苯基)丁-2-酮的立体选择酶还原过程。US 8,257,952公开了能够立体选择性地将甲基-2-苯甲酰胺基甲基-3-氧代丁酸酯还原为2R,3R-甲基-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基-丁酸酯的LKADH变体。US 7,629,157描述了来自兰假丝酵母的酮还原酶的变体，其能够将4-氯乙酰乙酸乙酯立体选择性地转化为乙基(S)-4-氯-3-羟基丁酸。

EP 1 553 170涉及形成(R)-N-苄基-3-吡咯烷醇的多肽、编码所述多肽的多核苷酸及其用途。据说该多肽具有以下物理和化学性质(1)-(4)：(1)活性：用NADH或NADPH作为辅酶作用于N-苄基-3-吡咯烷酮，从而形成(R)-N-苄基-3-吡咯烷醇；(2)活性的最适pH：5.5-6.0；(3)活性的最适温度：50-55℃；(4)分子量：凝胶过滤分析测量约55,000，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析测量约28,000。

蛋白质数据库在线，登录号：WP_022887115，涉及的Glaciibacter superstes短链脱氢酶。

然而，现有技术的酮还原酶在各方面都不令人满意，需要与常规酮还原酶相比具有优点的酮还原酶，特别是分别在手性醇化合物的工业生产中高加工稳定性和良好的辅因子再生活性方面具有优点的酮还原酶。在这方面，工业应用中的高加工稳定性可包括在水环境、非水环境和/或两相体系中，和/或高底物浓度下和/或高温下和/或外加水溶性溶剂和/或4-11的宽pH范围内和/或固体支撑物(即，当固定化时)上和/或高剪切力(例如，通过搅拌、抽吸、膜过滤制备)下的化学和物理稳定性以及酶活性。其他因素，例如底物选择性、K_M、比活性、立体选择性、立体定向性、非对映立体选择性、区域选择性、底物抑制、产物抑制，其他因素例如粗提取组分、底物污染物或副产物的抑制，以及在适合寄主中的重组可溶性表达能力可起重要作用。当底物为手性底物时，即已经含有一个或多个手性中心和/或其手性轴时，可取的是所述手性底物中含有的前手性羰基的酶促还原的立体选择性基本上不受所述一个或多个手性中心和/或轴的影响。

本发明的目的是提供改善的酮还原酶。

已经通过本专利请求保护的主题解决了该问题。

本发明提供新酮还原酶，特别是与野生型酶、优选SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶相比展示性质提高的工程化酮还原酶。

本发明的第一方面涉及包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少72％同源性的氨基酸序列的酮还原酶。

本发明的酮还原酶包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有确定同源性的氨基酸序列。这意味着本发明的酮还原酶可包含作为其总氨基酸序列的子序列的所述氨基酸序列，或者本发明的酮还原酶可基本上由所述氨基酸序列组成。当本发明的酮还原酶包含作为其总氨基酸序列的子序列的所述氨基酸序列时，所述总氨基酸序列可在所述子序列的N端和/或C端被延伸，即可包含其他氨基酸残基。这样的延伸可能是有利的，例如，当酮还原酶固定在固体支撑物上，例如用于纯化目的时。

在本发明的意义中，使用BLASTP优选将同源性计算为同一性(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,AlejandroJinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller，和David J.Lipman(1997)"Gapped BLAST和PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Stephen F.Altschul,John C.Wootton,E.Michael Gertz,Richa Agarwala,Aleksandr Morgulis,Alejandroand Yi-Kuo Yu(2005)“Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices.”FEBS J.272:5101-5109)，优选使用BLASTP 2.2.29+版本(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，优选使用以下设置：

·字段“输入查询序列”：查询子范围：无

·字段“选择搜索设置”：数据库：无余度蛋白质序列(nr)；可选参数：

无

·字段“程序选择”：算法：blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)

·算法参数：字段“一般参数”：最大目标序列：100；短查询：自动调整短输入序列的参数；期望阈值：10；字长：3；查询范围的最大匹配：0

·算法参数：字段“评分参数”：矩阵：BLOSUM62；成本差距(Gap Cost)：存在：11延伸(Extension)：1；组成调整：条件组成得分矩阵调整

·算法参数：字段“滤波器和掩码”：滤波器：无；掩码：无。

优选地，本发明的酮还原酶能够将酮底物立体选择性地还原为仲醇和/或能够将仲醇立体选择性地氧化为酮产物。

优选地，本发明的酮还原酶能够将伯醇氧化为醛和/或能够将醛还原为伯醇。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将醛化合物氧化为羧酸。

优选地，酮还原酶包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少72％同源性的氨基酸序列，优选为至少75％，或至少80％，或至少82％，或至少84％，更优选为至少86％，或至少88％，仍更优选为至少90％，或至少91％，仍更优选为至少92％，或至少93％，甚至更优选为至少94％，或至少95％，最优选为96％，或至少97％，特别是至少98％，或至少99％。

已经令人惊讶地发现，本发明的酮还原酶展示：

-高活性，

-宽底物耐受性，

-高立体选择性，

-高立体定向性，和/或

-在可选地含有共底物例如异丙醇的各种溶剂中的高稳定性。

为了说明的目的，立体选择性是这样的化学反应的性质，即其中单一反应物在非立体定向产生新立构中心期间或在非立体定向转化已存在的立构中心期间形成立体异构体的不平等混合物。选择性通常来自导致不同产物的机械途径中立体效应和电子效应的差异。优选地，底物在本发明的酮还原酶的催化下向手性产物的转化以至少50％ee，更优选至少75％ee，仍更优选至少90％ee，仍更优选至少95％ee，甚至更优选至少97％ee，最优选至少98％ee，特别是至少99％ee的对映异构体过量提供所需手性产物。

为了说明的目的，立体特异性是从不同立体异构反应物导致不同立体异构反应产物的反应机理的性质，或其仅作用于立体异构体中的一个(或子集)。优选地，手性底物在本发明的酮还原酶的催化下向另一种手性产物的转化以至少50％de，更优选至少75％de，仍更优选至少90％de，仍更优选至少95％de，甚至更优选至少97％de，最优选至少98％de，特别是至少99％de的非对映异构体过量提供所需手性产物。

在优选的实施方案中，本发明的酮还原酶优选能够将通式(I)的酮底物立体选择性地还原为仲醇

或者本发明的酮还原酶优选能够将通式(I')的醛底物立体选择性地还原为伯醇

其中X和Y各自独立地选自饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族或脂环族C_1-12-烃残基；未取代或单取代或多取代的C_6-10-芳香族烃残基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基与CO-部分桥连；未取代或单取代或多取代的杂芳烃残基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基与CO-部分桥连；以及包含单糖、双糖或寡糖的糖残基或包含单糖、双糖或寡糖的脱氧糖残基；

其中单取代或多取代意指独立地被选自以下中的一种或多种官能团取代：-卤素、-OH、＝O、-OC_1-12-烷基、-OC_6-10-芳基、-O-杂芳基、-OCOC_1-12-烷基、-OCOC_6-10-芳基、-OCO-杂芳基、-SH、-SC_1-12-烷基、-SC_6-10-芳基、-S-杂芳基、-S(＝O)_1-2OH、-NO、-NO₂、-N₃、-NH₂、-NH(C_1-12-烷基)、-N(C_1-12-烷基)₂、-NH(C_6-10-芳基)、-N(C_6-10-芳基)₂、-NH(杂芳基)、-N(杂芳基)₂、-CN、-CHO、-CO₂H、CO-C_1-2-烷基、-CO-C_6-10-芳基和-CO-杂芳基。

优选地，X和Y各自独立地选自未取代或单取代或多取代的C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的C_6-10-芳基，任选地通过未取代或单取代或多取代的C_1-12-亚烃基残基与CO-部分桥连；未取代或单取代或多取代的杂芳基，任选地通过未取代或单取代或多取代的C_1-12-亚烃基残基与CO-部分桥连；以及包含单糖、双糖或寡糖的糖残基或包含单糖、双糖或寡糖的脱氧糖残基；

其中单取代或多取代意指独立地被选自以下中的一种或多种官能团取代：-卤素、-OH、＝O、-OC_1-12-烷基、-OC_6-10-芳基、-O-杂芳基、-OCOC_1-12-烷基、-OCOC_6-10-芳基、-OCO-杂芳基、-SH、-SC_1-12-烷基、-SC_6-10-芳基、-S-杂芳基、-S(＝O)_1-2OH、-NO、-NO₂、-N₃、-NH₂、-NH(C_1-12-烷基)、-N(C_1-12-烷基)₂、-NH(C_6-10-芳基)、-N(C_6-10-芳基)₂、-NH(杂芳基)、-N(杂芳基)₂、-CN、-CHO、-CO₂H、CO-C_1-2-烷基、-CO-C_6-10-芳基和-CO-杂芳基。

为了说明的目的，能够优选地将酮底物立体选择性还原意指在适合的辅因子的存在下，在适合的条件下(优选在pH为7.0和30℃的水中)，酮还原酶对至少一种酮底物展现至少一些活性从而产生仲醇。

为了说明的目的，饱和或不饱和脂肪族C_1-12-烃残基包括但不限于烷基残基、烯基残基或炔基残基，例如-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂CH(CH₃)₂、-C(CH₃)₃、-CH＝CH₂、-CH＝CHCH＝CH₂、-C≡CH和-CH＝CHC≡CH。

为了说明的目的，饱和或不饱和的脂环族C_1-12烃残基包括但不限于C_3-12-环烷基，其中1个或2个碳环原子可任选地被选自N、O和S的杂原子取代(C_1-12-杂环烷基)。

为了说明的目的，C_6-10-芳香族烃残基(＝C_6-10-芳基)包括但不限于苯基和萘基。

为了说明的目的，杂芳香族烃残基(＝杂芳基)包括但不限于单环环系、二环环系和三环环系。单环杂芳基的实例包括但不限于氮杂环丁烷基、氮杂环庚烷基、吖丙啶基、二吖庚因基、1,3-二氧戊环基、二氧六环基、二噻烷基、呋喃基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑基、异噻唑啉基、异噻唑烷基、异恶唑基、异恶唑啉基、异恶唑烷基、吗啉基、恶二唑基、恶二唑啉基、恶二唑烷基、恶唑基、恶唑啉基、恶唑烷基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四嗪基、四唑基、噻二唑基、噻二唑啉基、噻二唑烷基、噻唑基、噻唑啉基、噻唑烷基、噻吩基、硫代吗啉基、1,1-二氧代硫代吗啉基(硫代吗啉砜)、噻喃基、三嗪基、三唑基和三噻烷基。二环杂芳基的实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基，苯并噻吩基、苯并三唑基、苯并恶唑基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚基、2,3-二氢吲哚基、吲嗪基、萘啶基、异苯并呋喃基、异苯并噻吩基、异吲哚基、异喹啉基、酞嗪基、4H-吡啶并(1,2-a)嘧啶-4-酮、吡喃并吡啶基、喹啉基、喹嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基和噻喃并吡啶基。三环杂芳基的实例包括但不限于吖啶基、咔唑基、咔啉基、二苯并(b,d)呋喃基、二苯并(b,d)噻吩基、萘并(2,3-b)呋喃、萘并(2,3-b)噻吩基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩恶嗪基、噻蒽基、噻吨基和呫吨基。

为了说明的目的，烷基(例如-C_1-12-烷基)、环烷基(例如-C_3-8-环烷基)、芳基(例如-C_6-10-芳基)和杂芳基各自的单取代或多取代，优选地独立地是指核的氢被选自下组中的一种或多种官能团取代：-卤素(优选为-F、-Cl、-Br、-I)，-OH，＝O，-OC_1-12-烷基，-OC_6-10-芳基，-O-杂芳基，-OCOC_1-12-烷基，-OCOC_6-10-芳基，-OCO-杂芳基，-SH，-SC_1-12-烷基，-SC_6-10-芳基，-S-杂芳基，-S(＝O)_1-2OH，-NO，-NO₂，-N₃，-NH₂，-NH(C_1-12-烷基)，-N(C_1-12-烷基)₂，-NH(C_6-10-芳基)，-N(C_6-10-芳基)₂，-NH(杂芳基)，-N(杂芳基)₂，-CN，-CHO，-CO₂H，CO-C_1-2-烷基，-CO-C_6-10-芳基和-CO-杂芳基。

为了说明的目的，包含单糖、双糖或寡糖的糖残基或包含单糖、双糖或寡糖的脱氧糖残基是指通式(I)的酮底物或通式(I')的醛底物可以为多羟基羰基化合物，任选地通过缩醛键和/或缩酮键连接至其他多羟基羰基化合物。例如，当X为被-OH单取代的C₁烷基和Y为被-OH多取代的C₂烷基时，其中每个碳原子具有单一-OH取代基，通式(I)的酮底物为包含两种对映异构体即D-赤藓酮糖以及L-赤藓酮糖的丁酮糖。类似地，通式的(I)酮底物可以为戊酮糖或己酮糖，其反过来可以连接至其他糖残基从而形成双糖或寡糖。相应地，当X为被-OH多取代的C₂烷基时，其中每个碳原子具有单一-OH取代基，通式(I')的醛底物为包含两种对映异构体D-甘油醛以及L-甘油醛的丙醛糖。类似地，通式(I')的醛底物可以为丁醛糖、戊醛糖或己醛糖，其反过来可以连接至其他糖残基从而形成双糖或寡糖。

在优选的实施方案中，本发明的酮还原酶能够选择性地还原选自下组的酮底物：

(i)根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物

其中

R₁和R₂各自独立地选自下组：-H；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的-C_3-8-环烷基；未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；或者未取代或单取代或多取代的杂芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；或者，可选择地，其中

R₁和R₂连同其连接的氮原子一起形成未取代或单取代或多取代的C_2-8-杂环烷基环或者未取代或单取代或多取代的杂芳基环；

优选地，R₁和R₂为-C_1-12-烷基，更优选为-CH₃；

R₃、R₄、R₅和R₆各自独立地选自：-H；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；或其中R₃和R₄一起为＝O；

优选地，R₃和R₄一起为＝O，R₅和R₆为-H；以及

R₇为未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基；或未取代或单取代或多取代的杂芳基；

优选地，R₇为未取代、单取代或多取代的杂芳基；更优选为未取代的杂芳基；更优选为噻吩基；特别是2-噻吩基；

其中该类型的特别优秀的酮底物为N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺

其中该类型的另一种特别优选的酮底物为N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺

(ii)根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物

其中

R₈为未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；或者未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；

优选地，R₈为-C_1-12-烷基；更优选为-C(CH₃)₃；

R₉为-H；-卤素(优选为氯、溴、碘)；-CN；或-OR₁₁，其中R₁₁为氢或保护基(如苄氧基)；

优选地，R₉为卤素或-CN；更优选为-Cl或-CN；

R₁₀为-H；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；或者未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；

优选地，R₁₀为-H；

其中该类型的特别优选的酮底物为叔丁基(5S)-6氯-5-羟基-3-氧代-己酸酯

其中该类型的另一种特别优选的酮底物为叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯

(iii)根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物

其中

R₁₂、R₁₃、R₁₄、R₁₅和R₁₆各自独立地选自下组：-H；-卤素(优选为氯、溴和碘)；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；未取代或单取代或多取代的-杂芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；以及-OR₁₈，其中R₁₈为-H，未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基，或者未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；

优选地，R₁₂、R₁₃、R₁₄、R₁₅和R₁₆独立地为-H、-卤素或OR₁₈；更优选为-H、-Cl或OCH₃；

R₁₇为-H；-卤素(优选为氯、溴和碘)；未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；未取代或单取代或多取代的-杂芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；-OR₁₉，-NH₂，-NHR₁₉或-NR₁₉R₂₀，其中R₁₉和R₂₀各自独立地选自未取代或单取代或多取代的-C_1-12-烷基；未取代或单取代或多取代的-C_6-10-芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；或者未取代或单取代或多取代的-杂芳基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基桥连；

优选地，R₁₇为-H；

其中该类型的特别优选的酮底物为1-(4-氯苯基)乙酮

或者其中该类型的特别优选的酮底物为1-(2-甲氧基苯基)乙酮

(iv)根据通式(V)的苯甲酰-衍生物

其中

R₂₁和R₂₂各自独立地选自未取代或单取代或多取代的C_6-10-芳基和未取代或单取代或多取代的杂芳基；

优选地，R₂₁为未取代或单取代或多取代的C_6-10-芳基，R₂₂为未取代或单取代或多取代的杂芳基；更优选地R₂₁为未取代的C_6-10-芳基，R₂₂为未取代的杂芳基；

其中该类型的特别优选的酮底物为苯基-(2-吡啶基)-甲酮

(v)根据通式(VI)的开环二酮-衍生物

其中

R₂₃和R₂₄各自独立地选自-H和-C_1-12-烷基；以及

优选地，R₂₃为-CH₂CH₃，R₂₄为-C_1-12-烷基；更优选地，R₂₃为-CH₂CH₃，R₂₄为-CH₃；

其中该类型的特别优选的酮底物为乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)

(vi)3-奎宁环酮(即1-氮杂双环并[2.2.2]辛-3-酮)；

(vii)乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；

(viii)乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯；以及

(ix)酮糖，优选为丁酮糖、戊酮糖或己酮糖；

或者本发明的酮还原酶能够优选地立体选择性还原选自下组的醛底物：

(x)2-丁醛(与异丁醛同义)(因为该酮底物为非前手性醛，所以还原并非立体选择性地发生)；以及

(xi)1-庚醛(因为该酮底物为非前手性醛，所以还原并非立体选择性地发生)；

其中在各种情况下单取代或多取代意指独立地被选自下组中的一种或多种官能团取代：-卤素，-OH，-OC_1-12-烷基，-OC_6-10-芳基，-O-杂芳基，-OCOC_1-12-烷基，-OCOC_6-10-芳基，-OCO-杂芳基，-SH，-SC_1-12-烷基，-SC_6-10-芳基，-S-杂芳基，-S(＝O)_1-2OH，-NO，-NO₂，-N₃，-NH₂，-NH(C_1-12-烷基)，-N(C_1-12-烷基)₂，-NH(C_6-10-芳基)，-N(C_6-10-芳基)₂，-NH(杂芳基)，-N(杂芳基)₂，-CN，-CHO，-CO₂H，CO-C_1-2-烷基，-CO-C_6-10-芳基和-CO-杂芳基。

在本发明的一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够还原醛底物或能够优选地立体选择性地将根据通式(I)-(VI)的酮底物，或如上定义的3-奎宁环酮，或乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯，乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯，2-丁醛或1-庚醛，还原为各自的伯醇或仲醇。在本发明的一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将底物例如2-丁醛或1-庚醛氧化为相应的羧酸。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物，优选为N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺，立体选择性还原为优选的(1S)-3-(二甲基氨基)-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:47、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、62、72、85、86、87、88或89，优选为SEQ ID NO:55、58或87，最优选为SEQ ID NO:58的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物，优选为N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺，立体选择性还原为优选的(1S)-3-(甲基氨基)-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:19、28、40、46、47、49、50、55、56、57、58、59、62、64、67、72、81、82、83、85、86、87、88、89、92或93，优选为SEQ ID NO:58、87或92，最优选为SEQ ID NO:87的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物，优选为叔丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯，立体选择性还原为优选的叔丁基(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基-己酸酯。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:34、36、40、49、53、54、55、60、61、62、64、65、66、67、68、70、72、73、74、75、76、77、78、81、82、83、92或93，优选为SEQ ID NO:62、91或92，更优选为SEQ ID NO:91的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物，优选为叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯，立体选择性还原为优选的叔丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基-己酸酯。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:34、36、40、49、55、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、81、82、83、84、92或93，优选为SEQ ID NO:62、91或92，更优选为SEQ ID NO:91的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物，优选为1-(4-氯苯基)乙酮，立体选择性地还原为1-(4-氯苯基)乙醇。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:7、9、12、15、17、18、23、24、28、31、36、38、39、47、48、49、50、51、52、53、54、55、58、62、72、81、82、83、87或92，优选为SEQ ID NO:7、15或28，更优选为SEQ ID NO:28的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物，优选为1-(2-甲氧基苯基)乙酮，立体选择性地还原为1-(2-甲氧基苯基)乙醇。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:15、17、22、24、26、36、38、40、58、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、81、82、83、86、92或93，优选为SEQ ID NO:17、72或92，更优选为SEQ ID NO:72的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将根据通式(V)的苯甲酰-衍生物，优选为苯基-(2-吡啶基)-甲酮，立体选择性地还原为苯基-(2-吡啶基)-甲醇。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:21、24、28、36、38、39、40、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、81、82、83、85、86、87、88、89、92或93，优选为SEQ ID NO:72、82或92，更优选为SEQ ID NO:72的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将根据通式(VI)的开环二酮-衍生物，优选为乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮，立体选择性还原为优选的乙基开环醇(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14-酮-17-β-醇)。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:61、62、65、66、69、70、71、75、78、82、83、86、92或93，优选为SEQ ID NO:69、70或71，更优选为SEQ ID NO:70的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将酮底物乙基3-氧代-3-苯基-丙酸酯立体选择性地还原为乙基3-羟基-3-苯基-丙酸酯。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:17、34、36、40、46、47、52、60、61、62、64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、75、76、77、78、81、82、83、84、92或93，优选为SEQ ID NO:46、76或78，更优选为SEQ ID NO:76的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将酮底物乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯立体选择性地还原为乙基(3S)-4-氯-3-羟基-丁酸酯。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:2、63或90的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将酮底物3-奎宁环酮(与1-氮杂双环并[2.2.2]辛-3-酮盐酸盐同义)立体选择性地还原为3-奎宁环醇(与1-氮杂双环并[2.2.2]辛-3-醇同义)。这样的酮还原酶的实例包含根据SEQ ID NO:17、21、26、38、40、62、72、73、81、83、86、92或93，优选为SEQ ID NO:17、21或73，更优选为SEQ ID NO:17的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将仲醇氧化为相应的酮，例如将2-丁醇氧化为2-丁醛。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将伯醇氧化为醛化合物，例如将1-庚醇氧化为1-庚醛。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将醛化合物氧化为羧酸。

优选地，本发明的酮还原酶能够以高比活性优选以0.1-100U/mg、更优选以1-50U/mg、最优选以10-12U/mg酮还原酶的冻干物的比活性氧化用于辅因子再生的共底物。在本发明的意义中，可通过本发明的酮还原酶转化(优选氧化)并伴随酮底物转化(优选还原)的共底物为伯醇或仲醇。

可根据比活性选择为辅因子再生建立的适合的共底物，优选地选自异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇和2-庚醇。优选地，本发明的酮还原酶以高比活性将异丙醇转化为丙酮。例如，可通过如实施例2(见下文)所述的细胞破裂和随后的粗提取物的冷冻干燥获得酮还原酶冻干物。

为了测定给定共底物的氧化活性，优选地于30℃下在含有20％共底物例如异丙醇和辅因子例如0.25mM NAD(P)的缓冲液中孵育本发明的酮还原酶。通过测量由NAD(P)还原产生的340nm处的吸光度的减少来测定氧化活性。在指定条件下，具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酮还原酶对异丙醇氧化展示10.6U/mg酮还原酶冻干物的比活性。

优选地，本发明的酮还原酶在共底物中展示高比活性，优选在异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇和/或2-庚醇中。优选地，于30℃下在50％水性共底物优选为异丙醇中预孵育酮还原酶48小时之后，酮还原酶相对于其预孵育之前的活性展示至少1％的残余活性，更优选为至少10％或至少20％，仍更优选为至少30％或至少40％，仍更优选为至少50％或至少60％，甚至更优选为至少70％或至少80％，最优选为至少85％或至少90％，特别是至少95％或至少99％。在这方面，本发明意义中的残余活性描述了与不用共底物预孵育之后的活性相比，酶在用共底物预孵育之后的剩余酮还原酶活性。为了测定在共底物包括例如异丙醇中的稳定性，将本发明的酮还原酶在缓冲液中预孵育，优选于30℃下在pH为9、含有50％共底物例如异丙醇中预孵育48小时，将酮还原酶的酶活性与不用共底物预孵育的酶进行比较。本发明的酮还原酶的残余活性为100％，当两种酶活性相同时；即与在不用共底物预孵育下的活性相比没有活性损失。在所述条件下，具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酮还原酶展示残余活性为100％。

共底物通过酮还原酶的有效转化和酮还原酶在共底物中的稳定性与建立用于将酮或醛底物还原为仲醇或伯醇的有效工业方法特别相关。本发明的酮还原酶在共底物中的稳定性及其转化本发明的共底物的能力也与将伯醇和仲醇逆向转化为醛和酮底物相关。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶在工程化SEQ ID NO:2时展示提高的比活性、温度稳定性和/或立体选择性。

本发明的提高的比活性涉及高于非工程化酮还原酶的比活性的工程化酮还原酶的比活性。优选地，该比活性比非工程化酮还原酶的比活性高至少10％、或至少50％、或至少100％、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少300倍、或至少500倍、或至少700倍、或至少1000倍、或至少10,000倍、或至少100,000倍。提高的比活性还意味着工程化酮还原酶确实对所需底物展示了特定活性，而非工程化酮还原酶对所述底物没有显著活性。

本发明的提高的温度稳定性涉及工程化酮还原酶与SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶相比，在30℃下孵育48小时之后具有较高的残余比活性。可选择性地，本发明的提高的温度稳定性可能涉及在较高温度下相同时间或在相同温度下较长时间的孵育之后，工程化酮还原酶与非工程化酮还原酶相比具有相同的残余比活性。

本发明的立体选择性涉及由工程化酮还原酶提供的产物的对映异构体过量高于由SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶提供的产物的对映异构体过量。优选地，与非工程化酮还原酶相比，由工程化酮还原酶提供的对映异构体过量增加至少0.1％ee、至少0.5％ee、至少1％ee、至少2％ee、至少3％ee、至少5％ee、至少7％ee、至少10％ee、至少20％ee、至少30％ee、至少40％ee、至少50％ee、至少60％ee、至少70％ee、至少80％ee、至少90％ee、至少95％ee、至少97％ee、至少98％ee或至少99％ee。提高的立体选择性还可以意味着工程化酮还原酶确实对需要的手性产物具有特定的立体选择性，而非工程化酮还原酶对所述手性产物不具有显著的立体选择性。

优选在标准反应条件下，典型地于30℃下在含有底物、辅因子、选择性增补物和酮还原酶的缓冲水溶液中，测定与SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶相比的工程化酮还原酶的提高的比活性。缓冲液优选地选自含有2mM MgCl₂、pH为7-9的10-200mM Tris/HCl，pH为6-8的10-200mM磷酸钠/NaOH，或pH为7-9的10-200mM三乙醇胺/HCl。优选地加入辅因子NADH至最终浓度范围为0.05-10mM。优选地加入底物至最终浓度范围为5mM-1M，所述底物优选地选自乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯，1-(4-氯-苯基)乙酮、1-(2-甲氧基苯基)乙醇、叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯、N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺、乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)、叔丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯，以及N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺、苯基-(2-吡啶基)-甲酮、乙基3-氧代-3-苯基-丙酸酯、3-奎宁环酮、2-丁醛和1-庚醛。可选的其他增补物优选地选自1-5％Triton^TMX-100(v/v)和0.5-10％DMSO(v/v)。酮还原酶优选地作为粗提取物上清液加入。通过破坏含有酮还原酶的表达宿主来获得粗提取物，随后离心以分离细胞碎片和含有粗提取物上清液的酮还原酶。优选地通过测量产物形成、还原型辅因子NADH的消耗和/或底物消耗来测定比活性。在通过测量产物形成或底物消耗来测定比活性的情况中，辅因子再生体系(异丙醇或GDH/葡萄糖)可应用于标准反应中；在通过测量还原型辅因子NADH的消耗来测定比活性的情况中，不应用辅因子再生体系。在应用辅因子再生体系的情况中，还原型辅因子NADH可用被辅因子再生体系还原的氧化型辅因子NAD⁺替代。

优选地在如上所述的用于测定提高的比活性的标准反应条件下测定与SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶相比工程化酮还原酶的提高的立体选择性。应用手性分析以分析反应中形成的产物。

优选地通过在PCR循环仪中于给定温度下(优选地在SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶展示10％的残余活性的温度下)孵育含有粗提取物的酮还原酶15分钟来测定与SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶相比工程化酮还原酶的提高的温度稳定性。然后将粗提取物在冰上孵育30分钟。通过离心分离不溶蛋白质，在标准酮还原酶试验中分析上清液的剩余酮还原酶活性。在该标准试验中，适用于酮还原酶的底物，例如异丙醇，由酮还原酶氧化为例如丙酮，并伴随NAD⁺还原为NADH(因为该标准试验中不存在其他酮还原酶底物，所以异丙醇用作酮还原酶的底物并且不应用于辅因子再生)。通过在标准光度计中测量340nm处的吸收来监测NADH的增加。在标准反应条件下即典型地于30℃下在含有底物(例如异丙醇)、辅因子和酮还原酶的缓冲水溶液中进行试验。酮还原酶优选地作为粗提取物上清液加入。通过破坏含有酮还原酶的表达宿主来获得粗提取物，随后离心以分离细胞碎片和含有粗提取物上清液的酮还原酶。缓冲液优选地选自pH为7-9、含有2mM MgCl₂的10-200mM Tris/HCl，pH为6-8的10-200mM磷酸钠/NaOH，或pH为7-9的10-200mM三乙醇胺/HCl。优选地加入辅因子NAD⁺至最终浓度范围为0.05-10mM。优选地酮还原酶作为粗提取物上清液加入。通过破坏含有酮还原酶的表达宿主来获得粗提取物，随后离心以分离细胞碎片和含有粗提取物上清液的酮还原酶。

在优选的实施方案中，本发明的工程化酮还原酶通过1-70个氨基酸、典型地1-50个氨基酸、更典型地1-30个氨基酸、甚至更典型地1-20个氨基酸、最典型地1-11个氨基酸而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶。

在这方面，工程化意味着给定位置的一个或多个氨基酸被选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp Tyr和Val中的任意其他蛋白源(proteinogenic)氨基酸取代。在优选的实施方案中，取代不改变序列长度，即单一氨基酸残基被另一个单一氨基酸残基替代。然而，也可能不替代而缺失一个或多个氨基酸残基和/或插入一个或多个氨基酸残基。

原则上，在酶的任意位置上的取代可以为保守取代，这里这样的氨基酸被具有可比性特征的氨基酸取代(例如用另一种疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸)。此外，在酶的任意位置上的取代可以为非保守取代，这里这样的氨基酸被其他特征的氨基酸取代(例如用亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸)。

酶工程化的技术在该文中评述：S.Lutz,U.T.Bornscheuer,Protein Engineering Handbook,Wiley VCH,Weinheim,2009。

本发明的任意取代基不包括在本发明酮还原酶的位置上的氨基酸取代基，这些氨基酸取代基对酮还原酶的催化活性是必不可少的，优选地在SEQ ID NO:2的N120、S148、Y161和K165位置。此外本领域现有技术已知，参与可预测的蛋白质结构元件的序列位置，例如，α螺旋线(helice)或β片层或离子相互作用对诱变敏感，并且可能不需要取代或仅需要在对位伴随取代。

本发明还涉及通过1-70个残基改变、优选1-50个残基改变、更优选1-30个残基改变、甚至更优选1-20个残基改变、最优选1-11个残基改变而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列的工程化酮还原酶，优选地包括在SEQ ID NO:2的一个或多个以下位置的改变：Y21、V23、S33、L39、R40、A43、P68、V89、G95、P97、T98、D103、G109、V119、L121、V124、Y125、I149、L150、S154、E155、T157、A158、T163、H190、Y193、L198、L199、A201、A206、Y207、V229和V247。

优选地，本发明的工程化酮还原酶通过1-70个残基改变、更优选1-50个、仍更优选1-30个、甚至更优选1-20个以及最优选1-11个残基改变而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列，优选地包括一个或多个以下残基改变：

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够还原任意醛底物或能够立体选择性地还原任意酮底物，优选为通式(I)的酮底物；或根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物；或根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物；或根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物；或根据通式(V)的苯甲酰-衍生物；或根据通式(VI)的开环二酮-衍生物；或3-奎宁环酮；或乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯；或乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或根据通式(I`)的醛底物；或2-丁醛；或1-庚醛；优选地与SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶相比展示提高的比活性、温度稳定性和/或立体选择性。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够还原任意醛底物或任意酮底物，优选地为通式(I)的酮底物；或根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物；或根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物；或根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物；或根据通式(V)的苯甲酰-衍生物；或根据通式(VI)的开环二酮-衍生物；或3-奎宁环酮；或乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯；乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或根据通式(I`)的醛底物；或2-丁醛；或1-庚醛；以及通过1-70个氨基酸、优选地1-50个氨基酸、更优选地1-30个氨基酸、甚至更优选地1-20个氨基酸、最优选地1-11个残基改变而不同于SEQ IDNO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列，优选地包括在一个或多个以下位置的改变：Y21、V23、S33、L39、R40、A43、P68、V89、G95、P97、T98、D103、G109、V119、L121、V124、Y125、I149、L150、S154、E155、T157、A158、T163、H190、Y193、L198、L199、A201、A206、Y207、V229和V247。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够还原任意醛底物或能够立体选择性地还原任意酮底物，优选地为通式(I)的酮底物；或根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物；或根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物；或根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物；或根据通式(V)的苯甲酰-衍生物；或根据通式(VI)的开环二酮-衍生物；或3-奎宁环酮；或乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯；乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或根据通式(I`)的醛底物；或2-丁醛；或1-庚醛；以及通过1-70个残基改变、优选地为1-50个、更优选为1-30个、甚至更优选为1-20个以及最优选为1-11个残基改变而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列，优选地包括一个或多个以下残基改变：Y21Q；V23T；S33A；L39V；R40C；A43E或G；P68S；V89F；G95A；E、M、Q、S或V；P97A、E、K、N、V或Y；T98A或G；D103E；G109Y；V119Y；L121Q；V124I；Y125F；I149A、G、L、M、Q、T或V；L150A、F、H或S；S154G；E155A、D、F、G、K、L或S；T157Y；A158G、L、P、Q、S、V或W；T163A或S；H190C；Y193A、F、G、P、T或V；L198M；L199A、F、I或T；A201G；A206G；Y207R或L；V229I以及V247I。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够立体选择性地还原以下底物中的一种：N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺、N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺、叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯、叔丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3氧代-己酸酯、1-(4-氯苯基)乙酮、1-(2-甲氧基苯基)乙酮、苯基-(2-吡啶基)-甲酮、乙基开环二酮、乙基3-氧代-3-苯基-丙酸酯、3-奎宁环酮、乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或根据通式(I`)的醛底物；或2-丁醛；或1-庚醛；以及通过1-70个氨基酸、优选地为1-50个氨基酸、更优选为1-30个氨基酸、甚至更优选为1-20个氨基酸以及最优选为1-11个残基改变而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列，优选地包括在一个或多个以下位置的改变：Y21、V23、S33、L39、R40、A43、P68、V89、G95、P97、T98、D103、G109、V119、L121、V124、Y125、I149、L150、S154、E155、T157、A158、T163、H190、Y193、L198、L199、A201、A206、Y207、V229和V247。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够立体选择性地还原以下底物中的一种：N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺、N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺、叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯、叔丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3氧代-己酸酯、1-(4-氯苯基)乙酮、1-(2-甲氧基苯基)乙酮、苯基-(2-吡啶基)-甲酮、乙基开环二酮、乙基3-氧代-3-苯基-丙酸酯、3-奎宁环酮、乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或根据通式(I`)的醛底物；或2-丁醛；或1-庚醛；以及通过1-70个、优选地为1-50个、更优选为1-30个、甚至更优选为1-20个、以及最优选为1-11个残基改变而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列，优选地包括一个或多个以下残基的改变：Y21Q；V23T；S33A；L39V；R40C；A43E或G；P68S；V89F；G95A、E、M、Q、S或V；P97A、E、K、N、V或Y；T98A或G；D103E；G109Y；V119Y；L121Q；V124I；Y125F；I149A、G、L、M、Q、T或V；L150A、F、H或S；S154G；E155A、D、F、G、K、L或S；T157Y；A158G、L、P、Q、S、V或W；T163A或S；H190C；Y193A、F、G、P、T或V；L198M；L199A、F、I或T；A201G；A206G；Y207R或L；V229I以及V247I。

优选地，与SEQ ID NO:2相比，本发明的不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的工程化酮还原酶，包含氨基酸序列或基本上由具有一种下组氨基酸取代基的氨基酸序列组成：

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够还原任意醛底物或能够立体选择性地还原任意酮底物，优选地为通式(I)的酮底物；或根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物；或根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物；或根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物；或根据通式(V)的苯甲酰-衍生物；或根据通式(VI)的开环二酮-衍生物；或3-奎宁环酮；或乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯；或乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或根据通式(I`)的醛底物；或2-丁醛；或1-庚醛；以及包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够还原任意醛底物或能够立体选择性地还原任意酮底物，优选地为通式(I)的酮底物；或根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物；或根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物；或根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物；或根据通式(V)的苯甲酰-衍生物；或根据通式(VI)的开环二酮-衍生物；或3-奎宁环酮；或乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯；或乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或根据通式(I`)的醛底物；或2-丁醛；或1-庚醛；以及与SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶相比具有提高的比活性、温度稳定性和/或立体选择性，以及包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺立体选择性地还原为优选的(1S)-3-(二甲基氨基)-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:47、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、62、72、85、86、87、88或89，更优选SEQ ID NO:55、58或87，最优选SEQ ID NO:58。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺立体选择性地还原为优选的(1S)-3-(甲基氨基)-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:19、28、40、46、47、49、50、55、56、57、58、59、62、64、67、72、81、82、83、85、86、87、88、89、92或93，更优选SEQ ID NO:58、87或92，最优选SEQ ID NO:87。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯立体选择性地还原为优选的叔丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基-己酸酯，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:34、36、40、49、55、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、81、82、83、84、91、92或93，更优选SEQ ID NO:62、91或92，最优选SEQ ID NO:91。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将叔丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯立体选择性地还原为优选的叔丁基(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基-己酸酯，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:34、36、40、49、53、54、55、60、61、62、64、65、66、67、68、70、72、73、74、75、76、77、78、81、82、83、92或93，更优选SEQ ID NO:62、91或92，最优选SEQ ID NO:91。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将1-(4-氯苯基)乙酮立体选择性地还原为1-(4-氯苯基)乙醇，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:7、9、12、15、17、18、23、24、28、31、36、38、39、47、48、49、50、51、52、53、54、55、58、62、72、81、82、83、87或92，更优选SEQ ID NO:7、15或28，最优选SEQ ID NO:28。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将1-(2-甲氧基苯基)乙酮立体选择性地还原为1-(2-甲氧基苯基)乙醇，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:15、17、22、24、26、36、38、40、58、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、81、82、83、86、92或93，更优选SEQ ID NO:17、72或92，最优选SEQ ID NO:72。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将苯基-(2-吡啶基)-甲酮立体选择性地还原为苯基-(2-吡啶基)-甲醇，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:21、24、28、36、38、39、40、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、81、82、83、85、86、87、88、89、92或93，更优选SEQ ID NO:72、82或92，最优选SEQ ID NO:72。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)立体选择性地还原为优选的乙基开环醇(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14-酮-17-β-醇)，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:61、62、65、66、69、70、71、75、78、82、83、86、92或93，更优选SEQ ID NO:69、70或71，最优选SEQ ID NO:70。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将乙基3-氧代-3-苯基-丙酸酯立体选择性地还原为乙基3-羟基-3-苯基-丙酸酯，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:17、34、36、40、46、47、52、60、61、62、64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、75、76、77、78、81、82、83、84、92或93，更优选SEQ ID NO:46、76或78，最优选SEQ ID NO:76。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将酮底物乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯立体选择性地还原为优选的乙基(3S)-4-氯-3-羟基-丁酸酯，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:63或90。

优选地，本发明的工程化酮还原酶能够将3-奎宁环酮(与1-氮杂二环并[2.2.2]辛-3-酮盐酸盐同义)立体选择性地还原为3-奎宁环醇(与1-氮杂二环并[2.2.2]辛-3-醇同义)，并包含或基本上由以下氨基酸序列中的一种组成：SEQ ID NO:17、21、26、38、40、62、72、73、81、83、86、92或93，更优选SEQ ID NO:17、21或73，最优选SEQ ID NO:17。

优选地，本发明的工程化酮还原酶除了与SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶相比具有提高的比活性、温度稳定性和/或立体选择性之外，还展示高共底物活性和/或共底物稳定性，特别是对于异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇或2-庚醇的高稳定性和/或活性。

优选地，本发明的酮还原酶展示高于非工程化酮还原酶比活性的提高的比活性。优选地，比活性至少高于非工程化酮还原酶的比活性的至少10％、至少50％、至少100％、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少700倍、至少1000倍、至少10,000倍或至少100,000倍。提高的比活性还可以意指工程化酮还原酶确实对所需底物展示了特定活性，而非工程化酮还原酶对所述底物没有显著活性。

优选地，本发明的工程化酮还原酶展示高于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶温度稳定性的温度稳定性。优选地，本发明的酮还原酶展示提高的温度稳定性，其与SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶相比提高1℃-40℃，优选1℃-30℃，更优选1℃-20℃，甚至更优选3℃-15℃，最优选15℃。

优选地，本发明的工程化酮还原酶提供提高的对映异构体过量，其优选地与非工程化酮还原酶相比相对地增加至少0.1％ee、至少0.5％ee、至少1％ee、至少2％ee、至少3％ee、至少5％ee、至少7％ee、至少10％ee、至少20％ee、至少30％ee、至少40％ee、至少50％ee、至少60％ee、至少70％ee、至少80％ee、至少90％ee、至少95％ee、至少97％ee、至少98％ee或至少99％ee。提高的立体选择性还可以意指工程化酮还原酶确实对需要的手性产物具有特定的立体选择性，而非工程化酮还原酶对所述手性产物不具有显著的立体选择性。

优选在标准反应条件下，典型地于30℃下在含有底物、辅因子、选择性增补物和酮还原酶的缓冲水溶液中，测定与SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶相比的工程化酮还原酶的提高的比活性。缓冲液优选地选自含有2mM MgCl₂、pH为7-9的10-200mM Tris/HCl，pH为6-8的10-200mM磷酸钠/NaOH，或pH为7-9的10-200mM三乙醇胺/HCl。优选地加入辅因子NADH至最终浓度范围为0.05-10mM。优选地加入底物至最终浓度范围为5mM-1M，所述底物优选地选自乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯，1-(4-氯-苯基)乙酮，1-(2-甲氧基苯基)乙醇，叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯，N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺，乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)，叔丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯，以及N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺，苯基-(2-吡啶基)-甲酮，乙基3-氧代-3-苯基-丙酸酯，3-奎宁环酮，2-丁醛和1-庚醛。可选的其他增补物优选地选自1-5％Triton^TMX-100(v/v)和0.5-10％DMSO(v/v)。酮还原酶优选地作为粗提取物上清液加入。通过破坏含有酮还原酶的表达宿主来获得粗提取物，随后离心以分离细胞碎片和含有粗提取物上清液的酮还原酶。优选地通过测量产物形成、还原型辅因子NADH的消耗和/或底物消耗来测定比活性。在通过测量产物形成或底物消耗来测定比活性的情况中，辅因子再生体系(异丙醇或GDH/葡萄糖)可应用于标准反应中。在通过测量还原型辅因子NADH的消耗来测定比活性的情况中，不应用辅因子再生体系。在应用辅因子再生体系的情况中，还原型辅因子NADH可用被辅因子再生体系还原的氧化型辅因子NAD⁺替代。

优选地在如上所述的用于测定提高的比活性的标准反应条件下测定与SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶相比的工程化酮还原酶的提高的立体选择性。应用手性分析以分析反应中形成的产物。

优选地通过在PCR循环仪中于给定温度下(优选地在SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶展示10％的残余活性的温度下)孵育含有粗提取物的酮还原酶15分钟来测定与SEQ ID NO:2的非工程化酮还原酶相比的工程化酮还原酶的提高的温度稳定性。然后将粗提取物在冰上孵育30分钟。通过离心分离不溶蛋白质，在标准酮还原酶试验中分析上清液的剩余酮还原酶活性。在该标准试验中，适用于酮还原酶的底物，例如异丙醇，由酮还原酶氧化为例如丙酮，并伴随NAD⁺还原为NADH(因为该标准试验中不存在其他酮还原酶底物，所以异丙醇用作酮还原酶的底物并且不应用于辅因子再生)。通过在标准光度计中测量340nm处的吸收来监测NADH的增加。在标准反应条件下即典型地于30℃下在含有底物(例如异丙醇)、辅因子和酮还原酶的缓冲水溶液中进行试验。酮还原酶优选地作为粗提取物上清液加入。通过破坏含有酮还原酶的表达宿主来获得粗提取物，随后离心以分离细胞碎片和含有粗提取物上清液的酮还原酶。缓冲液优选地选自pH为7-9、含有2mM MgCl₂的10-200mM Tris/HCl，pH为6-8的10-200mM磷酸钠/NaOH，或pH为7-9的10-200mM三乙醇胺/HCl。优选地加入辅因子NAD⁺至最终浓度范围为0.05-10mM。优选地酮还原酶作为粗提取物上清液加入。通过破坏含有酮还原酶的表达宿主来获得粗提取物，随后离心以分离细胞碎片和含有粗提取物上清液的酮还原酶。

在优选的实施方案中，展示提高热稳定性的工程化酮还原酶在至少一个以下位置上通过残基改变而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列：V89、Y125或V229。

在另一个优选的实施方案中，展示提高热稳定性的工程化酮还原酶通过选自位置V89、Y125或V229的一个、两个或三个位置上的氨基酸取代基，以及在不同位置上的至少一个其他氨基酸取代基而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列。

在更优选的实施方案中，展示提高热稳定性的工程化酮还原酶通过一个以下的残基改变而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列：V89F、Y125F或V229I。

在另一个优选的实施方案中，展示提高热稳定性的工程化酮还原酶通过选自位置V89F、Y125F或V229I中的一个、两个或三个位置上存在氨基酸取代基，以及在不同位置上的至少一个其他氨基酸取代基而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列。

在最优选的实施方案中，展示提高热稳定性的工程化酮还原酶通过残基改变V89F而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列。

在另一个最优选的实施方案中，展示提高的热稳定性的工程化酮还原酶通过残基改变V89F和通过不同位置上的至少一个其他氨基酸取代基而不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列。

在另一个优选的实施方案中，在选自位置V89、Y125或V229中的一个、两个或三个位置上，更优选地在选自位置V89F、Y125F和V229I中的一个、两个或三个位置上不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列的本发明的工程化酮还原酶，展示与SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶相比提高1℃-40℃、优选1℃-30℃、更优选1℃-20℃、甚至更优选3℃-15℃以及最优选15℃的温度稳定性。

在另一个实施方案中，在选自位置V89、Y125或V229中的一个、两个或三个位置上以及在不同位置上的至少一个其他氨基酸取代基上，最优选在选自位置V89F、Y125F和V229I中的一个、两个或三个位置上以及在不同位置的至少一个其他氨基酸取代基上不同于SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的氨基酸序列的本发明的工程化酮还原酶，与SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶相比展示提高1℃-40℃、优选1℃-30℃、更优选1℃-20℃、甚至更优选3℃-15℃以及最优选15℃的温度稳定性。

优选地，本发明的酮还原酶包含或由与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93具有至少85％同源性、优选至少86％或至少87％、更优选至少88％或至少89％、仍更优选至少90％或至少91％、仍更优选至少92％或至少93％、甚至更优选至少94％或至少95％、最优选至少96％或至少97％、特别是至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在优选的实施方案中，本发明的酮还原酶是SEQ ID NO:2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93的多肽的变体，包含取代、缺失和/或插入1-36个氨基酸，例如1-6个氨基酸、7-12个氨基酸、13-18个氨基酸、19-24个氨基酸、25-30个氨基酸或31-36个氨基酸。

在优选的实施方案中，本发明的酮还原酶为SEQ ID NO:2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93的多肽的至少220个氨基酸残基，更优选至少225个氨基酸残基，仍更优选至少230个氨基酸残基，仍更优选至少235个氨基酸残基，甚至更优选至少240个氨基酸残基，最优选至少245个氨基酸残基，最优选至少250个氨基酸残基，最优选至少251个氨基酸残基，最优选至少252个氨基酸残基，特别是至少253个氨基酸残基的片段。在这方面，“片段”是指各自SEQ ID NO的连续亚序列，但在N-端和/或C-端缩短。

在优选的实施方案中，本发明的酮还原酶为SEQ ID NO:2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93的氨基酸序列与任意其他的氨基酸、寡肽或多肽的融合蛋白，其融合至N-端和/或C-端。

在优选的实施方案中，本发明的酮还原酶包含SEQ ID NO:2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93的氨基酸序列，以及另外地包含独立地选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val中的至少10个氨基酸残基、更优选地至少20个氨基酸残基、甚至更优选地至少30个氨基酸残基以及最优选地至少40个氨基酸残基。

在一些实施方案中，本发明的酮还原酶能够将醛底物氧化为羧酸，其中醛底物优选地选自脂肪族、芳香族和杂芳香族醛底物。

本发明的另一方面涉及酮底物向仲醇的立体选择性还原，包括使酮底物与适合的辅因子在本发明的酮还原酶的存在下反应的步骤。优选地，所述适合的辅因子为NADH或NADPH。如上限定的关于本发明酮还原酶的所有优选的实施方案也适用于本发明的方法，因此在下文中不再重复。

本发明的另一方面涉及将醛还原为伯醇的方法，包括使醛与适合的辅因子在本发明酮还原酶的存在下反应。优选地，所述适合的辅因子为NADH或NADPH。如上限定的关于本发明酮还原酶的所有优选的实施方案也适用于本发明的方法，因此在下文中不再重复。

优选地，该方法包括通过相应的酮还原酶以高比活性辅助转化用于辅因子再生的共底物，优选地根据其比活性从下组选择这样的共底物：异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇和2-庚醇，最优选地以高比活性将异丙醇转化为丙酮。在本发明方法的优选实施方案中，通过使用NADPH:NADH氧化酶(NOX)，例如来自桑树杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)(Lountos et al.,Acta Cryst.(2004),D60,2044-2047)，以及适合的共底物例如异丙醇再生氧化型辅因子NAD(P)⁺。

本发明的另一方面涉及将仲醇立体选择性地氧化为酮产物的方法，包括使仲醇与适合的辅因子在本发明的酮还原酶的存在下反应的步骤。优选地，所述适合的辅因子为NAD⁺或NADP⁺。如上限定的关于本发明酮还原酶的所有优选的实施方案也适用于本发明的方法，因此在下文中不再重复。

本发明的另一方面涉及将伯醇氧化为醛的方法，包括使伯醇与适合的辅因子在本发明的酮还原酶的存在下反应的步骤。优选地，所述适合的辅因子为NAD⁺或NADP⁺。如上限定的关于本发明酮还原酶的所有优选的实施方案也适用于本发明的方法，因此在下文中不再重复。

优选地，该方法包括通过相应的酮还原酶以高比活性辅助转化用于辅因子再生的共底物，优选地根据其比活性从下组选择这样的共底物：异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇和2-庚醇，最优选地以高比活性将异丙醇转化为丙酮。在本发明方法的优选实施方案中，通过使用NADPH:NADH氧化酶(NOX)，例如来自桑树杆菌(Lountos et al.,Acta Cryst.(2004),D60,2044-2047)，以及适合的共底物例如丙酮再生还原型辅因子NAD(P)H。

优选地，在用于将酮底物立体选择性地还原为仲醇和用于将醛底物还原为伯醇的本发明的方法中，各自的醛底物和酮底物可以为任意醛底物或任意酮底物，优选地为通式(I)的酮底物或通式(I')的醛底物；或根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物；或根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物；或根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物；或根据通式(V)的苯甲酰-衍生物；或根据通式(VI)的开环二酮-衍生物；或3-奎宁环酮；或乙基3-氧代-3-苯基-丙酸酯；或乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或2-丁醛；或1-庚醛。

如上限定的关于本发明的酮底物和醛底物的所有优选的实施方案也适用于本发明的方法，因此在下文中不再重复。

本发明的另一方面涉及将醛底物氧化为羧酸的方法，包括使醛底物与适合的辅因子在本发明的酮还原酶的存在下反应的步骤。优选地，所述适合的辅因子为NAD⁺或NADP⁺。如上限定的关于本发明酮还原酶的所有优选的实施方案也适用于本发明的方法，因此在下文中不再重复。

优选地，醛底物具有通式(VII)

其中Z选自饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族或脂环族C_1-12-烃残基；未取代或单取代或多取代的芳香族C_6-10-烃残基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基与CO-部分桥连；以及未取代或单取代或多取代的杂芳烃残基，任选地通过饱和或不饱和的、未取代的或单取代或多取代的脂肪族C_1-12-烃残基与CO-部分桥连；

其中单取代或多取代指独立地被选自下组中的一种或多种官能团取代：-卤素，-OH，＝O，-OC_1-12-烷基，-OC_6-10-芳基，-O-杂芳基，-OCOC_1-12-烷基，-OCOC_6-10-芳基，-OCO-杂芳基，-SH，-SC_1-12-烷基，-SC_6-10-芳基，-S-杂芳基，-S(＝O)_1-2OH，-NO，-NO₂，-N₃，-NH₂，-NH(C_1-12-烷基)，-N(C_1-12-烷基)₂，-NH(C_6-10-芳基)，-N(C_6-10-芳基)₂，-NH(杂芳基)，-N(杂芳基)₂，-CN，-CHO，-CO₂H，CO-C_1-2-烷基，-CO-C_6-10-芳基和-CO-杂芳基。

优选地，该方法包括通过相应的酮还原酶以高比活性辅助转化用于辅因子再生的共底物，优选地根据其比活性从下组选择这样的共底物：异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇和2-庚醇，最优选地以高比活性将异丙醇转化为丙酮。在本发明方法的优选实施方案中，通过使用NADPH:NADH氧化酶(NOX)，例如来自桑树杆菌(Lountos et al.,Acta Cryst.(2004),D60,2044-2047)，以及适合的共底物例如丙酮再生还原型辅因子NAD(P)H。

因此，本发明还涉及用于以下的方法：

-仲醇的制备，涉及将酮底物优选地立体选择性地还原为所述仲醇；

-伯醇的制备，涉及将醛底物还原为伯所述醇；

-酮产物的制备，涉及将仲醇底物氧化为所述酮产物；

-醛的制备，涉及将伯醇底物氧化为所述醛；和/或

-羧酸的制备，涉及将醛底物氧化为所述羧酸；

其中该方法包括使底物与适合的辅因子在本发明的酮还原酶的存在下反应的步骤。对于由酮还原酶催化的还原反应(酮底物还原为相应的仲醇，醛还原为相应的伯醇)，需要还原形式的适合的辅因子作为电子供体。对于由酮还原酶催化的氧化反应(仲醇氧化为相应的酮，伯醇氧化为相应的醛，醛氧化为相应的羧酸)，需要氧化形式的适合的辅因子作为电子受体。

当底物为手性时，反应可以立体特异性地进行，因此可用于例如，动力学外消旋拆分。

在以制备规模设置过程例如酮的还原时，考虑到选自以下参数的一个或多个参数，可在考虑具体的其他反应条件下进行本发明的方法：可以例如使用用于辅因子再生的异丙醇或葡萄糖/GDH进行制备规模还原。可以在水性环境中、非水性环境中或两相系统中进行本发明的方法。可以在pH值为4-11，和/或5℃-90℃的温度下和/或底物浓度为1-800g/L下进行本发明的方法。可以用游离酶或用固定化酶进行本发明的方法。可以以间歇方法或连续移除产物进行本发明的方法。可以以高底物进料，和/或通过将产物结合(例如通过吸附)至反应容器中的固相，和/或加入水溶性溶剂和/或在高剪切力下进行本发明的方法。

本发明的另一方面涉及用于增加具有可与SEQ ID NO:2匹配的氨基酸序列的酮还原酶的热稳定性的方法，该方法包括在选自对应于SEQ ID NO:2的位置V89、Y125和/或V229的位置中的至少一个氨基酸位置上工程化酮还原酶，优选工程化SEQ ID NO:2的酮还原酶。在这方面，“可匹配”是指可以进行两个序列的有意义的比较和匹配，使得可以鉴定对应于SEQ ID NO:2的位置V89、Y125和/或V229的氨基酸残基。通常，属于SDR家族(蛋白质家族数据库中的蛋白质家族PF00106(Pfam蛋白质家族数据库：M.Punta,P.C.Coggill,R.Y.Eberhardt,J.Mistry,J.Tate,C.Boursnell,N.Pang,K.Forslund,G.Ceric,J.Clements,A.Heger,L.Holm,E.L.L.Sonnhammer,S.R.Eddy,A.Bateman,R.D.Finn Nucleic Acids Research(2012)Database Issue 40:D290-D301),version Pfam 27.0)和/或包含酮还原酶活性(醛和酮分别还原为相应的伯醇和仲醇和/或伯醇和仲醇分别氧化为相应的醛和酮)和/或与SEQ ID NO:2具有至少30％同源性的氨基酸序列可被认为是“可匹配”。优选地，该方法包括在选自对应于SEQ ID NO：2的位置V89、Y125和/或V229的位置中的一个、两个或三个氨基酸位置上工程化酮还原酶，并且进一步工程化这样的氨基酸序列，即通过用任意其他蛋白源氨基酸残基替换各自的氨基酸残基。

优选地，该方法用于通过在选自位置V89、Y125和/或V229的位置中的至少一个位置上工程化酮还原酶来增加任意SEQ ID NO:2的酮还原酶或与SEQ ID NO:2的酮还原酶具有至少72％同源性的任意酮还原酶的热稳定性。优选地，该方法包括在选自对应于位置V89、Y125和/或V229的位置的一个、两个或三个氨基酸位置上工程化酮还原酶，以及进一步工程化这样的氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及制备产物优选为手性产物的方法，其包括：

·根据本发明将酮底物立体选择性地还原为仲醇的方法；

·根据本发明将醛还原为伯醇的方法；

·根据本发明将仲醇立体选择性地氧化为酮产物的方法；

·根据本发明将伯醇氧化为醛的方法；和/或

·根据本发明将醛底物氧化为羧酸的方法。

如上限定的关于本发明各种方法的所有优选实施方案，包括本发明的酮还原酶，本发明的酮底物，本发明的仲醇底物，本发明的醛底物，本发明的伯醇底物，也适用于本发明的方法，因此在下文中不再重复。

本发明的另一方面涉及本发明的酮还原酶在将酮底物立体选择性地还原为仲醇中的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的酮还原酶在将醛还原为伯醇中的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的酮还原酶在将仲醇氧化为酮产物中的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的酮还原酶在将伯醇氧化为醛产物中的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的酮还原酶在将醛氧化为羧酸中的用途。

优选地，在本发明的分别用于将酮底物立体选择性还原为仲醇以及用于将醛底物还原为伯醇的用途中，醛底物和酮底物可以为任意醛底物或任意酮底物，优选为通式(I)的酮底物；或根据通式(II)的3-芳基-3-酮丙胺-衍生物；或根据通式(III)的5-羟基-3-氧代-己酸盐-衍生物；或根据通式(IV)的苯乙酮-衍生物；或根据通式(V)的苯甲酰-衍生物；或根据通式(VI)的开环二酮-衍生物；或3-奎宁环酮；或乙基-3-氧代-3-苯基-丙酸酯；或乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯；或酮糖；或根据通式(I`)的醛底物；或2-丁醛；或1-庚醛。

如上限定的关于本发明的酮底物和醛底物的所有优选实施方案也适用于本发明的方法，因此在下文中不再重复。

以下实施例进一步说明本发明，但不应解释为限制其范围。

实施例1：

检测对应于SEQ ID NO:1的新酮还原酶基因

在来自存在于小叶椴树(Tilia cordada)顶部枯木中的微生物群落的基因组文库中筛选新的酮还原酶时检测新的酮还原酶的基因。分离以96孔形式选择性生长的微生物的DNA，将其机械破碎至所需尺寸范围，并克隆到双启动子表达载体系统pF2F4中(WO2010/075956A1)。将所得质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)placI(+)细胞。用簇筛选(cluster screening)进行文库的筛选(WO2005/040376A2)，簇尺寸为每个平板5,000-350,000个克隆。

对于基因组文库的表达，将细胞在补充有卡那霉素(50mg/l)和氯霉素(34mg/l)的ZYM 505培养基(F.William Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207-234)中培养。通过IPTG(0.1mM)或阿拉伯糖(0.1(v/v))在对数期诱导基因组文库的基因的表达。在30℃下培养16小时。

通过离心(3220×g，20分钟，4℃)收获细胞，并用细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.0；2mM MgCl₂，1×CelLytic B(Sigma)；DNA核酸酶0.02U，溶菌酶0.5mg/ml)破碎细胞。通过离心(3220×g 30分钟，4℃)从细胞碎片分离粗提取物。

通过测量由NAD(P)H的氧化造成的在340nm处的吸光度降低来研究因组文库的粗提取物的还原底物混合物(乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯和1-(4-氯-苯基)乙酮)的能力。

实施例2：

表达对应于SEQ ID NO:1的新酮还原酶基因

将新发现的对应于SEQ ID NO:1的酮还原酶的基因克隆到表达载体pLE1A23(pRSF-1b的衍生物，Novagen)中。此外，该基因还为对大肠杆菌表达进行优化的密码子，同时降低GC含量(参见SEQ ID NO:2)。将该基因克隆到表达载体pLE1A27(pRSF-1b的衍生物，Novagen)中。所得质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

对于对应于SEQ ID NO:1的新酮还原酶基因的表达，将细胞于37℃下在补充有卡那霉素(50mg/l)的ZYM505培养基(F.William Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207-234)中培养。通过IPTG(0.1mM)在对数期诱导基因的表达，并在30℃下进行16-18小时。

通过离心(3220×g，20分钟，4℃)收获细胞，并用细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.0；2mM MgCl₂，1×CelLytic B(Sigma)；DNA核酸酶0.02U，溶菌酶0.5mg/ml)破碎细胞。通过离心(3220×g 30分钟，4℃)从细胞碎片分离粗提取物。

通过使SDS-PAGE变性研究粗提取物的酮还原酶表达水平，通过测量由NAD(P)H的氧化造成的在340nm处的吸光度减少来研究其还原乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯的能力。

实施例3：

通过SEQ ID NO:2的新酮还原酶将乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯制备规模还原为(3S)-4-氯-3-羟基-丁酸酯

在配有磁力搅拌器的250ml圆底烧瓶中，加入24.08g D(+)-葡萄糖一水合物溶于pH为6.5的0.1M磷酸钠缓冲液至最终体积为45ml。用NaOH将溶液的pH调节至pH为6.5-6.6。加入分别溶于pH为6.5的5ml 0.1M磷酸钠缓冲液中的10.7mg SEQ ID NO:2的新酮还原酶、22.9mg葡萄糖脱氢酶(GDH-03，可商购于c-LEcta GmbH)和39.8mg NAD⁺。将烧瓶连接到pH Stat滴定装置，并在搅拌下调整至35℃。通过逐步控制加入18.18g乙基-4-氯-3-氧代-丁酸酯于9.375ml乙酸正丁酯中的溶液来开始反应。在整个反应时间期间，将混合物搅拌并调整至35℃。由pH-stat装置通过添加NaOH来自动控制pH(设定点：pH＝6.5)。通过追踪由pH Stat自动滴定的5M NaOH的量来控制反应进程。22小时后，反应完成，得到通过GC分析法分析的总转化率≥99.9％。显示还原产物对于乙基(3S)-4-氯-3-羟基-丁酸酯具有≥99的对映异构体过量。

实施例4：

评价酮还原酶变体的热稳定性

分析了已产生的几种酮还原酶变体的热稳定性。通过在PCR循环仪中于不同温度下孵育含有粗提取物的酮还原酶15分钟来记录解链曲线图。然后将粗提取物在冰上孵育30分钟。通过离心分离不溶性蛋白质，并在标准酮还原酶试验中分析上清液的剩余酮还原酶活性。在该标准试验中，通过酮还原酶将异丙醇氧化为丙酮，伴随着NAD⁺还原为NADH。通过在标准光度计中测量340nm处的吸光度来监测酮还原酶的增加。

发现，对应于SEQ ID NO:4的酮还原酶展示的解链温度(Tm)比SEQ ID NO:2的野生型酮还原酶的Tm高15℃。

实施例5：

通过来自SEQ ID NO:2的酮还原酶的工程化酮还原酶还原叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯

分析了已产生的大量工程化酮还原酶将底物叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯还原为叔丁基(5R)-6-氰基-3,5-二羟基-己酸酯的能力。在96孔板规模中进行筛选试验，每个孔中pH为6.5的0.1M磷酸钠缓冲液、最终浓度为0.1M的纯叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯、1mM辅因子NAD⁺的最终体积为150μl。通过向每个孔中加入在pH为7.0的0.05M Tris-HCl缓冲液中稀释1-300倍的10μl粗提取物、2mM MgCl₂开始反应。通过30℃下在酶标仪中测量340nm处吸光度的减少来测定酮还原酶变体的活性。发现对应于SEQ ID NO:91的酮还原酶变体以比SEQ ID NO:2的酮还原酶高55倍的速率还原底物叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯。

实施例6：

通过来自SEQ ID NO:2的酮还原酶的工程化酮还原酶制备规模还原叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯

在玻璃烧杯中称量4.3g粗制叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯(纯度～70％)(相当于3g纯的叔丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代-己酸酯)。加入3.7g D(+)-葡萄糖一水合物于水的溶液(最终体积6.8ml)、1.5ml的pH为6.5的1M磷酸钠缓冲液和10mg溶解于水的NAD⁺的溶液。用NaOH将溶液的pH调节为6.5-6.6。将反应混合物连接到pH Stat滴定装置，并在搅拌下调整至30℃。通过加入对应于SEQ ID NO:91的工程化酮还原酶(21mg)和葡糖脱氢酶(GDH-03，10mg)于水中的溶液以开始反应。在整个反应时间期间，将混合物搅拌并调整至30℃。由pH-stat装置通过添加NaOH来自动控制pH(设定点：pH＝6.5)。通过追踪由pH Stat自动滴定的5M NaOH的量来控制反应进程。12小时后，反应完成，得到通过HPLC分析法(在212nm和200nm处检测，通过底物和产物的校正曲线量化)分析的总转化率≥95％。由手性HPLC测量显示，还原产物对顺式产物(syn product)(叔丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基-己酸酯)比相应的反式产物(anti product)(叔丁基(3S,5R)-6-氰基-3,5-二羟基-己酸酯)具有≥99的非对映异构体过量。

实施例7：

通过来自ADH97的工程化酮还原酶还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺

分析了已产生的大量工程化酮还原酶将底物N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺还原为N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺的能力。在96孔板规模中进行筛选测定，每个孔中pH为9.0的0.1M三乙醇胺/HCl缓冲液、50异丙醇(v/v)和最终浓度为0.5M的N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺和1mM辅因子NAD⁺的最终体积为300μl。通过向每个孔中加入在0.1M三乙醇胺-HCl缓冲液中稀释1-10倍的10μl粗提取物开始反应。在30℃下孵育反应20小时。通过底物和产物的HPLC分析(230nm/245nm下检测，通过底物和产物的校正曲线测定转化率)测定酮还原酶变体的活性。发现对应于SEQ ID NO:58的酮还原酶变体能够还原底物N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺。反应20小时后，得到23％的转化率。SEQ ID NO:2的酮还原酶在给定条件下不显示转化率。

实施例8：

通过来自SEQ ID NO:2的工程化酮还原酶制备规模还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺

将25％NaOH(110ml)、异丙醇(41.5ml)和N,N-二甲基-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺盐酸盐(60g)加入配有磁力搅拌器的500ml圆底烧瓶中。在室温下搅拌所得浆料直至完全溶解并发生相分离。在玻璃烧杯中将水(40ml)加入27.3ml的上层中。通过加入浓硫酸将溶液的pH调节至9.0。向混合物中加入37.5ml异丙醇，随后在250ml圆底烧瓶中与66.5mg NAD⁺混合。将烧瓶瓶颈连接至旋转蒸发仪，通过在预热(40℃)油浴中旋转烧瓶使溶液调整至40℃。将溶解于22.5ml水的对应于SEQ ID NO:58的工程化酮还原酶(1.35g)的溶液加入以开始反应。在整个反应时间期间，将混合物旋转并在油浴中调整至40℃，应用真空(110mbar，82.5mm Hg)以主要去除丙酮和异丙醇。周期性地每半小时向反应混合物中加入预热(40℃)的异丙醇和水的混合物(80:20)。每小时取样以控制反应进程，并通过HPLC进行分析(在230nm/245nm处检测，通过底物和产物的校准曲线测定转化率)。8小时后，反应完成，总转化率≥98％。显示还原产物具有有利于对映异构体(1S)-3-(二甲基氨基)-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇的≥99.5的对映异构体过量。

实施例9：

通过来自SEQ ID NO:2的工程化酮还原酶还原乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)

分析了已产生的大量工程化酮还原酶还原底物乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)的能力。在96孔板规模中进行筛选测定，每个孔中pH为7.0的0.1M三乙醇胺/HCl缓冲液、2mM MgCl₂、50％异丙醇(v/v)、1％TritonTMX-100(v/v)、3％DMSO(v/v)、最终浓度为10g/l的乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)和1mM辅因子NAD⁺的最终体积为500μl。通过向每个孔中加入稀释1-10倍的10μl粗提取物开始反应。在30℃下孵育反应4小时，同时搅拌。通过HPLC分析(265nm下检测；通过底物和产物的校正曲线测定转化率)测定酮还原酶变体的活性。发现对应于SEQ ID NO:70的酮还原酶变体能够还原底物乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)，转化率为94％，在给定条件下17-β-开环醇(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14-酮-17-β-醇)的立体异构体过量≥99.5％。SEQ ID NO:2的酮还原酶在给定条件下不显示转化率。

对应于SEQ ID NO:70的工程化酮还原酶也可以用于在与该实施例所述的相似条件下制备规模还原乙基开环二酮(乙基-3-甲氧基-8,14-开环-甾烷-1,3,5(10),9(11)-四烯-14,17-二酮)，其中应用底物进料。

实施例10：

通过来自SEQ ID NO:2的工程化酮还原酶还原叔丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代丁酸酯

分析了已产生的大量工程化酮还原酶将底物(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯还原为叔丁基(5S)-6-氯-3,5-二羟基-己酸酯的能力。在96孔板规模中进行筛选测定，每个孔中pH为6.5的0.1M磷酸钠缓冲液和最终浓度为25mM的纯化叔丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯和1mM辅因子NAD⁺的最终体积为150μl。通过向每个孔中加入在pH为7.0的0.05M Tris-HCl缓冲液、2mM MgCl₂中稀释几次的10μl粗提取物开始反应。通过30℃下在酶标仪中测量340nm处吸光度的减少来测定酮还原酶变体的活性。发现对应于SEQ ID NO:62和91的酮还原酶变体以比SEQ ID NO:2的酮还原酶高3倍的速率还原底物(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯。

对应于SEQ ID NO:62和91的工程化酮还原酶还可以用于在与实施例6所述条件相当的条件下将(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯制备规模还原为叔丁基(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基-己酸酯。

实施例11：

通过来自SEQ ID NO:2的工程化酮还原酶还原N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺

分析了已产生的大量工程化酮还原酶将底物N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺还原为N-单甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺的能力。在96孔板规模中进行筛选测定，每个孔中pH为7.0的0.1M三乙醇胺/HCl缓冲液、10异丙醇(v/v)、最终浓度为0.1M的N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺和1mM辅因子NAD⁺的最终体积为200μl。通过向每个孔中加入10μl粗提取物开始反应。在30℃下孵育反应4小时和24小时。通过HPLC分析(230nm/245nm下检测；通过底物和产物的校正曲线测定转化率)测定酮还原酶变体的活性。发现对应于SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:87的酮还原酶变体能够最好地还原底物N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺。4小时和24小时后分别获得40-43％和87-89％的转化率。SEQ ID NO:2的酮还原酶在给定条件下不显示转化率。

对应于SEQ ID NO:58和87的酮还原酶变体还可以用于在与实施例6或实施例8所述条件相当的条件下将N-单甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺制备规模还原为(1S)-3-(甲基氨基)-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇。

序列表

<110> C-乐克塔股份有限公司

<120> 酮还原酶

<130> KHP16213046.3

<150> EP 14165444.2

<151> 2014-04-22

<160> 93

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 765

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 从文库分离

<400> 1

atggctacac aattcgacgg taagaccgct ctcatcaccg gaggggcttc cggcatcggc 60

tatgccgtcg ccctcgagct cgccgcggag ggtgccagcg tcgtcgtgca ggacctgcgc 120

ctcgaagcag cacagcaggt ggcagatgag atcaccgccg ccggcggcac ggcgatcgcc 180

gtagccggcg acgtcggcaa gccggaagac gtcaaagccg ccgtcgacgc cgccgtggcc 240

gcctatggcg ccctgcacct tgccgtcaac aacgccggca tcggcggccc caccgggctc 300

atcggcgact acgacgactc cgatggcttc gccgcctacc gcaagctcat cgatgtgaac 360

cttaactccg tctactacgg cctgcgctat gagatccctg ccatcatcag cgcgggcggc 420

ggttccattg tgaacacctc gtccatcctc gggctggtat ccgagccgac cgccgccccg 480

tacacgacgg ccaagcacgg tgttgccggt ctgaccaagg ccgctgccgc gggctacgcg 540

tcccagggtg tccgcatcaa ctccgtccac cccggataca tcgacacccc cctgctcgcc 600

gcgatgccca aagaggccta cgacgccctc gtgtccaagc acccgatcgg ccgcctgggt 660

accgcggaag aagtcgccca cctcgtgact ttcctcctca gtgataaggc cagcttcatc 720

accggctcgc aacacgtcgt tgacggcgga tacgtcgcgg tctag 765

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 从文库分离

<400> 2

Met Ala Thr Gln Phe Asp Gly Lys Thr Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ala

1 5 10 15

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20 25 30

Ser Val Val Val Gln Asp Leu Arg Leu Glu Ala Ala Gln Gln Val Ala

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Asp Glu Ile Thr Ala Ala Gly Gly Thr Ala Ile Ala Val Ala Gly Asp

50 55 60

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85 90 95

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210 215 220

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245 250

<210> 3

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的人工合成序列

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gttgccggtg atgttggtaa accggaagat gttaaagcag cagttgatgc agccgttgca 240

gcatatggtg cactgcatct ggcagttaat aatgcaggta ttggtggtcc gaccggtctg 300

attggtgatt atgatgatag tgatggtttt gcagcctatc gcaaactgat tgatgttaat 360

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<210> 4

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 4

Met Ala Thr Gln Phe Asp Gly Lys Thr Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ala

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 6

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<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 9

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<223> 从文库分离

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<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 11

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<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

<400> 22

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 23

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 24

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<223> 从文库分离

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 26

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<223> 从文库分离

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<220>

<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

<400> 34

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<223> 从文库分离

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<210> 36

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 36

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<211> 254

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 37

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<210> 38

<211> 254

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 38

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 39

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<211> 254

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 40

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<210> 41

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<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 41

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<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 42

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 43

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<220>

<223> 从文库分离

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<220>

<223> 从文库分离

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 46

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<220>

<223> 从文库分离

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<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 48

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<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 49

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245 250

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<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 50

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245 250

<210> 51

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 51

Met Ala Thr Gln Phe Asp Gly Lys Thr Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ala

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245 250

<210> 52

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 52

Met Ala Thr Gln Phe Asp Gly Lys Thr Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ala

1 5 10 15

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245 250

<210> 53

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 53

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245 250

<210> 54

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 54

Met Ala Thr Gln Phe Asp Gly Lys Thr Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ala

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<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

<400> 63

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<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

<400> 65

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 66

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 67

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<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

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<223> 从文库分离

<400> 77

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<223> 从文库分离

<400> 78

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<223> 从文库分离

<400> 79

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 80

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<210> 81

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 81

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<220>

<223> 从文库分离

<400> 82

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<210> 83

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 从文库分离

<400> 83

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