丙酸杆菌和酵母的共同培养的制作方法

本发明涉及生物过程技术(bioprocess technology)领域，特别地涉及使用酵母和丙酸杆菌(propionibacterium)(即，丙酸杆菌属(Propionibacterium sp.))的共同培养的生物过程领域。

背景技术：

具有高有机化学需氧量(chemical oxygen demand)(COD)的废弃流股是生态负担，因此需要被处理掉。这些废弃流股可以是不同行业如乳制品、水果和蔬菜或糖加工行业的副产物。一个实例是作为由干酪制造得到的副产物通过乳制品行业产生的乳清。该过程产生大体积量(high volume)的乳清(甜的(sweet)或酸的(sour))，其具有高COD且另一方面由于低相对低含量的可用的固体含量(例如乳蛋白和乳糖)而不能容易地/经济地利用它。

根据干酷制造的过程，残留乳清的COD值可以在35000mg O₂/L至100000mg O₂/L的范围内。高有机负荷的主要贡献者是乳糖，其可以代表最高达90％的COD值。在酸乳清的情况下，乳酸的存在甚至加重该问题。乳糖也代表约75％的乳清干物质并因此可以通过利用微生物的过程使用它。已经研究了多种乳清溶液的利用，如生物乙醇和沼气(biogas)生产、乳糖或蛋白质的提取、有机酸或生物质的生产，但是仍需要利用乳清的经济方式。

WO 2011/140649描述了通过乳酸菌和酵母的混合培养用于生产可食用的生物质的乳清的利用。该过程可以成功降低乳清的COD负荷，但是最终产物具有较小的商业价值。

乳清可以用于培养来自丙酸杆菌属的细菌，其属于放线菌目(Actinomycetales)(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(1986第一版)。已知丙酸杆菌属是有价值的产物如有机酸(丙酸和乙酸)、维生素B12和双歧杆菌化合物(bifidogenic compound)的生产者。虽然可以成功地在乳清上培养丙酸杆菌属，但是它们不能令人满意地降低COD负荷，因为它们产生在发酵的(消耗的)乳清中积累并显著增加最终的COD负荷的有机酸。在下面，互换地使用术语“丙酸杆菌属(Propionibacterium sp.)”和“丙酸杆菌(propionibacterium)”。

已知丙酸杆菌属和其他细菌的共同培养能够降低消耗的介质的COD负荷(Miyano等人，2000)，但是这种过程具有不是食品级并因此不能用于食品加工厂的缺点。

已知由丙酸杆菌属产生的代谢物抑制其他微生物(尤其是真菌)的生长，且它们在食品腐败变质预防中的用途是广为人知的。US 5,260,061描述了应用丙酸杆菌属代谢物用于食品应用来抑制酵母的生长。WO 2008/030089描述了丙酸杆菌属与酵母的共同培养，以在干酪制造过程中得到良好的香味/香气特征。在这种情况下，将丙酸杆菌属用于控制和最后抑制混合培养物中的酵母的生长，因为施加的酵母细胞不耐来自丙酸杆菌属的生长抑制物质。

鉴于以上陈述的现有技术，本发明的一个目的是提供由甜的或酸的乳清生产有价值的生物技术产物的新型生物过程，其中，最终消耗的发酵介质表现出相对低的COD。本发明的另一个目的是提供可用于本发明的过程的真菌细胞。

技术实现要素：

本发明通过提供能够在与丙酸杆菌共同培养中生长的新型真菌细胞，优选地酵母细胞，满足了以上陈述的目的。通过它们在丙酸杆菌培养之后得到的静止阶段(stationary-phase)上清液(消耗的介质(spent medium))上的生长能力可以表征/定义这种真菌细胞或细胞。本发明还涉及使用这种可以在与丙酸杆菌的共同培养中在所述介质的存在下生长的真菌细胞的生物技术过程。

因此，本发明的第一方面涉及能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长的真菌细胞。

通过本专利申请中所描述的诱变/选择步骤可以再现地得到这种真菌细胞。根据本发明，具有在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长能力的真菌细胞，特别是酵母细胞，可用于降低来自发酵过程的废弃材料的COD负荷。到现在为止本领域的技术人员不能获得这种真菌细胞(特别是这种酵母细胞)。

通过本文以下公开的步骤可以容易地识别本发明的真菌细胞并将其与其他真菌细胞相区别。特别地，根据本发明，公开了其中的丙酸杆菌的良好限定的培养介质和良好限定的培养条件，用于测试真菌细胞“在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长”的能力。

因此，在一个优选的实施方式中，由在缺氧条件下在由60g/L甜乳清粉(sweet whey powder)、5g/L的酵母提取物、和40mg/L的钙D-泛酸酯组成的介质中在35℃和pH 6.5的培养的费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)的静止培养物得到静止阶段上清液(用于测试真菌细胞是否是根据本发明的一种)。优选地，甜乳清粉具有食品级质量，并且优选地其包含至少63％wt.的乳糖、至少10％wt.的蛋白质和至多5％wt.的水。

可以将在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长的能力、真菌(酵母)培养物的培养定义为当在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长时真菌细胞实现的最大生长速率。因此，在另一个优选的实施方式中，将所述真菌细胞在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中的所述生长能力定义为在至少0.02h^-1的最大生长速率(μ_max)下所述真菌细胞在所述静止阶段上清液上生长的能力。确定微生物在培养物中的生长速率的方法在本领域中是众所周知的。

当培养物没有暴露于通风(aeration)时，可以通过经过一段时间在培养介质中的乙酸和丙酸的恒定浓度来指出丙酸杆菌培养物的静止培养状态。在另一个实施方式中，通过经过一段时间的丙酸杆菌的恒定细胞密度(以g(DW)/L计))来指出丙酸杆菌培养物的静止状态。

在一个优选的实施方式中，在本文以下的实施例2描述的测试方法中测试真菌细胞在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长的能力。

优选的真菌细胞是酵母细胞。

在一个实施方式中，酵母细胞是在2014年1月20日在登录号DSM28271下保藏在DSMZ-德国微生物保藏中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)下的酵母细胞。

本发明的第二方面涉及用于生产生物技术产物的方法，所述方法包括在培养介质中共同培养丙酸杆菌和真菌细胞。真菌细胞优选地能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长。

如上文和以下所描述的，真菌细胞优选地是酵母细胞如根据本发明的真菌细胞。

生物技术产物优选地是通过丙酸杆菌产生的物质。

优选的生物技术产物是维生素B12。

在一个优选的实施方式中，该方法包括没有通风的第一阶段，随后是通风出现的第二阶段。优选地，两个阶段是至少24小时、或48小时、或72小时长。

在一个优选的实施方式中，丙酸杆菌的生长的至少90％[以％克干重计]出现在没有通风的所述第一阶段期间。

在另一个优选的实施方式中，真菌细胞的生长的至少90％[以％克干重计]出现在其中出现通风的所述第二阶段期间。

在另一个优选的实施方式中，将培养介质的化学需氧量(COD)降低至培养介质的初始COD的等于或小于25％、优选地等于或小于10％、或等于或小于1％的水平。

在另一个优选的实施方式中，培养介质是(或包含)乳清。培养介质是或包含例如甜乳清或酸乳清。

优选地，在本发明的方法中，在所述丙酸杆菌达到在培养物中其最大细胞密度[g(DW)/L]的至少90％的时间点或之后添加所述真菌细胞。在本发明的方法的其他实施方式中，在丙酸杆菌达到其静止生长阶段时或之后添加真菌细胞。

本发明进一步涉及制造耐受丙酸杆菌的真菌菌株如耐受丙酸杆菌的酵母菌株的方法。该方法包括：

1.得到起始真菌菌株。

2.将起始真菌菌株暴露于诱变剂和/或诱变条件。

3.在第一浓度的乙酸和/或(优选“和”)丙酸的存在下培养步骤2的暴露的真菌菌株。

4.可选地将步骤3的所述培养的真菌菌株暴露于诱变剂和/或诱变条件以及在第二浓度的乙酸和/或(优选“和”)丙酸的存在下培养所述可选地暴露的真菌菌株，其中，所述第二浓度优选地分别高于所述第一浓度。

5.将步骤3或4的培养的真菌菌株暴露于诱变剂和/或诱变条件。

6.在包含丙酸杆菌培养的静止阶段上清液的介质中培养步骤6的暴露的真菌菌株。

7.可选地通过升高丙酸杆菌培养的静止阶段上清液的浓度重复步骤7。

8.从而得到能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长的真菌细胞。

根据本发明的优选的诱变剂是甲磺酸乙酯。然而可以使用增加突变发生频率的任何其他的诱变剂，即化学的或物理的。可以用于以上方法的已知诱变剂包括：活性氧物质(reactive oxygen species)(ROS)如过氧化物、羟基基团和过氧化氢；脱氨基试剂，例如亚硝酸；多环芳族烃(PAH)；烷基化剂如乙基亚硝基脲或甲磺酸甲酯；鸟嘌呤；亚硝胺；亚硝基胍；芥子气；氯乙烯；芳香族胺；酰胺；2-乙酰氨基芴；来自植物的生物碱；如来自长春花(vinca)物种的那些；溴；在它们的化学结构中包含溴的化合物；叠氮化钠；苯。合适的诱变条件或物理诱变原(mutagen)是例如UV辐射、暴露于X射线、和/或暴露于放射。

技术人员将了解可以省去以上的步骤2至4，例如如果步骤1中的起始菌株已经充分耐受乙酸和/或丙酸，或另外能够在包含丙酸杆菌培养的静止阶段上清液的介质中生长。在这种情况下，将步骤1的起始菌株直接暴露于步骤5中的诱变剂和/或条件。

本发明的进一步方面涉及通过以上方法得到的真菌菌株。

附图说明

图1示出了通过丙酸杆菌属的乳糖利用以及在乳清上在两阶段过程中乙酸和丙酸和维生素B12的生产。以这种方式，可以将COD值从85000mg O₂/L降低到36000mg O₂/L。在没有通风的情况下进行发酵最高达到75小时，以及在75小时之后，引入通风。

图2示出了通过丙酸杆菌属的乳糖利用以及在乳清上在两阶段过程中的乙酸和丙酸和维生素B12的生产，其中，在引入氧气的阶段添加耐受的DSM 28271酵母培养物。以这种方式，可以将COD值从85000mg O₂/L降低到13000mg O₂/L。在没有通风的情况下进行发酵最高达到75小时，以及在75小时之后，引入酵母和通风。

图3示出了根据本发明用于共同培养丙酸杆菌属与耐受的酵母的生物过程的示意图。

图4示出了通过丙酸杆菌属的乳糖利用以及在乳清上在两阶段过程中乙酸和丙酸和维生素B12的生产，其中，在引入氧气的阶段添加耐受的乳酸克鲁维酵母(K.lactis)ABLMKL6酵母培养物。以这种方式，可以将COD值从80000mg O₂/L降低到14500mg O₂/L。在没有通风的情况下进行发酵最高达到112小时，以及在112小时之后，引入酵母和通风。

具体实施方式

在本发明的上下文中的表达“上清液”或“培养物上清液”是指当过滤或离心发酵肉汤从而除去细胞和其他不溶性物质时得到的液体。上清液包含没有(还没有)被微生物消耗的培养介质中的任何营养物和其他组分或降解产物、以及在发酵期间由微生物产生的任何产物。

应将“培养物介质”理解为是微生物可以在其中生长的含营养物的介质。液体培养物介质是优选的。

应将“肉汤”或“发酵肉汤”理解为是指微生物在其中生长或已经生长的培养物介质。肉汤可以包含未使用的营养物和/或由微生物产生的产物。

应将根据本发明的“静止阶段上清液”或“消耗的介质”理解为是来自静止阶段发酵肉汤的上清液。

应将静止阶段理解为是其中微生物基本上已经停止生长，例如微生物已经达到培养期间其最大细胞密度的培养阶段。通过监测发酵产物的浓度也可以检测培养的静止阶段。在一个实施方式中，将丙酸杆菌培养的静止阶段定义为从乙酸和/或丙酸的浓度已经达到其最大值或可替换地已经达到其最大值的90％的时间点开始的阶段。

“乳清”是乳制品行业的副产物，当添加或原位形成粗制凝乳酶(rennet)或酸性物质时，其分离自凝固之后的奶制品。“甜乳清”制造于制备硬质干酪如切德(cheddar)干酪或瑞士干酪的粗制凝乳酶类型期间。“酸性乳清(acid whey)”或“酸乳清(sour whey)”是在制备酸类型乳制品如松软干酪(cottage cheese)或菌株酸奶(strained yogurt)期间产生的副产物。

应将“化学需氧量”或“COD”理解为是通过ISO 6060:1989标准方法确定的化学需氧量。应当理解的是，根据该方法，如果待确定的COD在允许的700mg/L的最大COD以上，则可能需要用水稀释样品。然后由确定的COD乘以稀释因数计算COD。

本发明提供了耐受与丙酸杆菌共同培养的真菌细胞。本发明还提供了共同培养丙酸杆菌和真菌细胞的方法，该细胞耐受由丙酸杆菌产生的抑制性化合物。

本发明提供了真菌细胞，其能够在丙酸杆菌和它们的抑制性代谢物的存在下生长。通过在之前已经培养了丙酸杆菌的生长基板上通常可获得的真菌细胞的天然存在的随机突变体的选择流程得到这些细胞。优选地，以至少两步进行这种耐受的真菌细胞的选择。在第一步骤中，选择可以耐受较高浓度的有机酸例如乙酸和丙酸的真菌细胞的随机突变体。在第二步骤中，使这些耐酸细胞的随机突变体在之前已经培养了丙酸杆菌且达到生长静止阶段的使用的生长介质上经受另外轮的选择。优选地，本发明提供的真菌细胞是酵母细胞。

通过经典的选择方法，可能性地通过随机诱变、通过基因工程或通过筛选天然的分离体支持，可以得到耐受与丙酸杆菌共同培养，例如能够在丙酸杆菌培养物的静止阶段上清液中生长的本发明的真菌细胞。

在与丙酸杆菌共同培养的过程中使用耐受的酵母细胞的本发明的生物技术过程可以包括以下步骤：

1.制备培养介质

2.接种丙酸杆菌。

3.在没有通风的情况下发酵

4.转换至需氧条件

5.接种耐受的酵母细胞

6.作为丙酸杆菌和酵母的共同培养继续发酵

7.可选地下游处理并回收产物

发酵介质

发酵介质可以是丙酸杆菌和真菌细胞两者在其中可以生长的任何合适的发酵介质。例如，发酵介质可以包含糖蜜(molasses)或乳清。发酵介质可以由来自不同行业的废弃流股(如乳清)组成，向其中可以添加特定的添加剂(如矿物质、维生素、氮和另外的碳源、前体等)以提高生长速率或形成期望的产物。介质可以包含适用于丙酸杆菌的不同的碳源如葡萄糖、乳糖、果糖、乳酸和氮源如硫酸铵、氨基酸、肽和蛋白质。可以在过程开始调节或可以在发酵过程期间保持发酵介质的pH值以允许丙酸杆菌的良好的生长和/或产物形成。

在接种丙酸杆菌之前，正常通过失活初始存在于发酵介质中的足够比例的微生物的过程处理介质。这些过程可以是杀菌/巴氏杀菌，例如高压灭菌(autoclaving)、过滤、辐射和/或化学处理。

应通过能够除去足够比例的初始存在的微生物以及然后用发酵介质填充的方法制备培养容器或发酵罐。用于本发明的过程的培养容器可以非常简单，只要它可以保持期望的温度，并可以保持适当的搅拌以防止大的pH或营养物梯度。其可以理想地保留轻微的过压。

接种丙酸杆菌

含丙酸杆菌的接种物可以由一个或多个阶段组成，这取决于最终的种菌培养物(seed culture)体积和使用的过程。在支持丙酸杆菌生长的介质中可以制备接种物。在优选的温度下培养接种物期望的时间，这之后可以将其用于接种发酵介质。用于接种物的随后阶段或发酵阶段的接种体积可以在1至20％的范围内。

在没有通风的情况下发酵

首先将发酵肉汤保持在没有通风的期望的温度下，用于最佳生长或产物形成。该温度可以在25℃至40℃的范围内，优选35℃。如果糖存在于发酵介质中，那么应当将pH值保持在期望的水平，其可以在5.5至8.0的范围内，优选是6.5。通过多种不同的酸/碱如H₂SO₄、HCl、NaOH、NH₄OH等可以保持pH。可以在没有通风的情况下进行生物过程或可以将生物过程保持在CO₂和/或N₂喷射和/或过压下。在CO₂过压下的培养是有利的。

应当充分搅拌发酵介质以防止大的pH梯度并可以但不限于通过Rushton涡轮机、船用推进器(marine propeller)或内部和/或外部再循环泵执行。

转换到需氧条件

由丙酸杆菌耗尽可消耗的营养物之后，可以将培养物转换到需氧条件。可以将空气引入到培养容器中且其对于以下描述的酵母的生长应是足够的。通风速率还影响酵母代谢丙酸杆菌产生的有机酸的速率。

这时可以引入影响肉汤的性质(即消泡(antifoam))，影响丙酸杆菌产生的产物的形成(即5,6-二甲基苯并咪唑)或影响酵母的生长或产物形成(氮源、前体等)的另外补充物。

在已经将培养物转换到需氧条件之后，应将pH再次保持在期望的水平。pH值可以在5.5至8的范围内，优选地是6.5以使酵母能够良好生长。

接种耐受丙酸杆菌的酵母细胞

耐受的酵母细胞的接种物可以由一个或多个阶段组成，这取决于最终的种菌培养物的体积。在支持酵母生长的介质中制备酵母接种物。在优选的温度下培养接种物期望的时间。然后在已经将其转换到需氧条件之后，可以将酵母接种物用于接种含有培养的丙酸杆菌的发酵介质。用于接种物的随后阶段或最终阶段的接种体积可以在但不限于1至20％的范围内。优选地，酵母接种物代表了最终体积的5％。

通过得到的微生物的共同培养物继续发酵

将发酵肉汤保持在期望的温度下并通过添加适当的酸或碱将pH值恒定保持在期望的水平。应当将搅拌和通风保持在要求的水平以确保完全利用有机酸。通风和/或混合的量影响酵母代谢有机酸。

也可以在这时引入影响肉汤的性质(即消泡)、影响丙酸杆菌产生的产物的形成或影响酵母的生长或产物形成的另外的补充物。监测发酵肉汤的上清液的COD值和由丙酸杆菌或酵母细胞产生的有价值的产物的产率，以实现期望的肉汤的性质。使用这种共同培养流程，可以将肉汤的上清液的COD值降低至小于20000mg O₂/L、优选地小于15000mg O₂/L、更优选地小于10000mg O₂/L以及更加优选地小于5000mg O₂/L。如果选择的高价值产物是维生素B12，那么维生素B12的产率可以大于5mg/L、优选地大于10mg/L、更优选地大于20mg/L以及更加优选地大于100mg/L。

发酵肉汤的下游处理

有机酸被消耗且上清液的COD达到令人满意的水平之后，停止生物过程。通过离心、过滤或任何其他合适的方法可以从上清液分离混合的丙酸杆菌/酵母生物质连同肉汤的不可溶的组分。如果处理到水处理厂，则上清液具有低COD并存在小负担，或在理想的情况下，COD足够低使得可以直接将其处理(dispose)到环境中。如果生物质富含有价值的物质如维生素和蛋白质，特别是维生素B₁₂，那么可以将这些物质用作动物饲料的添加剂。可替换地，可以将生物质用作用于分离有价值的物质如任何形式的维生素B₁₂(例如氰钴胺素或甲基钴胺素)的原材料。根据纯度等级，可以将维生素B₁₂用作动物饲料的添加剂或用作用于人类消耗的药物或食物补充物。

根据本发明的酵母可以是克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)；马克斯克鲁维酵母(K.marxianus))，优先地是乳酸克鲁维酵母，和/或亚罗酵母属(Yarrowia)，优选解脂亚罗酵母(Y.lipolytica)。然而，菌株也可以是德巴利酵母属(Debaryomyces)(例如汉氏德巴利酵母(Debaryomyces hansenii))、假丝酵母属(Candida)(例如皱状假丝酵母(Candida versatilis)、隐球酵母属(Cryptococcus)、蔷薇色酵母属(Rhodotorula)、毕赤氏酵母属(Pichia)、毛孢子菌属(Trichosporon)(例如白吉利毛孢子菌(Trichosporon beigelii))、有孢圆酵母属(Torulaspora)、伊萨酵母属(Issatchenkia)(例如东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis))、地丝菌属(Geotrichum)、酵母属(Saccharomyces)或接合酵母属(Zygosaccharomyces)。这种细胞是在本领域可获得的且可以由保藏机构得到或可以从食品中分离它们。

实施例

实施例1-耐受丙酸杆菌的酵母细胞的制备

在由酵母提取物(20g/L)、蛋白胨(20g/L)和右旋糖(10g/L)组成的YEPD介质中在35℃下培养酵母产朊假丝酵母(Candida utilis)NRRLY-7586持续72小时，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7)洗涤两次并将其暴露于适当剂量的诱变剂(甲磺酸乙酯)以得到99.9％的杀死率。可以使用任何其他合适的真菌细胞或酵母细胞。在包含酵母提取物(10g/L)和最小抑制浓度的乙酸和丙酸的介质中培养存活细胞。在35℃下培养三天之后，将来自该肉汤的等分部分(aliquot)转移到YEPD介质中，使其生长72小时并经受另一轮诱变。然后在包含酵母提取物(10g/L)和升高浓度的乙酸和丙酸(相对于上一轮)的介质中培养存活细胞(surviving cell)。反复地重复该流程直至酵母能够耐受高浓度的乙酸和丙酸(即酵母能够生长和消耗15g/L的浓度的乙酸和丙酸)。以这种方式，得到菌株产朊假丝酵母ABLMCU1。

用得到的耐受高浓度的乙酸和丙酸的产朊假丝酵母菌株(ABLMCU1)，使用类似的诱变/选择方案，这次将来自丙酸杆菌的发酵的稀释的静止阶段上清液用作抑制剂。更详细地，使之前选择为耐受有机酸的产朊假丝酵母细胞在YEPD介质中生长，经受甲磺酸乙酯以及随后在介质上培养，该介质是费氏丙酸杆菌菌株ABLM1700在乳清中发酵得到的静止阶段上清液(乳清，5g/L酵母提取物、20mg/L CoCl₂，在35℃下培养费氏丙酸杆菌96小时，下文中将上清液称为介质“As”)和用于发展耐受有机酸的酵母细胞的介质(即乙酸(15g/L)、丙酸(15g/L)和酵母提取物(10g/L))(本文中称为介质“Bs”)的混合物。这些介质以As:Bs＝3:7的比率混合，其在ABLMCU1酵母细胞能够生长的水平以上。72小时之后，将得到的产朊假丝酵母培养物的等分部分转移到YEPD中，使其生长并再次暴露于甲磺酸乙酯，以及随后将其转移到较高比率的As:Bs(即4:6)的介质As和Bs的混合物中。重复该流程直至得到酵母克隆，其耐受丙酸杆菌的发酵的未稀释的静止阶段上清液(100％As)。得到的酵母菌株于2014年1月20日保藏在DSMZ-德国微生物保藏中心，并在登录号DSM28271下可获得。

以上描述的流程产生耐受丙酸杆菌的产朊假丝酵母菌株。然而，应当注意的是，使用类似的流程成功生产了其他耐受丙酸杆菌的菌株，即起始于不同的酵母菌株。例如，在类似的流程中处理乳酸克鲁维酵母Y-17597菌株并产生根据本发明的耐受丙酸杆菌的真菌菌株(乳酸克鲁维酵母ABLMKL6)。因此示出该流程是可再现的并适用于其他酵母菌株。

实施例2-用于建立“在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长的能力”的测试

根据权利要求1，以下方法适用于确定真菌菌株(例如酵母菌株)是否“能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长”。

步骤1：得到丙酸杆菌培养的静止阶段上清液

如下在介质P1(以下表1)中制备第一阶段丙酸杆菌种菌培养物。将由培养物保藏中心得到的100μL丙酸杆菌储备培养物(stock culture)(费氏丙酸杆菌ATCC 6207)转移到50mL的介质P1中，并在没有通风和没有摇动的情况下在35℃下温育4天。

然后将15mL的该第一阶段种菌培养物转移到填充有135mL的介质P2(以下表2)的150mL玻璃瓶中，并在没有通风和没有摇动的情况下在35℃下温育4天以得到第二段种菌培养物。

然后将100mL如此得到的第二阶段种菌培养物用于接种填充有900mL介质P3(以下表3)的1L工作体积搅拌槽生物反应器。培养参数是：温度：35±0.5℃，pH：6.5±0.1(用15％NaOH或H₂SO₄控制)，搅动：100±10RPM，喷射CO₂：0.1±0.05vvm，NH₄⁺浓度：400±100mg/L(使用15％(NH₄)₂SO₄每12小时调节一次，pH 6.5)。运行发酵直至乳糖浓度低于1g/L。发酵结束后，肉汤中的乙酸和丙酸的浓度总和优选地大于或等于20g/L。

在10000g下离心如此得到的50mL发酵肉汤，并将上清液转移到爱伦美氏瓶(Erlenmeyer flask)中，并在121℃下高压灭菌(autoclave)20分钟。高压灭菌的介质是“丙酸杆菌培养的静止阶段上清液”。

步骤2：测试在丙酸杆菌的静止阶段上清液中生长的能力

通过将100μL的储备培养物添加到10mL的Y1介质(表4)中制备待测试的真菌细胞的接种物。在35℃和200RPM下在旋转摇瓶机上(rotary shaker)温育接种物培养物72小时。将得到的培养物用作以下步骤中的“真菌接种物”。

用2.5mL真菌接种物来接种包含以上步骤1得到的静止阶段上清液的高压灭菌的爱伦美氏瓶并在35℃和200RPM下在旋转摇瓶机上温育。将初始pH值设置为pH 6.5。将这视为“测试培养”。

24小时培养之后，通过测量培养物中的pH的变化评估真菌的生长。在一个实施方式中，在所附权利要求1的含义内，如果24h培养时间之后测试培养中的肉汤的pH值从起始pH(pH 6.5)升高到pH值8.0或更高，则将测试的真菌细胞视为“能够在丙酸杆菌的静止阶段上清液中生长”。

因此，如果24h培养时间之后测试培养中的肉汤的pH值保持低于8.0，则认为测试的真菌细胞不能在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长。

能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长的要求保护的真菌细胞优选地是在以上测试中测试阳性的细胞。

实施例2b)-替换测试

可替换地，通过测量24小时培养之后培养物的变化OD可以评估真菌的生长。

在所附权利要求1的含义内，如果在接种之后24h内肉汤的光密度(在620nm下测量)的差增加至少0.5，则认为测试的真菌细胞能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长。可替换地，在所附权利要求1的含义内，如果测试培养中的真菌细胞的最大生长速率(μ_max)等于0.02h^-1或更高，则认为测试的真菌细胞能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长。

因此，在所附权利要求1的含义内，如果在接种之后24h内肉汤的光密度(在620nm下测量)的差增加小于0.5，则认为测试的真菌细胞不能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长。可替换地，在所附权利要求1的含义内，如果测试培养中的真菌细胞的最大生长速率(μ_max)低于0.02h^-1，则认为测试的真菌细胞不能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长。

因此，能够在丙酸杆菌培养的静止阶段上清液中生长的要求保护的真菌细胞是在以上替换测试中的一个中测试阳性的细胞。

表1：用于丙酸杆菌的定义介质P1

表2：用于丙酸杆菌的定义介质P2

*灭菌之后添加

表3：用于丙酸杆菌的介质P3

*灭菌之后添加

**具有以下规格的食品级甜乳清粉：乳糖最低63％wt.、蛋白质最低10％wt.、水分最高5％是合适的并可由不同的供应商如：HoogwegtInternational(荷兰)、Lactalis Ingredients(法国)、James Farrell&Co(美国)得到。

表4：用于酵母的介质Y1

实施例3-丙酸杆菌和酵母的有效共同培养

i)丙酸杆菌接种物制备

在两个阶段中制备丙酸杆菌的接种物。将费氏丙酸杆菌ABLM2475(可以使用任何其他的产生维生素B12的菌株如费氏丙酸杆菌ATCC6207)0.5mL的储备悬浮液(stock suspension)接种到50mL的第一营养介质(vegetative medium)(酵母提取物20g/L和DL-乳酸盐(酯)20g/L)中并在35℃下温育4天。然后将第一营养阶段(vegetative stage)转移到400mL的第二阶段营养介质(葡萄糖40g/L、酵母提取物40g/L、DL-乳酸盐(酯)40g/L、碳酸钙10g/L、氯化钴20mg/L、泛酸盐(酯)10mg/L)中并温育4天，同时用氢氧化钠连续中和pH值。然后将整个第二阶段转移到最终的生物反应器中。

ii)耐受的酵母接种物制备

也在两个阶段中制备耐受的酵母的接种物。将酵母DSM 28271的0.5mL储备悬浮液接种到250mL爱伦美氏瓶中的50mL的第一营养介质(酵母提取物40g/L、蛋白胨40g/L和葡萄糖10g/L)中，并在220RPM下在旋转摇瓶机上在35℃下温育2天。然后将第一营养阶段转移到1000mL爱伦美氏瓶中的200mL相同介质中，并在220RPM下在旋转摇瓶机上在35℃下培养2天。

iii)发酵

用补充有酵母提取物(5g/L)和氯化钴(20mg/L)的4L酸乳清(COD是80.000mg O₂/L)填充7L工作体积的生物反应器，并在121℃下灭菌1小时。冷却至35℃之后，添加泛酸盐(酯)(10mg/L)并用丙酸杆菌的种菌培养物接种生物反应器。培养温度是35℃以及搅动速率是100RPM。用CO₂气体喷射生物反应器中的内容物(10mL/min)，并将pH保持在6.5(用NaOH)。90小时之后，乳酸盐(酯)和乳糖已经被耗尽，以及产生大约8和15g/L的乙酸和丙酸。这时，添加20mg/L的5,6-二甲基苯并咪唑，将搅动速率增加至500RPM并以1vvm引入通风，以及用5％耐受的酵母接种生物反应器。将pH值保持在6.5(用H₂SO₄)。48小时之后，酵母消耗了所有的有机酸并停止发酵。该过程产生15mg/L的维生素B12。通过离心除去由丙酸杆菌和酵母组成的生物质，且得到的上清液的COD值是12.000mg O₂/L，降低了85％。

图3示出了示例性过程的示意性流程图。

实施例4-丙酸杆菌和酵母(乳酸克鲁维酵母ABLMKL6)的有效共同培养

i)丙酸杆菌接种物制备

在两个阶段中制备丙酸杆菌的接种物。将费氏丙酸杆菌ABLM2475(可以使用任何其他的产生维生素B12的菌株如费氏丙酸杆菌ATCC6207)的0.5mL的储备悬浮液接种到50mL的第一营养介质(酵母提取物20g/L和DL-乳酸盐(酯)20g/L)中并在35℃下温育4天。然后将第一营养阶段转移到400mL的第二阶段营养介质(葡萄糖40g/L、酵母提取物40g/L、DL-乳酸盐(酯)40g/L、碳酸钙10g/L、氯化钴20mg/L、泛酸盐(酯)10mg/L)中并培养4天，同时用氢氧化钠连续中和pH值。然后将整个第二阶段转移到最终的生物反应器中。

ii)耐受的酵母接种物制备

也在两个阶段中制备耐受的酵母的接种物。将耐受的酵母乳酸克鲁维酵母ABLMKL6的0.5mL储备悬浮液接种到250mL爱伦美氏瓶中的50mL的第一营养介质(酵母提取物40g/L、蛋白胨40g/L和葡萄糖10g/L)中，并在220RPM下在旋转摇瓶机上在35℃下温育2天。然后将第一营养阶段转移道1000mL爱伦美氏瓶中的200mL相同介质中，并在220RPM下在旋转摇瓶机上在35℃下培养2天。

iii)发酵

用补充有酵母提取物(5g/L)和氯化钴(20mg/L)的4L酸乳清(COD是80.000mg O₂/L)填充7L工作体积的生物反应器，并在121℃下灭菌1小时。冷却至35℃之后，添加泛酸盐(酯)(10mg/L)并用丙酸杆菌的种菌培养物接种生物反应器。培养温度是35℃以及搅动速率是100RPM。用CO₂气体(10mL/min)喷射生物反应器中的内容物，并将pH保持在6.5(用NaOH)。112小时之后，乳酸盐(酯)和乳糖已经被耗尽，以及产生大约4和14g/L的乙酸和丙酸。这时，添加20mg/L的5,6-二甲基苯并咪唑，将搅动速率增加至500RPM并以1vvm引入通风，以及用5％耐受的酵母接种生物反应器。将pH值保持在6.5(用H₂SO₄)。72小时之后，酵母消耗了所有的有机酸并停止发酵。该过程产生16mg/L的维生素B12。通过离心除去由丙酸杆菌和酵母组成的生物质，且得到的上清液的COD值是14.500mg O₂/L，降低了81％。