修饰的脑膜炎球菌fHbp多肽的制作方法

技术领域

本发明在蛋白工程改造的领域中，具体涉及脑膜炎球菌因子H结合蛋白(fHbp)，其已知是有用的疫苗免疫原。

背景技术：

脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰阴性荚膜细菌，其寄居在大约10％人群的上呼吸道。可获得针对血清群A、C、W135和Y的缀合物疫苗可用，但可用于在两个剂量方案中预防血清群B的唯一疫苗是在2013年批准的BEXSERO™产品。

BEXSERO™中的保护性免疫原之一是fHbp，其也被称为蛋白‘741’(参考文献中的SEQ ID NO:2536；本文中的SEQ ID 1)，‘NMB1870’，‘GNA1870’[2-4]，‘P2086’，‘LP2086’或‘ORF2086’[5-7]。该蛋白的3D结构是已知的[8，9]，且该蛋白具有通过短接头连接的两个β-桶。许多出版物都报道了该蛋白在脑膜炎球菌疫苗中的保护效力，例如参见参考文献10-14。fHbp脂蛋白在所有血清群的各种菌株中都表达。已将fHbp序列分为三种变体[2](在本文中称为v1、v2和v3)，并且已通常发现针对给定变体产生的血清针对表达该变体的菌株是杀细菌的，但其对表达其它两种变体之一的菌株无活性，即存在变体内交叉保护、但不存在变体间交叉保护(除了一些v2和v3交叉反应性)。

为了增加家族内交叉反应性，fHbp序列已被工程改造以含有针对所有三种变体的特异性[15]。蛋白工程改造也已经被用于去除fHbp与铁载体[16]和与因子H[17-25]的相互作用。对于所有三种变体已经报道了与fH的相互作用的破坏，并且据推测提供了优异的疫苗免疫原[22，26]。然而，对于v2多肽，参考文献23和24报道了固有不稳定性，这也见于fH结合被破坏的突变体。该不稳定性似乎由N-末端β-桶结构域导致，并且参考文献23警告，该桶中的任何取代可能促进不稳定。

本发明的一个目标是提供进一步的fHbp v2和v3突变体，但具有增强的稳定性。

发明公开内容

v2中来自菌株2996的全长fHbp具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

成熟脂蛋白缺乏SEQ ID NO:2的前19个氨基酸(加下划线；提供了SEQ ID NO:4)，且SEQ ID NO:2的ΔG形式缺乏前26个氨基酸(SEQ ID NO:5)。

v3中来自菌株M1239的全长fHbp具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSI PQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

成熟脂蛋白缺乏SEQ ID NO:3的前19个氨基酸(加下划线；提供了SEQ ID NO:40)，且SEQ ID NO:3的ΔG形式缺乏前31个氨基酸(SEQ ID NO:17)。

本发明人已经鉴定了SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3内可以被修饰以增加多肽的稳定性的残基。这些残基通常跨越v2和v3序列存在，所以其修饰可以提供具有增强稳定性的v2和v3 fHbp序列。而且，本发明人已经显示，除了增加稳定性以外，这些残基的突变可以有利地减少与人因子H (fH)的结合。然而，此外，本文公开的突变可以与其它突变组合，例如以减少与人因子H (fH)的结合，其中几个突变是本领域中已知的。

因此，通常本发明提供了突变体v2或v3 fHbp，其相对于野生型fHbp(例如，相对于SEQ ID NO:2或3)具有增加的稳定性，并且，任选地，其对于人因子H比对于野生型fHbp(例如，相对于SEQ ID NO:2或3)具有更低的亲和力。稳定性的增加和fH亲和力的任选降低优选由一种或多种相同突变导致，但是在一些实施方案中，它们可能是由于组合突变的分开作用。具有增加的稳定性和降低的fH亲和力两者的突变体fHbp蛋白是优选的。

在第一个实施方案中，本发明提供了包含突变体fHbp v2氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少k%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:5的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下残基中的一个或多个处不同于SEQ ID NO:5：S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240。

当特征(a)涉及片段时，所述片段将包括(b)中列出的残基中的至少一个，但当与SEQ ID NO:5中的该残基相比时，该残基将不同。(a)的片段将通常为至少7个氨基酸长，例如来自SEQ ID NO:5的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60个或更多个连续氨基酸。所述片段将通常包括来自SEQ ID NO:5的至少一个表位。对于fHbp确立了表位鉴定和作图[11；27-31]。与SEQ ID NO:5共享至少30个连续氨基酸将是典型的，并且通常突变体fHbp v2氨基酸序列将包括来自SEQ ID NO:5的几个(例如2、3、4、5个或更多个)片段。总体而言，突变体fHbp v2氨基酸序列可以与SEQ ID NO:5具有至少k%序列同一性且包括SEQ ID NO:5的几个片段。

k的值可以选自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其优选为90(即，突变体fHbp v2氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性)且更优选为95。

施用于宿主动物之后，所述多肽可以引发可以识别由SEQ ID NO:4组成的野生型脑膜炎球菌多肽的抗体。这些抗体理想地是杀细菌的(参见下文)。这些抗体可以包括不识别v1或v3多肽(例如，由SEQ ID NO:46组成的野生型脑膜炎球菌多肽和由SEQ ID NO:40组成的野生型脑膜炎球菌多肽)的一些抗体，尽管它们还可以包括与v1和/或v3多肽交叉反应的一些抗体。

在相同实验条件下，所述多肽具有比相同多肽更高的稳定性，但(b)的序列差异，例如比由SEQ ID NO:4组成的野生型脑膜炎球菌多肽更高的稳定性。稳定性增强可以使用差示扫描量热法(DSC)进行评价，例如如参考文献32和33中所讨论。DSC先前已经用来评价v2 fHbp的稳定性[24]。用于DSC评价稳定性的合适条件可以使用缓冲溶液(例如25mM Tris)中的20µM多肽与6至8(例如7-7.5)的pH与100-200mM NaCl (例如150mM)。

在一些实施方案中，本发明的多肽相对于SEQ ID NO:5是截短的。与野生型成熟序列相比，SEQ ID NO:5已经在N-末端截短最多达且包括聚-甘氨酸序列(比较SEQ ID NO:4和5)，但SEQ ID NO:5可以在C-末端截短和/或在N-末端进一步截短。

稳定性的增加理想地为至少5℃，例如至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或更高。这些温度是指如通过DSC所评价的热转变中点(Tm)的提高。野生型fHbp在解折叠期间显示两个DSC峰(N-末端结构域一个，C-末端结构域一个)，并且当本发明的多肽包括两个这样的结构域时，所述提高是指N-末端结构域的稳定性，这对于野生型v2序列可以甚至低于40℃发生[24](而C-末端结构域可以具有80℃或更高的Tm)。因此，本发明的突变体fHbp v2氨基酸序列优选具有N-末端结构域，其具有至少45℃，例如，>50℃、>55℃、>60℃、>65℃、>70℃、>75℃或甚至>80℃的Tm。

在第二个实施方案中，本发明提供了包含突变体fHbp v3氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少j%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:17的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下残基中的一个或多个处不同于SEQ ID NO:17：S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243。

当特征(a)涉及片段时，所述片段将包括(b)中列出的残基中的至少一个，但当与SEQ ID NO:17中的该残基相比时，该残基将不同。(a)的片段将通常为至少7个氨基酸长，例如来自SEQ ID NO:17的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60个或更多个连续氨基酸。所述片段将通常包括来自SEQ ID NO:17的至少一个表位。对于fHbp确立了表位鉴定和作图[11；27-31]。与SEQ ID NO:17共享至少30个连续氨基酸将是典型的，并且通常突变体fHbp v3氨基酸序列将包括来自SEQ ID NO:17的几个(例如2、3、4、5个或更多个)片段。总体而言，突变体fHbp v3氨基酸序列可以与SEQ ID NO:17具有至少j%序列同一性且包括SEQ ID NO:17的几个片段。

j的值可以选自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其优选为90(即，突变体fHbp v3氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少90％同一性)且更优选为95。

施用于宿主动物之后，所述多肽可以引发可以识别由SEQ ID NO:40组成的野生型脑膜炎球菌多肽的抗体。这些抗体理想地是杀细菌的(参见下文)。这些抗体可以包括不识别v1或v2多肽(例如，由SEQ ID NO:46组成的野生型脑膜炎球菌多肽和由SEQ ID NO:4组成的野生型脑膜炎球菌多肽)的一些抗体，尽管它们还可以包括与v1和/或v2多肽交叉反应的一些抗体。

在相同实验条件下，所述多肽具有比相同多肽更高的稳定性，但(b)的序列差异，例如比由SEQ ID NO:40组成的野生型脑膜炎球菌多肽更高的稳定性。稳定性增强可以使用差示扫描量热法(DSC)进行评价，例如如参考文献32和33中所讨论。DSC先前已经用来评价v3 fHbp的稳定性[23]。用于DSC评价稳定性的合适条件可以使用缓冲溶液(例如25mM Tris)中的20µM多肽与6至8(例如7-7.5)的pH与100-200mM NaCl (例如150mM)。

在一些实施方案中，本发明的多肽相对于SEQ ID NO:17是截短的。与野生型成熟序列相比，SEQ ID NO:17已经在N-末端截短最多达且包括聚-甘氨酸序列(比较SEQ ID NO:40和17)，但SEQ ID NO:17可以在C-末端截短和/或在N-末端进一步截短。

稳定性的增加理想地为至少5℃，例如至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或更高。这些温度是指如通过DSC所评价的热转变中点(Tm)的提高。野生型fHbp在解折叠期间显示两个DSC峰(N-末端结构域一个，C-末端结构域一个)，并且当本发明的多肽包括两个这样的结构域时，所述提高是指N-末端结构域的稳定性，这对于野生型v3序列可以在约60℃或更低时发生[24](而C-末端结构域可以具有80℃或更高的Tm)。因此，本发明的突变体fHbp v3氨基酸序列优选具有N-末端结构域，其具有至少65℃，例如，>70℃、>75℃或甚至>80℃的Tm。

相对于SEQ ID NO:5的突变

本发明的第一个实施方案的多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:5的片段。然而，与SEQ ID NO:5相比，该氨基序列具有在氨基酸残基S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240中的一个或多个处，例如，在这17个残基中的2、3、4、5或更多个处的修饰。这些残基根据SEQ ID NO:5编号；以匹配新生野生型序列(SEQ ID NO:2)，所述编号应当改变+26(即SEQ ID NO:5的Ser-32是SEQ ID NO:2的Ser-58)，且以匹配成熟野生型序列(SEQ ID NO:4)，所述编号应当改变+7(其还允许与参考文献25的容易比较)。

用于突变的优选残基是S32、V100、L123、V124、S125、G126、L127、G128、H239和/或E240。这些残基处的突变得到与野生型v2相比具有良好稳定性的蛋白。在该子集内，优选残基是S32、L123、V124、S125、G126、L127和/或G128。最优选位置是S32、L123、V124、S125、G126、L127和/或G128，其中残基S32和/或L123是特别优选的，例如，S32V和/或L123R。当V100、S125和/或G126中的一个或多个被突变时，还优选突变该三者(trio)之外的残基。

指定残基可以被缺失，但其优选被不同的氨基酸取代。例如，Ser-32可以被其它19个天然存在的氨基酸中的任一个取代。在一些实施方案中，当进行取代时，替代氨基酸可以是简单氨基酸，诸如甘氨酸或丙氨酸。在其它实施方案中，替代氨基酸是保守取代，例如其在以下四组内进行：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。在其它实施方案中，所述取代是非保守的。在一些实施方案中，所述取代不使用丙氨酸。

指定残基处的优选取代如下：S32V；V33C；L39C；L41C；F69C；V100T；I113S；F122C；L123R；V124I；S125G或S125T；G126D；L127I；G128A；S151C；H239R；E240H。

当突变体fHbp v2氨基酸序列包括E240处的取代时，如果仅E240被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基E240和H239均被突变，则其可以是丙氨酸。理想地，E240自身不被突变，所以具有E240处的取代的突变体fHbp v2氨基酸序列也应当包括第二残基处(例如E240和H239两者处)的取代(参见突变体#1和#11)。

当突变体fHbp v2氨基酸序列包括F122处的取代时，如果仅F122被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基F122和S151均被突变，则其可以是丙氨酸。理想地，F122自身不被突变，所以具有F122处的取代的突变体fHbp v2氨基酸序列也应当包括第二残基处的取代。当F122被取代时，优选的是，S151也被取代，例如两者均被半胱氨酸取代，以允许形成二硫桥(参见突变体#10)。

当突变体fHbp v2氨基酸序列包括L123处的取代时，如果仅L123被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基L123和S32均被突变，则其可以是丙氨酸。如果L123自身被突变，则优选被精氨酸取代(例如，参见突变体#4)。然而，在一些实施方案中，L123自身不被突变，所以具有L123处的取代的突变体fHbp v2氨基酸序列也可以包括第二残基处的取代。当L123被取代时，可以优选的是：(i) S32也被取代，如突变体#3中所见，并且任选地S125也被取代，如突变体#20和#22中所见；或(ii)残基124-128中的一个或多个也被取代，例如，如突变体#12中所见。

当突变体fHbp v2氨基酸序列包括V124处的取代时，优选的是如果仅V124被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基123-128中的一个或多个也被突变，则其可以是丙氨酸。如果V124自身被突变，则优选被异亮氨酸取代。然而，理想地，V124自身不被突变，所以具有V124处的取代的突变体fHbp v2氨基酸序列也应当包括第二残基处的取代。当V124被取代时，优选的是，残基124-128中的一个或多个也被取代，例如，如突变体#12中所见。

当突变体fHbp v2氨基酸序列包括L127处的取代时，优选的是如果仅L127被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基123-128中的一个或多个也被突变，则其可以是丙氨酸。如果L127自身被突变，则优选被异亮氨酸取代。然而，理想地，L127自身不被突变，所以具有L127处的取代的突变体fHbp v2氨基酸序列也应当包括第二残基处的取代。当L127被取代时，优选的是，残基124-128中的一个或多个也被取代，例如，如突变体#12中所见。

当突变体fHbp v2氨基酸序列包括S32处的取代时，优选的是，如果仅S32被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基L123和S32均被突变，则其可以是丙氨酸。如果S32自身被突变，则优选被缬氨酸取代。然而，理想地，S32自身不被突变，所以具有S32处的取代的突变体fHbp v2氨基酸序列也应当包括第二残基处的取代。当S32被取代时，优选的是：(i) L123也被取代，如突变体#3中所见，并且任选地S125也被取代，如突变体#20和#22中所见；或(ii) S125也被取代，例如，如突变体#19和#21中所见。

当突变体fHbp v2氨基酸序列包括I113处的取代时，如果仅I113被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，则其可以是丙氨酸。如果I113自身被突变，则优选被丝氨酸取代，例如，如突变体#7中所见。

当突变体fHbp v2氨基酸序列包括V33处的取代时，这优选不是被异亮氨酸。当突变体fHbp v2氨基酸序列包括I113处的取代时，这优选不是被苏氨酸或被丙氨酸。当突变体fHbp v2氨基酸序列包括S151处的取代时，这优选不是被苯丙氨酸。当突变体fHbp v2氨基酸序列包括H239和E240两者处的取代时，这优选不是取代为R239和Q240。

当进行多于一个取代时，这些可以选自如下组2A至2O：

2A：残基239和240，例如突变体#1。

2B：残基32和123，例如突变体#3。

2C：残基125和126，例如突变体#5。

2D：残基100、125和126，例如突变体#6。

2E：残基33和39，例如突变体#8。

2F：残基41和69，例如突变体#9。

2G：残基122和151，例如突变体#10。

2H：残基100、125、126、239和240，例如突变体#11。

2I：残基32和125，例如突变体#19和#21。

2J：残基32、123和125，例如突变体#20和#22。

2K：残基33和39，两者均被Cys取代，例如突变体#8。

2L：残基41和69，两者均被Cys取代，例如突变体#9。

2M：残基122和151，两者均被Cys取代，例如突变体#10。

2N：残基123、124、125、126、127和128，例如突变体#12。

2O：残基32、123、124、125、126、127和128。

因此，例如，如果残基239待被取代，则用于取代的优选第二残基是240(即组2A)；而且，残基100、125和126也可能被修饰(即组2H，其是组2A和2D的组合)。在组2A至2N和2O内，在指定位置处的优选取代是上面列出的那些。对于组2K、2L和2M，意图引入二硫桥。在组2A至2N内，优选的突变体是2A、2B、2C、2D、2I、2J和2N。更优选的是2C、2I和2N，其中2N是特别优选的。组2B提供最优选的突变，特别是S32V和L123R(例如SEQ ID NO:20和45)。组2O是突变的另一个优选集合，其组合2B、2C和三个进一步突变(例如，以得到SEQ ID NO:58)。

v2序列中指明用于突变的氨基酸残基相对于来自菌株2996的SEQ ID NO:5进行编号。来自任何其它菌株的v2 fHbp中的相应氨基酸残基可以通过序列比对容易地鉴定，例如是这样的氨基酸：当使用成对比对算法(例如，Needleman-Wunsch全局比对算法，如下面详述)与SEQ ID NO:5比对时，其与本文提及的氨基酸比对。经常地，所述氨基酸将与SEQ ID NO:5中所见的是相同的(例如残基32将是丝氨酸)，但如果这不是这样的情况，所述比对将容易地鉴定。

除了目的在于增强稳定性的上述突变以外，本发明的多肽可以包括一个或多个进一步突变，例如，以破坏多肽与铁载体的相互作用，或更优选地，以破坏多肽结合至fH的能力。

参考文献19和25报道了fH和v2 fHbp之间的相互作用可以被残基R80、D211、E218、E248、T220+H222 (双重突变)和G236处的突变所破坏。根据SEQ ID NO:5编号，这些残基是R73、D203、E210、E240、T213+H215和G228。这些位置中，在D203、E210或T213+H215处突变的多肽是优选的，因为参考文献25报道了这些突变体中的重要抗原没有损害。参考文献25中研究的具体取代是R73A、D203A、E210A、T213A+H215A、G228I和E240A；这些取代适合于根据本发明使用。

参考文献24报道了fH和v2 fHbp之间的相互作用可以被残基R145、S193、F194、L195、A265、E267、K268、V272、I273、L274、E283、T286、H288、F292、T304和E313以及E283+T304(双重突变)处的突变所破坏。根据SEQ ID NO:5编号，这些残基是R73、S121、F122、L123、A192、E194、K195、V199、I200、L201、E210、T213、H215、F219、T231和E240以及E210+T231。这些中的四个与参考文献25(E210、T213、H215、E240)重叠。参考文献24中研究的具体取代是丙氨酸(除了A265P和T304E)，并且这些取代适合于根据本发明使用。

参考文献24报道了，v2中的某些取代可以增加对于fH的亲和力，并且如果目的在于破坏与fH的结合，则应当避免这些，例如SEQ ID NO:5中的E85(参考文献24中的残基157)。

与铁载体相互作用的残基可以使用参考文献16和34中的指导进行突变，例如通过比对本文中的SEQ ID NO:5与参考文献16的SEQ ID NO:4，以鉴定可以与铁载体(例如与儿茶酚酸酯(catecholates)、异羟肟酸酯或羧酸酯)相互作用的残基。

可以突变的进一步残基包括，但不限于，S23、L24、D30、Q31、R34、D95和/或L102，例如使用参考文献35中建议的突变。

第一个实施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:18至36中的任一种。类似地，考虑到‘ΔG’突变(即，最多达且包括天然聚-Gly序列的新生N-末端的截短)，则第一个实施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:18至36(排除其氨基酸1-26)中的任一种。例如，第一个实施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:45，或者可以包含SEQ ID NO:58。

考虑到进一步点突变的可能性(例如，以破坏与铁载体和/或fH的相互作用)，第一个实施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:18至36中的任一种(或SEQ ID NO:18至36(排除其氨基酸1-26)中的任一种，诸如SEQ ID NO:45)，但通过最多达5个单一氨基酸变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入)进行修饰，条件是施用于宿主动物之后，修饰的序列可以引发结合至由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的脑膜炎球菌fHbp多肽的抗体。这样的氨基酸变化不应当逆转这些序列中相对于野生型序列的突变，例如SEQ ID NO:45不应当在残基V32或R123处突变。

本发明还提供了包含fHbp v2氨基酸序列的多肽，其中所述v2氨基酸序列与v2野生型氨基酸序列是相同的，除了对应于SEQ ID NO:5的Leu-123的氨基酸位置处的突变，条件是所述突变不是取代为丙氨酸(例如，其中所述突变是取代为精氨酸)。例如，所述多肽可以包含SEQ ID NO:5，但具有L123处的突变(除了L123A以外)。

SEQ ID NO:59和60是v2突变体的两种进一步实例，即菌株8047的突变体#3和#4的成熟形式。

相对于SEQ ID NO:17的突变

本发明的第二个实施方案的多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少j%同一性的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:17的片段。然而，与SEQ ID NO:17相比，该氨基序列具有在氨基酸残基S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243中的一个或多个处，例如，在这17个残基中的2、3、4、5或更多个处的修饰。这些残基根据SEQ ID NO:17编号；以匹配新生野生型序列(SEQ ID NO:3)，所述编号应当改变+31(即SEQ ID NO:17的Ser-32是SEQ ID NO:3的Ser-63)，且以匹配成熟野生型序列(SEQ ID NO:40)，所述编号应当改变+12。

用于突变的优选残基是S32、V103、L126、V127、S128、G129、L130、G131、H242和/或E243。在该子集内，优选残基是S32、L126、V127、S128、G129、L130和/或G131。最优选位置是S32、L126、V127、S128、G129、L130和/或G131，其中残基S32和/或L126是特别优选的，例如，S32V和/或L126R。

指定残基可以被缺失，但其优选被不同的氨基酸取代。例如，Ser-32可以被其它19个天然存在的氨基酸中的任一个取代。在一些实施方案中，当进行取代时，替代氨基酸可以是简单氨基酸，诸如甘氨酸或丙氨酸。在其它实施方案中，替代氨基酸是保守取代，例如其在以下四组内进行：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。在其它实施方案中，所述取代是非保守的。在一些实施方案中，所述取代不使用丙氨酸。

指定残基处的优选取代如下：S32V；I33C；L39C；L41C；F72C；V103T；T116S；F125C；L126R；V127I；S128G or S128T；G129D；L130I；G131A；S154C；H242R；E243H。

当突变体fHbp v3氨基酸序列包括E243处的取代时，如果仅E243被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基E243和H242均被突变，则其可以是丙氨酸。理想地，E243自身不被突变，所以具有E243处的取代的突变体fHbp v3氨基酸序列也应当包括第二残基处(例如E243和H242两者处)的取代。

当突变体fHbp v3氨基酸序列包括F125处的取代时，如果仅F125被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基F125和S154均被突变，则其可以是丙氨酸。理想地，F125自身不被突变，所以具有F125处的取代的突变体fHbp v3氨基酸序列也应当包括第二残基处的取代。当F125被取代时，优选的是，S154也被取代，例如两者均被半胱氨酸取代，以允许形成二硫桥。

当突变体fHbp v3氨基酸序列包括L126处的取代时，如果仅L126被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基L126和S32均被突变，则其可以是丙氨酸。如果L126自身被突变，则优选被精氨酸取代。然而，在一些实施方案中，L126自身不被突变，所以具有L126处的取代的突变体fHbp v3氨基酸序列也可以包括第二残基处的取代。当L126被取代时，可以优选的是：(i) S32也被取代，并且任选地S128也被取代；或(ii)残基127-131中的一个或多个也被取代。

当突变体fHbp v3氨基酸序列包括V127处的取代时，优选的是如果仅V127被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基126-131中的一个或多个也被突变，则其可以是丙氨酸。如果V127自身被突变，则优选被异亮氨酸取代。然而，理想地，V127自身不被突变，所以具有V127处的取代的突变体fHbp v3氨基酸序列也应当包括第二残基处的取代。当V127被取代时，优选的是，残基127-131中的一个或多个也被取代。

当突变体fHbp v3氨基酸序列包括L130处的取代时，优选的是如果仅L130被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基126-131中的一个或多个也被突变，则其可以是丙氨酸。如果L130自身被突变，则优选被异亮氨酸取代。然而，理想地，L130自身不被突变，所以具有L130处的取代的突变体fHbp v3氨基酸序列也应当包括第二残基处的取代。当L130被取代时，优选的是，残基127-131中的一个或多个也被取代。

当突变体fHbp v3氨基酸序列包括S32处的取代时，优选的是，如果仅S32被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，例如如果残基中的一个或多个，如果残基L126和S32均被突变，则其可以是丙氨酸。如果S32自身被突变，则优选被缬氨酸取代。然而，理想地，S32自身不被突变，所以具有S32处的取代的突变体fHbp v3氨基酸序列也应当包括第二残基处的取代。当S32被取代时，优选的是：(i) L126也被取代，并且任选地S128也被取代，或(ii) S128也被取代。

当突变体fHbp v3氨基酸序列包括T113处的取代时，如果仅T113被突变，则该取代将不是被丙氨酸，尽管如果(b)中列出的进一步氨基酸被取代，则其可以是丙氨酸。如果T113自身被突变，则优选被丝氨酸取代。

当突变体fHbp v3氨基酸序列包括I33处的取代时，这优选不是被缬氨酸。当突变体fHbp v3氨基酸序列包括T116处的取代时，这优选不是被异亮氨酸。当突变体fHbp v3氨基酸序列包括G129处的取代时，这优选不是被丝氨酸。当突变体fHbp v3氨基酸序列包括H242和E243两者处的取代时，这优选不是取代为R242和Q243。

当进行多于一个取代时，这些可以选自如下组3A至3O：

3A：残基242和243。

3B：残基32和126。

3C：残基128和129。

3D：残基103、128和129。

3E：残基33和39。

3F：残基41和72。

3G：残基125和154。

3H：残基103、128、129、242和243。

3I：残基32和128。

3J：残基32、126和128。

3K：残基33和39，两者均被Cys取代。

3L：残基41和72，两者均被Cys取代。

3M：残基125和154，两者均被Cys取代。

3N：残基126、127、128、129、130和131。

3O：残基32、126、127、128、129、130和131。

因此，例如，如果残基242待被取代，则用于取代的优选第二残基是243(即组3A)；而且，残基103、128和129也可能被修饰(即组3H，其是组3A和3D的组合)。在组3A至3N和3O内，在指定位置处的优选取代是上面列出的那些。对于组3K、3L和3M，意图引入二硫桥。在组3A至3N内，优选的突变体是3A、3B、3C、3D、3I、3J和3N。更优选的是3C、3I和3N，其中3N是特别优选的。组3B提供最优选的突变，特别是S32V和L126R(例如，包含SEQ ID NO:44)。组3O是另一个优选突变，其组合3B、3C和三个进一步突变(例如，以得到SEQ ID NO:61)。单独的突变L126R提供SEQ ID NO:53。

V3序列中指明用于突变的氨基酸残基相对于来自菌株M1239的SEQ ID NO:17进行编号。来自任何其它菌株的v3 fHbp中的相应氨基酸残基可以通过序列比对容易地鉴定，例如是这样的氨基酸：当使用成对比对算法(例如，Needleman-Wunsch全局比对算法，如下面详述)与SEQ ID NO:17比对时，其与本文提及的氨基酸比对。经常地，所述氨基酸将与SEQ ID NO:17中所见的是相同的(例如残基32将是丝氨酸)，但如果这不是这样的情况，所述比对将容易地鉴定。

除了目的在于增强稳定性的上述突变以外，本发明的多肽可以包括一个或多个进一步突变，例如，以破坏多肽与铁载体的相互作用，或更优选地，以破坏多肽结合至fH的能力。

参考文献24报道了fH和v3 fHbp之间的相互作用可以被残基Q107、I147、L156、A157、L195、V196、V272、E283、T286、T304、V311、E313和E283+T304(双重突变)处的突变所破坏。根据SEQ ID NO:17编号，这些残基是：Q35、I78、L87、A88、L126、V127、V202、E213、T216、T234、V241、E243和E213+T234。参考文献24中研究的具体取代是丙氨酸(除了A157E和T231E)，并且这些取代适合于根据本发明使用。残基T216和E243也报道于参考文献23中。参考文献36报道了fH和v3 fHbp之间的相互作用可以被残基H288和G318(根据SEQ ID NO:17编号的H218和G248)处的突变所破坏，且这些取代适合于根据本发明使用，例如H218R、G248D。

参考文献24报道了，v3中的某些取代可以增加对于fH的亲和力，并且如果目的在于破坏与fH的结合，则应当避免这些，例如SEQ ID NO:17中的P44(参考文献24中的残基106)。

与铁载体相互作用的残基可以使用参考文献16和34中的指导进行突变，例如通过比对本文中的SEQ ID NO:17与参考文献16的SEQ ID NO:4，以鉴定可以与铁载体(例如与儿茶酚酸酯(catecholates)、异羟肟酸酯或羧酸酯)相互作用的残基。

第二个实施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:41至44中的任一种。考虑到进一步点突变的可能性(例如，以破坏与铁载体和/或fH的相互作用)，第一个实施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:41至44中的任一种，但通过最多达5个单一氨基酸变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入)进行修饰，条件是施用于宿主动物之后，修饰的序列可以引发结合至由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成的脑膜炎球菌fHbp多肽的抗体。这样的氨基酸变化不应当逆转这些序列中相对于野生型序列的突变，例如SEQ ID NO:44不应当在残基V32或R126处突变。

本发明还提供了包含fHbp v3氨基酸序列的多肽，其中所述v3氨基酸序列与v3野生型氨基酸序列是相同的，除了对应于SEQ ID NO:17的Leu-126的氨基酸位置处的突变，条件是所述突变不是取代为丙氨酸(例如，其中所述突变是取代为精氨酸)。例如，所述多肽可以包含SEQ ID NO:17，但具有L126处的突变(除了L126A以外)。

多肽

可通过各种方式，例如通过化学合成(至少部分)，通过使用蛋白酶消化较长多肽，通过从RNA翻译，通过从细胞培养物(例如从重组表达或从脑膜炎奈瑟氏菌培养物)纯化等制备本发明的多肽。大肠杆菌宿主中的异源表达是优选的表达途径。

本发明的多肽理想地为至少100个氨基酸长，例如150aa、175aa、200aa、225aa或更长。它们包括突变体fHbp v2和/或v3氨基酸序列，并且突变体fHbp v2或v3氨基酸序列应当类似地为至少100个氨基酸长，例如150aa、175aa、200aa、225aa或更长。

fHbp是脑膜炎奈瑟氏菌的天然脂蛋白。也已经发现其当在大肠杆菌中具有其天然前导序列或具有异源前导序列表达时被脂化。本发明的多肽可具有可被脂化的N-末端半胱氨酸残基，例如，包含棕榈酰基团，通常形成三棕榈酰-S-甘油-半胱氨酸。在其它实施方案中，所述多肽不被脂化。

优选制备实质上纯或实质上分离的形式的多肽(即实质上不含其它奈瑟氏菌或宿主细胞多肽)。通常，在非天然存在的环境中提供所述多肽，例如，将其与其天然存在的环境分离。在某些实施方案中，与起始材料相比，所述多肽存在于富含所述多肽的组合物中。因此提供纯化的多肽，其中纯化意指所述多肽存在于实质上不含其它表达多肽的组合物中， 其中实质上不含意指所述组合物的总多肽中的超过50% (例如>75%、>80%、>90%、>95%或>99%)为本发明的多肽。

多肽可以采用各种形式(例如，天然的，融合体，糖基化的，非糖基化的，脂化的，二硫桥等)。

SEQ ID NO 4、5、17和40不包括N-末端甲硫氨酸。如果通过在生物宿主中翻译来产生本发明的多肽，则需要起始密码子，其在大多数宿主中将提供N-末端甲硫氨酸。因此，本发明的多肽将至少在新生阶段包括位于所述SEQ ID NO序列上游的甲硫氨酸残基。

新生序列的切割意味着，突变体fHbp v2或v3氨基酸序列可能本身提供多肽的N-末端。然而，在其它实施方案中，本发明的多肽可以包括突变体fHbp v2或v3氨基酸序列的上游的N-末端序列。在一些实施方案中，所述多肽在N-末端具有单个甲硫氨酸，随后紧接着突变体fHbp v2或v3氨基酸序列；在其它实施方案中，可以使用更长的上游序列。这样的上游序列可以较短(例如，40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括指导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(例如组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合适的N-末端氨基酸序列是本领域技术人员将显而易见的，例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中存在的天然上游序列。

本发明的多肽也可以包括突变体fHbp v2或v3氨基酸序列的最后氨基酸下游的氨基酸。这样的C-末端延伸可以较短(例如，40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。实例包括指导蛋白运输的前导序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(例如包含组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或增强多肽稳定性的序列。其它合适的C-末端氨基酸序列是本领域技术人员将显而易见的。

在一些实施方案中，本发明排除包括组氨酸标签(参见参考文献24和25)和在C-末端包括六组氨酸标签的多肽。

术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性或支链聚合物，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语也涵盖天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述干预例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义还包括，例如，含有氨基酸的一个或多个类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以作为单链或缔合链（associated chain）存在。

可以将本发明的多肽附接或固定至固体支持物。

本发明的多肽可以包含可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记或生物素标记。这在免疫测定技术中是特别有用的。

如参考文献164中所公开，fHbp可以被分割为三个结构域，称为A、B和C。以SEQ ID NO:1为例，所述三个结构域为(A) 1-119，(B) 120-183和(C) 184-274：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

结构域“A”的成熟形式，从其N-末端的Cys-20至Lys-119，称为“A_成熟”。

多个fHbp序列是已知的，并且这些可以容易地用标准方法进行比对。通过这样的比对，技术人员可以(a)通过与MC58序列中的坐标比较来鉴定任何给定fHbp序列中的结构域“A”(和A_成熟)、“B”和“C”，和(b)鉴定多个fHbp序列中的单个残基，例如，用于鉴定取代。然而，为了便于参考，结构域定义如下：

- 给定fHbp序列中的结构域“A”是当使用逐对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，以与SEQ ID NO:1的Met-1比对的氨基酸开始且以与SEQ ID NO:1的Lys-119比对的氨基酸结束的该序列的片段。

- 给定fHbp序列中的结构域“A_成熟”是当使用逐对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，以与SEQ ID NO:1的Cys-20比对的氨基酸开始且以与SEQ ID NO:1的Lys-119比对的氨基酸结束的该序列的片段。

- 给定fHbp序列中的结构域“B”是当使用逐对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，以与SEQ ID NO:1的Gln-120比对的氨基酸开始且以与SEQ ID NO:1的Gly-183比对的氨基酸结束的该序列的片段。

- 给定fHbp序列中的结构域“C”是当使用逐对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，以与SEQ ID NO:1的Lys-184比对的氨基酸开始且以与SEQ ID NO:1的Gln-274比对的氨基酸结束的该序列的片段。

用于定义所述结构域的优选逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[158]，其使用默认参数(例如，缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)。在EMBOSS软件包中的needle工具方便地进行该算法[159]。

在一些实施方案中，将本发明的突变体fHbp v2或v3氨基酸序列截短以去除其结构域A。然而，通常，优选的是，突变体fHbp v2或v3氨基酸序列应当包括N-末端β-桶和C-末端β-桶两者。

在一些实施方案中，多肽包含如上所述的氨基酸序列，除了N-末端处的最多达10 个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸和/或C-末端处的最多达10 个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸缺失。

本发明的多肽通常由人工氨基酸序列(即任何天然存在的脑膜炎球菌中不存在的序列)组成。

对于因子H的亲和力可以使用表面等离振子共振(例如，如参考文献18和21-24关于固定的人fH所公开)进行定量评价。提供至少10倍、且理想地至少100倍的亲和力减少(即，解离常数K_D的增加)的突变是优选的(当在相同实验条件下相对于相同、但没有突变的多肽测量时)。

核酸

本发明提供了编码上如上所定义的本发明的多肽的核酸。

可以许多方式从基因组或cDNA文库等制备本发明的核酸，例如，通过完全或部分化学合成(例如，DNA的亚磷酰胺合成)，通过使用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸，通过连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)。

本发明的核酸可以采用各种形式，例如，单链的、双链的、载体、引物、探针的、标记的、未标记的等。

本发明的核酸优选为分离的或实质上分离的形式。

术语“核酸”包括DNA和RNA，还有其类似物，诸如含有修饰主链的类似物，还有肽核酸(PNA)等。

根据本发明的核酸可以进行标记，例如，用放射性或荧光标记进行标记。

本发明还提供了包含本发明的核苷酸序列的载体(诸如质粒)(例如克隆或表达载体，诸如适合于核酸免疫的载体)和用这样的载体转化的宿主细胞。

杀细菌应答

本发明的优选多肽可以引发针对脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。可以在小鼠中方便地测量杀细菌抗体应答，并且是疫苗效力的标准指标(例如，参见参考文献37的尾注14；还有参考文献38)。

本发明第一实施方案的多肽可优选引发针对表达v2 fHbp序列的脑膜炎奈瑟氏菌菌株(例如以下菌株中的一种或多种)杀细菌的抗体应答：961-5945、2996、96217、312294、11327、a22、gb013 (=M01-240013)、e32、m1090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、c11、m986、m2671、1000、m1096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38和/或L93/4286。杀细菌应答例如可以针对var2菌株M2091 (ATCC 13091)进行评价。

本发明第一实施方案的优选多肽可以在小鼠中引发抗体，其在血清杀细菌测定中针对菌株M2091是杀细菌的。

本发明第二实施方案的多肽可优选引发针对表达v3 fHbp序列的脑膜炎奈瑟氏菌菌株(例如菌株M1239、16889、gb355 (=M01-240355)、m3369、m3813、ngp165中的一种或多种)杀细菌的抗体应答。杀细菌应答可以例如针对已经完全测序(参见EMBL ID CP002422 [40])的var3菌株M01-240355(其为奈瑟氏菌MLST参考菌株(参考文献39中的id 19265))进行评价。

本发明第二实施方案的优选多肽可以在小鼠中引发抗体，其在血清杀细菌测定中针对菌株M01-240355是杀细菌的。

例如，包含这些多肽的免疫原性组合物可以提供>1:4的血清杀细菌滴度(其使用人补体的Goldschneider测定[41-43])，和/或提供>1:128的血清杀细菌滴度(其使用幼兔补体)。

免疫

本发明的多肽可用作免疫原性组合物的活性成分，所以本发明提供了包含本发明的多肽的免疫原性组合物。

本发明还提供在哺乳动物中产生抗体应答的方法，其包括向哺乳动物施用本发明的免疫原性组合物。所述抗体应答优选为保护性和/或杀细菌抗体应答。本发明还提供了本发明的多肽，其用于这样的方法中。

本发明还提供了用于保护哺乳动物免于奈瑟氏菌(例如脑膜炎球菌)感染的方法，其包括向哺乳动物施用本发明的免疫原性组合物。

本发明提供了本发明的多肽，其用于用作药物(例如，免疫原性组合物或疫苗)或作为诊断试剂。其还提供了本发明的核酸或多肽在制备用于预防哺乳动物中的奈瑟氏菌(例如脑膜炎球菌)感染的药物中的用途。

哺乳动物优选是人。所述人可以是成人或优选为儿童。当所述疫苗用于预防性用途时，所述人优选是儿童(例如幼童或婴儿)；当疫苗用于治疗用途时，所述人优选是成人。意图用于儿童的疫苗也可施用于成人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。

所述用途和方法特别可用于预防/治疗疾病，包括但不限于脑膜炎(特别是细菌性脑膜炎，诸如脑膜炎球菌性脑膜炎)和菌血症。例如，它们适合于针对由脑膜炎奈瑟氏菌(例如血清群B中)引起的侵袭性脑膜炎球菌疾病主动免疫个体。

治疗性治疗的效力可以通过在施用本发明的组合物之后监测奈瑟氏菌感染来测试。预防性治疗的效力可以通过在施用所述组合物之后监测针对fHbp的免疫应答来测试。本发明的组合物的免疫原性可通过向测试受试者(例如， 12-16月龄的儿童，或动物模型)施用它们，然后确定标准参数，包括血清杀细菌抗体(SBA)和ELISA滴度(GMT)来确定。通常在施用所述组合物之后约4 周确定这些免疫应答，并与施用所述组合物之前测定的值进行比较。至少4倍或8倍的 SBA增加是优选的。当施用多于一个剂量的组合物时，可以进行多于一次施用后确定。

本发明的优选组合物可以在患者中赋予抗体滴度，所述抗体滴度优于各抗原组分对于可接受百分比的人受试者的血清保护的标准。具有高于其中宿主被认为针对抗原血清转化的抗体滴度的相关抗体滴度的抗原是众所周知的并且，这样的滴度由组织诸如WHO公布。优选多于80%的统计学显著的受试者的样品发生血清转化，更优选多于90%，仍更优选多于93%，最优选96-100%。

本发明的组合物将通常直接施用于患者。直接递送可通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙)，或通过直肠、经口、阴道、局部、透皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用完成。优选在大腿或上臂进行肌内施用。注射可以经由针头(例如皮下针头)进行，但或者可以使用无针注射。肌内剂量通常为约0.5 ml。

本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫。

剂量治疗可以是单剂量时间表或多剂量时间表。多剂量可用于初次免疫时间表和/或加强免疫时间表。初次剂量时间表之后可以是加强剂量时间表。可以常规确定引发剂量之间(例如4-16周)和引发和加强剂量之间的合适时机。

本发明的免疫原性组合物将通常包括药学上可接受的载体，其可以是本身不诱导产生对接受所述组合物的患者有害的抗体的任何物质，且可以在无不当毒性的情况下施用。药学上可接受的载体可包括液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等也可存在于这样的载体中。合适运体的充分讨论可见参考文献44。

奈瑟氏菌感染机体的各个区域，所以可将本发明的组合物以各种形式制备。例如，可将所述组合物制备为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。可将所述组合物制备用于外用施用，例如，油膏、乳膏或粉末。可将所述组合物制备用于口服施用，例如，作为片剂或胶囊，或作为糖浆(任选调味的)。可将所述组合物制备为使用细粉或喷雾进行肺部施用，例如作为吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。可将所述组合物制备用于鼻腔、耳部或眼部施用，例如作为滴剂。适合于肠胃外注射的组合物是最优选的。

所述组合物优选是无菌的。其优选不含热原。其优选被缓冲的，例如在pH 6到pH 8之间，通常为约pH 7。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选使用组氨酸缓冲剂[45]。本发明的组合物相对于人可以是等张的。

免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原，以及需要的任何其它的其它指定组分。“免疫有效量”意指以单一剂量或作为一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或预防是有效的。术语“预防”意味着减少和/或消除疾病的进展，或消除疾病的发作。例如，可以引发(例如，通过接种疫苗)受试者的免疫系统以触发免疫应答和排斥感染，使得消除疾病的发作。因此，接种疫苗的受试者可以被感染，但能够比对照受试者更好地排斥感染。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽范围内。剂量治疗可以是单剂量时间表或多剂量时间表(例如，包括加强剂量)。所述组合物可与其它免疫调节剂结合施用。

本发明的组合物中可以使用的佐剂包括但不限于不溶性金属盐，水包油乳剂(例如MF59或AS03，两者均含有角鲨烯)，皂苷，LPS的无毒衍生物(诸如单磷酰脂质A或3-O-脱酰化MPL)，免疫刺激性寡核苷酸，脱毒的细菌ADP-核糖基化毒素，微粒，脂质体，咪唑并喹诺酮类，或其混合物。充当免疫刺激剂的其它物质公开于参考文献46的第7章。

使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂是特别优选的，并且多肽通常吸附至这些盐。这些盐包括氧基氢氧化物和羟基磷酸盐(例如参见参考文献46的第8和9章)。所述盐可采取任何合适的形式(例如，凝胶、晶体、无定形等)。

其它抗原性组分

本发明的组合物包括突变体v2和/或v3 fHbp序列。所述组合物应当不包括抗原的复杂或未定义的混合物是有用的，例如，优选组合物中不包括外膜囊泡。本发明的多肽优选在异源宿主中重组表达，然后纯化。

除了包括fHbp序列以外，本发明的组合物还可包括一种或多种其它奈瑟氏菌免疫原，因为靶向每种细菌多于一种免疫原的疫苗降低选择逃逸突变体的可能性。因此，组合物可包括第二多肽，当施用于哺乳动物时，所述第二多肽引发针对脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。所述第二多肽可以是脑膜炎球菌 fHbp，但经常不是fHbp，例如，其可以是例如NHBA序列、NadA序列等。

任何这样的进一步奈瑟氏球菌免疫原可以作为本发明的突变体v2或v3 fHbp的单独多肽呈现或可以作为与修饰fHbp的融合多肽呈现。例如，脑膜炎球菌936多肽和fHbp多肽的融合体是已知的[55,56]。包含SEQ ID NO:44和/或SEQ ID NO:45的融合蛋白是特别优选的，任选其中SEQ ID NO:44和/或45如本文别处所述修饰最多达5个单个氨基酸变化(即，1、2、3、4或5个单个氨基酸取代、缺失和/或插入)。

本发明的组合物可以包括NHBA抗原。NHBA抗原作为基因NMB2132包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[47]中(GenBank登录号GI：7227388；本文为SEQ ID NO:6)。从那时起已经公开了来自许多菌株的NHBA抗原的序列。例如，NHBA的等位基因形式可见于参考文献48的图5和15中和参考文献1的实施例13和图21中(其中的SEQ ID 3179至3184)。也已经报道了NHBA抗原的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的287抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:6具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:6的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:6的表位。在施用于受试者之后，本发明的最有用的NHBA抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于受试者之后，用于本发明使用的有利的NHBA抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括NadA抗原。NadA抗原作为基因NMB1994包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[47]中(GenBank登录号GI：7227256；本文为SEQ ID NO:7)。从那时起已经公开了来自许多菌株的NadA抗原的序列，并且已经充分记录了该蛋白作为奈瑟氏菌黏附素的活性。也已经报道了NadA的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的NadA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:7具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:7的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:7的表位。在施用于受试者之后，本发明的最有用的NadA抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于受试者之后，用于本发明使用的有利的NadA抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO:15是一种这样的片段。

本发明的组合物可以包括NspA抗原。NspA抗原作为基因NMB0663包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[47]中(GenBank登录号GI：7225888；本文为SEQ ID NO:8)。该抗原先前从参考文献49和50已知。从那时起已经公开了来自许多菌株的NspA抗原的序列。也已经报道了NspA的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的NspA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:8具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:8的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:8的表位。在施用于受试者之后，本发明的最有用的NspA抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于受试者之后，用于本发明使用的有利的NspA抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括脑膜炎球菌HmbR抗原。全长HmbR序列作为基因NMB1668包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[47]中(本文为SEQ ID NO:9)。本发明可以使用包含全长HmbR序列的多肽，但其将经常使用包含部分HmbR序列的多肽。因此，在一些实施方案中，根据本发明使用的HmbR序列可以包含与SEQ ID NO:9具有至少i%序列同一性的氨基酸序列，其中i的值为50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方案中，根据本发明使用的HmbR序列可以包含来自SEQ ID NO:9的至少i个连续氨基酸的片段，其中j的值是7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高。在其它实施方案中，根据本发明使用的HmbR序列可以包含(i)与SEQ ID NO:9具有至少i%序列同一性的氨基酸序列和/或(ii)包含来自SEQ ID NO:9的至少j个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。j个氨基酸的优选片段包含来自SEQ ID NO:9的表位。这样的表位将通常包含位于HmbR的表面上的氨基酸。有用的表位包括具有参与HmbR与血红蛋白的结合的氨基酸的那些，因为结合至这些表位的抗体可以阻断细菌结合至宿主血红蛋白的能力。参考文献51中研究了HmbR的拓扑学及其关键功能残基。在施用于受试者之后，本发明的最有用的HmbR抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:9组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于受试者之后，用于本发明使用的有利的HmbR抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括NhhA抗原。NhhA抗原作为基因NMB0992包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[47]中(GenBank登录号GI：7226232；本文为SEQ ID NO:10)。从那时起已经公开了来自许多菌株的NhhA抗原的序列，例如参考文献48和52，并且已经报道了NhhA的各种免疫原性片段。其也被称为Hsf。用于本发明使用的优选的NhhA抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:10具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:10的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:10的表位。在施用于受试者之后，本发明的最有用的NhhA抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:10组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于受试者之后，用于本发明使用的有利的NhhA抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括App抗原。App抗原作为基因NMB1985包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[47]中(GenBank登录号GI：7227246；本文为SEQ ID NO:11)。从那时起已经公开了来自许多菌株的App抗原的序列。也已经报道了App的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的App抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:11具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:11的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:11的表位。在施用于受试者之后，本发明的最有用的App抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:11组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于受试者之后，用于本发明使用的有利的App抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括Omp85抗原。Omp85抗原作为基因NMB0182包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[47]中(GenBank登录号GI：7225401；本文为SEQ ID NO:12)。从那时起已经公开了来自许多菌株的Omp85抗原的序列。关于Omp85的进一步信息公开于参考文献53和54。也已经报道了Omp85的各种免疫原性片段。用于本发明使用的优选的Omp85抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:12具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:12的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:12的表位。在施用于受试者之后，本发明的最有用的Omp85抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:12组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。在施用于受试者之后，用于本发明使用的有利的Omp85抗原可以引发杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明的组合物可以包括936抗原。936抗原作为基因NMB2091包括于脑膜炎球菌血清群B菌株MC58的公开基因组序列[47]中(本文为SEQ ID NO:13)。用于本发明使用的优选的936抗原包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:13具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:13的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:13的表位。在施用于受试者之后，本发明的最有用的936抗原可以引发可以结合至由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成的脑膜炎球菌多肽的抗体。936抗原是fHbp的良好融合伴侣(例如，参见参考文献55和56)。

组合物可以包含：包含SEQ ID NO:14的多肽；包含SEQ ID NO:15的多肽；和本发明的包含突变体fHbp v2氨基酸序列和SEQ ID NO:13的多肽(参见参考文献55和56)。

组合物可以包含：包含SEQ ID NO:14的多肽；包含SEQ ID NO:15的多肽；和本发明的包含突变体fHbp v3氨基酸序列和SEQ ID NO:13的多肽(参见参考文献55和56)。

在一些实施方案中，将本发明的多肽与进一步脑膜炎球菌fHbp序列组合。具体而言，可以将v2多肽与v1和/或v3多肽组合以增加菌株覆盖谱[162]。因此，组合物可以包含：(i)本发明的包含突变体fHbp v2氨基酸序列的多肽；和(ii)v1 fHbp多肽和/或v3 fHbp多肽。在其它实施方案中，本发明的多肽可以包含：(i)突变体fHbp v2氨基酸序列和(ii) v1 fHbp氨基酸序列和/或v3 fHbp氨基酸序列。因此，可以将v1和/或v3序列与突变体v2序列作为分开实体组合于组合物中，或融合多肽内。

类似地，可以将v3多肽与v1和/或v2多肽组合以增加菌株覆盖谱[162]。因此，组合物可以包含：(i)本发明的包含突变体fHbp v3氨基酸序列的多肽；和(ii)v1 fHbp多肽和/或v2 fHbp多肽。在其它实施方案中，本发明的多肽可以包含：(i)突变体fHbp v3氨基酸序列和(ii) v1 fHbp氨基酸序列和/或v2 fHbp氨基酸序列。因此，可以将v1和/或v2序列与突变体v3序列作为分开实体组合于组合物中，或融合多肽内。

而且，可以将突变体v2和v3多肽与彼此组合以增加菌株覆盖谱。因此，组合物可以包含：(i)本发明的包含突变体fHbp v2氨基酸序列的多肽；(ii)本发明的包含突变体fHbp v3氨基酸序列的多肽；和(iii) fHbp v1多肽。在其它实施方案中，本发明的多肽可以包含：(i)突变体fHbp v2氨基酸序列，(ii)突变体v3 fHbp氨基酸序列和(iii) fHbp v1氨基酸序列。因此，可以将突变体v2和v3序列与v1序列作为分开实体组合于组合物中，或融合多肽内。v1序列可以是野生型序列或突变体序列。

v1 fHbp可以包含(a)与SEQ ID NO:16具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:16的片段。上面给出关于‘k’和片段的信息。该片段将通常包括来自SEQ ID NO:16的至少一个表位，且v1 fHbp多肽将包括本发明的v2或v3氨基酸序列中不存在的至少一个表位，使得由v1 fHbp引发的抗体可以识别v1菌株。理想地，v1 fHbp可以引发针对v1菌株、例如针对菌株MC58(可作为‘BAA-335’得自ATCC)杀细菌的抗体。v1 fHbp可以包括破坏其结合至fH的能力的氨基酸突变。

V2 fHbp可以包含(a)与SEQ ID NO:5具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:5的片段。上面给出关于‘k’和片段的信息。该片段将通常包括来自SEQ ID NO:5的至少一个表位，且v2 fHbp多肽将包括本发明的v3氨基酸序列中不存在的至少一个表位，使得由v2 fHbp引发的抗体可以识别v2菌株。理想地，v2 fHbp可以引发针对v2菌株、例如针对菌株M2091 (ATCC 13091)杀细菌的抗体。v2 fHbp可以是第一个实施方案的多肽。

v3 fHbp可以包含(a)与SEQ ID NO:17具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:17的片段。上面给出关于‘k’和片段的信息。该片段将通常包括来自SEQ ID NO:17的至少一个表位，且v3 fHbp多肽将包括本发明的v2氨基酸序列中不存在的至少一个表位，使得由v3 fHbp引发的抗体可以识别v3菌株。理想地，v3 fHbp可以引发针对v3菌株、例如针对菌株M01-240355杀细菌的抗体。v3 fHbp可以是第二个实施方案的多肽。

因此，例如，本发明提供了多肽，其在单一多肽链内包含以下中的每一种：(i) fHbp v1氨基酸序列；(ii)突变体fHbp v2氨基酸序列；和(iii)突变体fHbp v3氨基酸序列。施用于宿主动物之后，所述多肽可以引发结合至以下每一种的抗体：由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的脑膜炎球菌fHbp多肽；由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的脑膜炎球菌fHbp多肽；和由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成的脑膜炎球菌fHbp多肽。(i)的序列可以包含与SEQ ID NO:16具有至少k%同一性的氨基酸序列。(ii)的序列可以包含与SEQ ID NO:5具有至少k%同一性的氨基酸序列，但在以下残基中的一个或多个处不同于SEQ ID NO:5：S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240。(iii)的序列可以包含与SEQ ID NO:17具有至少k%同一性的氨基酸序列，但在以下残基中的一个或多个处不同于SEQ ID NO:17：S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243。在一个优选的实施方案中，(i)的序列包含SEQ ID NO:16，其任选地通过最多达5个单一氨基酸变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入)进行修饰；(ii)的序列包含SEQ ID NO:45，其任选地通过最多达5个单一氨基酸变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入)进行修饰，条件是这样的氨基酸变化不逆转这些序列中相对于野生型序列的突变；且(iii)的序列包含SEQ ID NO:44，其任选地通过最多达5个单一氨基酸变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入，例如以得到SEQ ID NO:53)进行修饰，条件是这样的氨基酸变化不逆转这些序列中相对于野生型序列的突变。氨基酸序列(i)、(ii)和(iii)可以在多肽中以N-至C-末端的任何顺序排列，而优选为顺序(ii)、然后(iii)、然后(i)。例如，本发明提供了式–A-B-C–的多肽，其中：A包含SEQ ID NO:45，其任选地通过最多达3个单一氨基酸取代进行修饰；B包含SEQ ID NO:44，其任选地通过最多达3个单一氨基酸取代进行修饰；且C包含SEQ ID NO:16，其任选地通过最多达3个单一氨基酸取代(例如，破坏与fH的结合的取代)进行修饰。优选的C包含SEQ ID NO:49，其中残基Arg-34被突变为Ser，如对于参考文献21中的‘R41S’突变所报道。

特别优选的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:47。该序列从N-末端至C-末端包括：突变体v2 (SEQ ID NO:45)；突变体v3 (SEQ ID NO:44)；和突变体v1 (SEQ ID NO:49)。在这三种突变体fHbp序列之间，在每种情况下都存在接头序列，SEQ ID NO:50。在一个实施方案中，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:48，其具有N-末端甲硫氨酸，然后SEQ ID NO:37，然后SEQ ID NO:47。

SEQ ID NO:47(单独，或在SEQ ID NO:48内)可以任选地通过最多达5个单一氨基酸变化(即1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入)进行修饰，条件是这样的氨基酸变化不逆转v1、v2和v3序列中相对于野生型序列的突变，即SEQ ID NO:47的氨基酸V32、R123、V285、R379和S543不应当被突变为S32、L123、S285、L379和R543。然而，在一个例外实施方案中，V285可以回复至S285和/或V32可以回复至S32。

突变体融合体可以理想地引发结合至以下中每一种的抗体：由氨基酸序列SEQ ID NO:46组成的野生型v1脑膜炎球菌fHbp多肽；由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的野生型v2脑膜炎球菌fHbp多肽；和由氨基酸序列SEQ ID NO:40组成的野生型v3脑膜炎球菌fHbp多肽。

除了奈瑟氏菌多肽抗原以外，所述组合物可包括用于针对其它疾病或感染免疫的抗原。例如，所述组合物可包括以下其它抗原中的一种或多种：

- 来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，诸如参考文献57中公开的来自血清群C的糖(还参见参考文献58)或参考文献59中的糖。

- 来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如，60，61，62]。

- 来自甲型肝炎病毒，诸如灭活病毒的抗原[例如，63，64]。

- 来自乙型肝炎病毒的抗原，诸如表面和/或核心抗原[例如，64，65]。

- 白喉抗原，诸如白喉类毒素[例如参考文献66的第3章]，例如CRM₁₉₇突变体[例如，67]。

- 破伤风抗原，诸如破伤风类毒素(例如参考文献66的第4章)。

- 来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，诸如来自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合(例如参考文献68和69)。

- 来自流感嗜血杆菌B（Haemophilus influenzae B）的糖抗原[例如58]。

- 脊髓灰质炎抗原[例如，70，71]，诸如IPV。

- 麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原(例如参考文献66的第9、10和11章)。

- 流感抗原(例如参考文献66的第19章]，诸如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

- 来自卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[例如72]。

- 来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)的蛋白抗原[例如73，74]。

- 来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)的糖抗原。

- 来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)的抗原[例如74，75，76]。

- 来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原[例如77]。

所述组合物可以包含这些其它抗原中的一种或多种。

必要时，可使毒性蛋白抗原脱毒(例如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[69])。

当所述组合物中包括白喉抗原时，优选还包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当包括破伤风抗原时，优选还包括白喉和百日咳抗原。类似地，当包括百日咳抗原时，优选还包括白喉和破伤风抗原。DTP组合因此是优选的。

糖抗原优选为缀合物的形式。下文更详细讨论缀合物的载体蛋白。

组合物中的抗原通常各以至少1μg/ml的浓度存在。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。

本发明的免疫原性组合物可以治疗性地(即，治疗已有感染)或预防性地(即，预防将来的感染)使用。

作为本发明的免疫原性组合物中使用蛋白抗原的替代方案，可使用编码该抗原的核酸(其可以是RNA，诸如自复制RNA，或DNA，诸如质粒)。

在一些实施方案中，除了fHbp序列以外，本发明的组合物还包含脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中的1、2、3或4种的缀合的荚膜糖抗原。在其它实施方案中，除了fHbp序列以外，本发明的组合物还包含至少一种缀合的肺炎球菌荚膜糖抗原。

脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A

目前的血清群C疫苗(Menjugate™ [57，78]，Meningitec™和NeisVac-C™)包括缀合的糖。Menjugate™和Meningitec™具有与CRM₁₉₇载体缀合的寡糖抗原，而NeisVac-C™使用与破伤风类毒素载体缀合的完整多糖(脱-O-乙酰化)。Menactra™疫苗含有血清群Y、W135、C和A各自的缀合的荚膜糖抗原。

本发明的组合物可包括脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A中的一种或多种的荚膜糖抗原，其中所述抗原与载体蛋白缀合和/或是寡糖。例如，所述组合物可包括来自 血清群C；血清群A和C；血清群A、C和W135；血清群A、C和Y；血清群C、W135和Y；或来自血清群A、C、W135和 Y中的所有四种的荚膜糖抗原。

每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的典型量为1μg至20μg，例如，约1μg、 约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(表示为糖)。

当混合物包含来自血清群A和C的荚膜糖时，MenA糖∶MenC糖的比率(w/w)可以为大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。在混合物包含来自血清群Y和血清群C和W135之一或两者的荚膜糖时，MenY 糖:MenW135糖的比率(w/w)可以大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)，和/或MenY糖:MenC糖的比率(w/w)可以小于1(例如，1:2、1:3、1:4、1:5或更低)。来自血清群A:C:W135:Y的糖的优选比率(w/w)为：1:1:1:1；1:1:1:2；2:1:1:1；4:2:1:1；8:4:2:1；4:2:1:2；8:4:1:2；4:2:2:1；2:2:1:1；4:4:2:1；2:2:1:2；4:4:1:2；和2:2:2:1。来自血清群C:W135:Y的糖的优选比率(w/w)为：1:1:1；1:1:2；1:1:1；2:1:1；4:2:1；2:1:2；4:1:2；2:2:1；和2:1:1。优选使用实质上相等质量的各种糖。

可以使用寡糖形式的荚膜糖。这些通过以下方便地形成：对纯化的荚膜多糖进行片段化(例如通过水解)，随后通常纯化期望大小的片段。

优选进行多糖的片段化，以使寡糖的最终平均聚合度(DP)小于30(例如，对于血清群A，10至20，优选约10；对于血清群W135和Y，15至25，优选约 15-20；对于血清群C，12至22；等)。DP可通过离子交换层析或通过比色测定方便地测量[79]。

如果进行水解，则通常对水解产物进行筛分，以去除短长度寡糖[58]。这可以各种方式诸如超滤和随后离子交换层析实现。对于血清群A，优选去除聚合度小于或等于约6的寡糖；对于血清群W135和Y，优选去除聚合度小于约4的寡糖。

参考文献78中公开了优选的MenC糖抗原，如Menjugate™中所使用。

所述糖抗原可以进行化学修饰。这对于降低血清群A的水解是特别有用的[80]。可以进行脑膜炎球菌糖的脱-O-乙酰化。对于寡糖，修饰可发生在解聚之前或之后。

当本发明的组合物包括MenA糖抗原时，所述抗原优选为修饰糖，其中天然糖上的一个或多个羟基被封闭基团所替代[80]。该修饰改善对水解的耐受性。

共价缀合

本发明的组合物中的荚膜糖通常与载体蛋白缀合。通常，缀合增强糖的免疫原性，因为所述缀合可将糖从T-非依赖性抗原转化为T-依赖性抗原，因此引发免疫记忆。缀合对于儿科疫苗是特别有用的，并且是众所周知的技术。

典型的载体蛋白是细菌毒素，诸如白喉或破伤风毒素或类毒素或其突变体。CRM₁₉₇白喉毒素突变体[81]是有用的，并且是PREVNAR™产品中的载体。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白复合物[82]、合成肽[83,84]、热休克蛋白[85,86]、百日咳蛋白[87,88]、细胞因子[89]、淋巴因子[89]、激素[89]、生长因子[89]、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4⁺ T细胞表位的人工蛋白[90]诸如N19[91]、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[92-94]、肺炎球菌溶血素[95]或其无毒衍生物[96]、肺炎球菌表面蛋白PspA[97]、摄铁蛋白[98]、来自艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)的毒素A或B[99]、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白 A(rEPA)[100]等。

可以使用任何合适的缀合反应，在必要时使用任何合适的接头。

糖通常将在缀合前活化或官能化。活化可涉及例如氰基化剂，诸如CDAP(例如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶鎓[103、104等])。其它合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU等。

可使用任何已知程序，例如参考文献103和104中描述的程序，经由接头基团进行连接。一种类型的连接涉及多糖的还原胺化，将所得氨基与己二酸接头基团的一个末端缀合，然后将蛋白缀合至己二酸接头基团的另一末端[105，106]。其它接头包括B-丙酰胺基[107]、硝基苯基-乙胺[108]、卤代酰基卤化物[109]、糖苷键[110]、6-氨基己酸[111]、ADH[112]、C₄至C₁₂部分[113]等。作为使用接头的替代方案，可使用直接连接。与蛋白的直接连接可包括氧化多肽，随后与蛋白还原胺化，如例如参考文献114和115中所述。

优选涉及以下步骤的方法：将氨基引入糖中(例如用-NH₂替代末端=O基团)，随后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生化，并且与载体蛋白反应。另一种优选的反应使用CDAP活化蛋白D载体，例如MenA或MenC。

外膜囊泡

本发明的一些组合物不包括抗原的复杂或未定义的混合物，这是OMV的典型特征。然而，本发明可以与OMV结合使用，因为已发现fHbp增强其效力[4]，特别是通过在用于OMV制备的菌株中过表达本发明的多肽。还参见下文。

通常使用该方法来改善脑膜炎奈瑟氏菌血清群B微囊泡[116]、“天然 OMV”[117]、小泡和外膜囊泡[例如参考文献118-123等]的制备。这些可以从已经遗传操作的细菌制备[124-127]，例如，以增加免疫原性(例如超表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。它们可以从高发泡菌株制备[128-131]。可以包括来自非致病性奈瑟氏菌的囊泡[132]。可以不使用洗涤剂来制备OMV[133，134]。它们可以在其表面表达非奈瑟氏菌蛋白[135]。它们可以是LPS耗竭的。它们可以与重组抗原混合[118，136]。可使用来自具有不同I类外膜蛋白亚型的细菌的囊泡，例如，使用两种不同的遗传工程改造的囊泡群体(各自展示三种亚型)的六种不同亚型[137,138]，或使用三种不同的遗传工程改造的囊泡群体(各自展示三种亚型)的九种不同亚型等。有用的亚型包括：P1.7,16；P1.5-1,2-2；P1.19,15-1；P1.5-2,10；P1.12-1,13；P1.7-2,4；P1.22,14；P1.7-1,1；P1.18-1,3,6。

宿主细胞

本发明提供了表达本发明的多肽的细菌。所述细菌可以是脑膜炎球菌或大肠杆菌（E.coli）。所述细菌可以组成型表达所述多肽，但是在一些实施方案中，表达可以在诱导型启动子的控制下。所述细菌可以超表达所述多肽(参见参考文献139)。所述多肽的表达理想地不是相可变的。

本发明还提供了从本发明的细菌(特别是从脑膜炎球菌)制备的外膜囊泡。其还提供了从本发明的细菌产生囊泡的方法。从这些菌株制备的囊泡优选包含本发明的多肽，其在囊泡中应当为免疫可及的形式，即可以结合至本发明的纯化多肽的抗体也应当能够结合存在于囊泡中的多肽。

这些外膜囊泡包括通过破坏脑膜炎球菌外膜或使之发泡以由其形成包括外膜蛋白组分的囊泡而获得的任何蛋白脂质体囊泡。因此，该术语包括OMV(有时被称为“小泡”)、微囊泡(MV[116])和“天然OMV”(“NOMV”[117])。

MV和NOMV是天然存在的膜囊泡，其在细菌生长时自发形成，且释放至培养基中。可以通过以下方法获得MV：在肉汤培养基中培养奈瑟氏菌，将全细胞与肉汤培养基中的较小MV分离(例如，通过过滤或通过低速离心以仅沉淀细胞而不沉淀较小囊泡)，然后从细胞耗竭的培养基收集MV(例如，通过过滤，通过差速沉淀或MV的聚集，通过高速离心以沉淀MV)。通常可根据培养基中产生的MV的量来选择用于产生MV的菌株，例如，参考文献130和131描述了具有高MV产量的奈瑟氏菌。

OMV从细菌人工制备，并且可使用洗涤剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或通过非洗涤剂方式(例如参见参考文献134)制备。用于形成OMV的技术包括：用胆酸盐洗涤剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，用脱氧胆酸钠[140和141]优选用于处理奈瑟氏菌)在不沉淀洗涤剂的足够高pH下[142]处理细菌。其它技术基本上可以在洗涤剂不存在的情况下[134]使用技术诸如超声处理、均质化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、French压制、混合等来进行。不用洗涤剂或使用低浓度洗涤剂的方法可以保留有用的抗原，诸如NspA和fHbp[134]。因此，方法可以使用含有约0.5％或更低、例如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或零浓度的脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液。

用于制备OMV的有用方法描述于参考文献143中，并且涉及对粗制OMV 超滤，而非替代高速离心。该方法可以涉及在超滤进行之后的超离心的步骤。OMV也可以使用参考文献154中描述的两阶段大小过滤方法进行纯化。

本发明所用的囊泡可以从任何脑膜炎球菌菌株制备。所述囊泡通常来自血清群B菌株，但也可能从除了B以外的血清群(例如，参考文献142描述了血清群A的方法)诸如A、C、W135或Y菌株来制备。所述菌株可以是任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如，L1；L2；L3；L3,3,7；L10；等)。所述脑膜炎球菌可以来自任何合适的谱系，包括高侵袭性和高毒力谱系，例如以下七种高毒力谱系中的任一种：亚组I；亚组III；亚组IV-1；ET-5复合物；ET-37复合物；A4簇；谱系3。

除了编码本发明的多肽以外，本发明的细菌可以具有一种或多种进一步修饰。例如，它们可以具有修饰的fur基因[144]。同时porA和cps敲除可以上调nspA表达。用于OMV产生的脑膜炎奈瑟氏菌的进一步敲除突变体公开于例如参考文献150中。参考文献145描述了从经修饰以表达六种不同的PorA亚型的菌株构建囊泡。也可使用通过敲除参与LPS生物合成的酶而实现的具有低内毒素水平的突变体奈瑟氏菌[146，147]。本发明可以使用经工程改造以降低或关闭参与赋予LPS的脂质A部分毒性的至少一种基因、具体地lpxl1基因的表达的突变体奈瑟氏菌[148]。类似地，本发明可以使用经工程改造以降低或关闭参与荚膜多糖合成或出口的至少一种基因、具体地synX和/或ctrA基因的表达的突变体奈瑟氏菌。这些或其它突变体都可用于本发明。

因此，在一些实施方案中，本发明使用的菌株可以表达多于一种PorA亚型。先前已经构建了6价和9价PorA菌株。所述菌株可以表达PorA亚型中的2、3、4、5、6、7、8 或9种：P1.7,16；P1.5-1,2-2；P1.19,15-1；P1.5-2,10；P1.12-1,13；P1.7-2,4；P1.22,14；P1.7-1,1和/或P1.18-1,3,6。在其它实施方案中，可以针对PorA表达下调菌株，例如，其中PorA 的量已经相对于野生型水平(例如相对于菌株H44/76)减少了至少20％(例如，>30%、>40%、>50%、>60%、>70%、>80%、>90%、>95%等)，或者甚至被敲除。

在一些实施方案中，菌株可以超表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白。例如，菌株可以超表达NspA、蛋白287[118]、fHbp[139](包括本发明的fHbp)、TbpA 和/或TbpB[136]、Cu,Zn-超氧化物歧化酶、HmbR等。

可将编码本发明的多肽的基因整合入细菌染色体中，或以附加体形式存在，例如在质粒内。

有利地，对于囊泡产生，可以将脑膜炎球菌遗传工程改造，以确保多肽的表达不发生相变。用于减少或消除脑膜炎球菌中的基因表达的相变的方法公开于参考文献149中。例如，可将基因置于组成型或诱导型启动子的控制下，或通过去除或替代负责该相变的DNA基序。

在一些实施方案中，菌株可以包括参考文献122、124、128和150中公开的敲除和/或超表达突变中的一种或多种。例如，遵循这四个文件中的指导和命名，用于下调和/或敲除的有用基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；或(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB、SynX和/或SynC。

在一些实施方案中，当使用突变体菌株时，其可以具有以下特征中的一种或多种或所有：(i)下调或敲除的LgtB和/或GalE以截短脑膜炎球菌LOS；(ii)上调的TbpA；(iii)上调的NhhA；(iv)上调的Omp85；(v)上调的LbpA；(vi)上调的NspA；(vii)敲除的PorA；(viii)下调或敲除的FrpB；(ix)下调或敲除的Opa；(x)下调或敲除的Opc；(xii)缺失的cps基因复合体。截短的LOS可以是不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位的截短的LOS，例如，其可以是半乳糖缺陷的LOS。所述LOS可以不具有α链。

根据用于制备囊泡的脑膜炎球菌菌株，它们可包括或不包括菌株的天然fHbp抗原[151]。

在一个优选的实施方案中，脑膜炎球菌不表达功能性MltA蛋白。如参考文献152和153中所讨论，脑膜炎球菌中的MltA(膜结合的裂解性糖基转移酶，也称为GNA33)的敲除提供了这样的细菌，其将大量膜囊泡自发释放入培养基，它们可以容易地从所述培养基纯化。例如，所述囊泡可以使用参考文献154的两阶段大小过滤方法进行纯化，所述方法包括：(i)第一过滤步骤，其中囊泡基于它们不同的大小与细菌分离，其中囊泡通入滤液；和(ii)第二过滤步骤，其中囊泡保留于保留物中。所述MltA突变(下调或敲除)已经用于'GMMA'疫苗中[155]，并且可以方便地与具体地至少一种参与使得LPS的脂质A部分有毒的基因(特别是lpxl1)和/或至少一种参与荚膜多糖合成或输出的基因(特别是synX和/或ctrA基因)的进一步下调或敲除进行组合。GMMA(膜抗原的广义模块)是由脑膜炎球菌菌株产生的遗传脱毒的OMV，所述菌株已经工程改造以释放具有降低的反应原性和增加的免疫原性的GMMA。当在单核细胞活化测试(MAT)中测试时，GMMA诱导比OMV更少的促炎细胞因子。

使用该方法的‘GMMA’疫苗的优选脑膜炎球菌菌株表达本发明的突变体v2 fHbp和/或突变体v3 fHbp，并且表达可由强启动子驱动。该菌株释放的囊泡包括免疫原性形式的突变体v2和/或v3 fHbp蛋白，并且囊泡的施用可以提供杀细菌抗体应答，如参考文献155中所讨论。该菌株也可以表达v1 fHbp，或者可以替代提供v1 fHbp作为可溶形式的单独重组蛋白(并且v1 fHbp可以是野生型或突变体序列，例如经突变，以破坏其结合至fH的能力，如上所讨论)。本发明提供这样的菌株，并且还提供了这些菌株释放的囊泡，例如如菌株的生长之后从培养基所纯化。用于在这些菌株中表达的优选的v2突变体具有如本文所讨论的S32和/或L123处的突变，并且用于在这些菌株中表达的优选的v3突变体具有如本文所讨论的S32和/或L126处的突变。因此，从表达这些v2和v3突变体fHbp序列的脑膜炎球菌制备的囊泡是用于本发明的疫苗中的特别优选的免疫原。用于以该方式诱变的有用的野生型v2序列包含SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:54(包含ΔG形式SEQ ID NO:55)，并且以该方式诱变的有用的野生型v3序列包含SEQ ID NO:52。

用于这样的菌株中的有用的启动子包括参考文献156和157中公开的那些。例如，所述启动子可以是：(a)来自孔蛋白基因，优选porA或porB，特别是来自脑膜炎奈瑟氏菌的启动子；或(b) rRNA基因启动子(诸如16S rRNA基因)，特别是来自脑膜炎奈瑟氏菌。当使用脑膜炎球菌孔蛋白启动子时，其优选来自porA，并且甚至更特别是来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域，和/或来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域(优选地，其中-10区域和-35区域由12-20个核苷酸的间插序列分开，并且其中所述间插序列不含聚-G序列或包括具有不超过八个连续G核苷酸的聚-G序列)。当使用rRNA基因启动子时，其可以包含更具体地(i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域和/或(ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。也可使用(a)和(b)的杂合体，例如以具有来自porA启动子的-10区域和来自rRNA基因启动子的-35区域(其可以是共有的-35区域)。因此，有用的启动子可以是这样的启动子，其包括(i)来自(特别是脑膜炎球菌)rRNA基因的-10区域和来自(特别是脑膜炎球菌)porA基因的-35区域，或(ii)来自(特别是脑膜炎球菌)porA基因的-10区域和来自(特别是脑膜炎球菌)rRNA基因的-35区域。

如果LOS存在于囊泡中，可处理囊泡，以便连接其LOS和蛋白组分(“泡内”缀合[150])。

通用

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括额外物质，例如X+Y。提及“包含(comprising)”(或“包含(comprises)”等)可以任选地被提及“由...组成(consisting of)”(或“由…组成(consists of)”等)替代。术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制至要求保护的发明的指定材料或步骤，和“不实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。

与数值x相关的术语“约”是任选的，并且意指，例如x±10％。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。

“序列同一性”可以通过MPSRCH程序(Oxford Molecular)中执行的Smith-Waterman同源性检索算法使用仿射缺口检索(参数为缺口开放罚分＝12和缺口延伸罚分＝1)确定，但优选通过Needleman-Wunsch全局比对算法[158]使用默认参数(例如，缺口开放罚分＝10.0和缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)确定。在EMBOSS软件包中的needle工具方便地进行该算法[159]。当应用是指与具体SEQ ID的序列同一性，应当经该SEQ ID的全长来计算同一性。

关于多肽序列的术语“片段”意味着该多肽是全长蛋白的一部分。这样的片段可以具有与全长蛋白共同的定性生物活性，例如，片段可含有或编码一个或多个表位，诸如免疫表位，其允许针对该片段产生与全长序列类似的免疫应答。多肽片段与天然蛋白相比通常缺失氨基(N)末端部分和/或羧基(C)末端部分，但其中该片段的剩余氨基酸序列与天然蛋白的氨基酸序列是相同的。多肽片段可以含有，例如：约8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262个连续氨基酸，包括参考多肽序列的两者之间的所有整数，例如参考多肽序列的50和260、50和255、50和250、50和200、50和150之间的所有整数个连续氨基酸。术语片段明确排除全长fHbp多肽及其成熟脂蛋白。

血清群之后，脑膜炎球菌分类包括血清型、血清亚型和然后免疫型，并且标准命名法列出血清群、血清型、血清亚型和免疫型，其各自通过冒号隔开，例如B:4:P1.15:L3,7,9。在血清群B内，一些谱系经常引起疾病(高侵袭性)，一些谱系引起比其它谱系更严重形式的疾病(高毒力)，其它很少引起疾病。识别七种高毒力谱系，即亚组I、III和IV-1、ET-5复合物、ET-7复合物、A4簇和谱系3。这些已经通过多基因座酶电泳(MLEE)定义，但多基因座序列分型(MLST)也已经用于分类脑膜炎球菌。四种主要的高毒力簇是ST32、ST44、ST8和ST11复合物。

通常，本发明不涵盖参考文献2、3、5、6、7、160、161、162、163、164、165、166和167中具体公开的各种fHbp序列。

附图简述

图1显示fHbp变体对胰凝乳蛋白酶切割的不同灵敏度。箭头显示全长fHbp蛋白的位置。

图2显示v2突变体的蛋白质印迹分析。泳道为：(1和2)重组纯化的v2野生型；(4) v2野生型裂解物；(5)突变体#l；(6)突变体#2；(7)突变体#4；(8)突变体#5；(9)突变体#7；(10)突变体#8；(11)突变体#12；(12)突变体#14；(13)突变体#15；(14)fHbp var2 NΔG-trx对照，即v2蛋白，其中N-末端序列GPDSDRLQQRR (SEQ ID NO:37)被GSKDISS (SEQ ID NO:38)替代。泳道2-14包括胰凝乳蛋白酶。M是分子标记物。

图3显示v2突变体的进一步蛋白质印迹分析。泳道为：(1和2)突变体#3；(3和4)突变体#6；(5和6)突变体#9；(7和8)突变体#10；(9和10)突变体#13；(11和12) Δgono；(13和14) v2野生型；(15和16)突变体#22。奇数泳道为不与胰凝乳蛋白酶孵育的蛋白，而偶数泳道为与胰凝乳蛋白酶孵育的蛋白。‘Δgono’蛋白是重组v2，其中已经去除N-末端序列(SEQ ID NO:37)。

图4显示v2突变体的进一步蛋白质印迹分析。泳道为：(1和2)突变体#11；(3和4) N-trx；(5-7)突变体#19；(8和9)突变体#20；(10和11)突变体#21。泳道2、4、7、9和11，与胰凝乳蛋白酶孵育的蛋白，而其它泳道没有胰凝乳蛋白酶。‘N-trx’蛋白是重组v2，其中N-末端序列(SEQ ID NO:37)被SEQ ID NO:39替代。

图5显示野生型和S58V/L149R突变体v2 fHbp的DSC结果。C-末端结构域不受突变影响，但N-末端结构域的Tm增强>20℃(用箭头标记)。y-轴显示Cp (kcal/mol/℃)，且x-轴显示温度(℃)。

图6显示野生型(实线)和突变体(虚线) v2 fHbp的SPR响应。

图7显示作为野生型(顶部)或具有各种突变的v3 fHbp的SPR响应。

图8显示SEQ ID NO:48的三重融合蛋白的DSC结果。轴如图5中。

本发明的具体实施方案

本发明提供了以下具体编号的实施方案：

1. 突变体v3或v2 fHbp，其相对于野生型fHbp具有增加的稳定性且，优选地，还对于人因子H比对于野生型fHbp具有更低的亲和力；

例如：

(A)包含突变体fHbp v2氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性和/或包含SEQ ID NO:5的至少7个氨基酸长且含有(b)中列出的残基中的至少一个的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下残基中的一个或多个处不同于SEQ ID NO:5：32、33、39、41、69、100、113、122、123、124、125、126、127、128、151、239和/或240；条件是：

• 如果突变体fHbp v2氨基酸序列包括仅残基32处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v2氨基酸序列包括仅残基113处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v2氨基酸序列包括仅残基122处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v2氨基酸序列包括残基123处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v2氨基酸序列包括仅残基124处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v2氨基酸序列包括仅残基127处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；且

• 如果突变体fHbp v2氨基酸序列包括仅残基240处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

或者(B)包含突变体fHbp v3氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性和/或包含SEQ ID NO:17的至少7个氨基酸长且含有(b)中列出的残基中的至少一个的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下残基中的一个或多个处不同于SEQ ID NO:17：32、33、39、41、72、103、116、125、126、127、128、129、130、131、154、242和/或243；条件是：

• 如果突变体fHbp v3氨基酸序列包括残基32处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v3氨基酸序列包括残基113处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代。

• 如果突变体fHbp v3氨基酸序列包括仅残基125处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v3氨基酸序列包括残基126处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v3氨基酸序列包括残基127处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；

• 如果突变体fHbp v3氨基酸序列包括残基130处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代；且

• 如果突变体fHbp v3氨基酸序列包括仅残基243处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一个进一步残基被取代。

2. 实施方案1(B)的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:17的不同在于(b)中列出的残基中的一个或多个处的取代；例如，其中所述取代选自：S32V；I33C；L39C；L41C；F72C；V103T；T116S；F125C；L126R；V127I；S128G或S128T；G129D；L130I；G131A；S154C；H242R；和E243H。

3. 实施方案1(B)或实施方案2的多肽，其包含(b)中列出的残基处且选自如上所示的组3A至3O的多于一个取代。

4. 实施方案1(A)的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5的不同在于(b)中列出的残基中的一个或多个处的取代；例如，其中所述取代选自：S32V；V33C；L39C；L41C；F69C；V100T；I113S；F122C；L123R；V124I；S125G或S125T；G126D；L127I；G128A；S151C；H239R；和E240H。

5. 实施方案1(A)或实施方案4的多肽，其包含(b)中列出的残基处且选自如上所示的组2A至2O的多于一个取代。

6. 实施方案1-5中任一项的多肽，其还包括破坏所述多肽结合至人因子H的能力的一个或多个进一步突变；例如，在v2中，包括在R73、D203、E210、G228、S121、F122、L123、A192、E194、V199、I200、L201、T213、H215、F219、T231和E240中的一个或多个处的取代，或者在v3中，包括在Q35、I178、L87、A88、L126、V127、V202、E213、T216、T234、V241和E243中的一个或多个处的取代。

7. 多肽，其包含：

• 氨基酸序列SEQ ID NO:44，其任选地具有1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入，其中所述多肽可以引发抗体，所述抗体结合至脑膜炎球菌fHbp多肽，所述脑膜炎球菌fHbp多肽由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成(例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:44且具有1、2或3个单一氨基酸取代)，但不在残基V32或R126处突变；

• 氨基酸序列SEQ ID NO:45，其任选地具有1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入，其中所述多肽可以引发抗体，所述抗体结合至脑膜炎球菌fHbp多肽，所述脑膜炎球菌fHbp多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成(例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:45且具有1、2或3个单一氨基酸取代)，但不在残基V32或R123处突变；

• fHbp v3氨基酸序列，其中所述v3氨基酸序列与v3野生型氨基酸序列是相同的，除了对应于SEQ ID NO:17的Leu-126的氨基酸位置处的突变，条件是所述突变不是取代为丙氨酸(例如，其中所述突变是取代为精氨酸)。

• fHbp v2氨基酸序列，其中所述v2氨基酸序列与v2野生型氨基酸序列是相同的，除了对应于SEQ ID NO:5的Leu-123的氨基酸位置处的突变，条件是所述突变不是取代为丙氨酸(例如，其中所述突变是取代为精氨酸)；或

• 氨基酸序列SEQ ID NO:47，其任选地具有1、2、3、4或5个单一氨基酸取代、缺失和/或插入，其中所述多肽可以引发结合至以下中每一种的抗体：由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成的脑膜炎球菌fHbp多肽；由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的脑膜炎球菌fHbp多肽；和由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成(例如，由氨基酸序列SEQ ID NO:48组成)的脑膜炎球菌fHbp多肽。

8. 质粒或其它核酸，其包含编码实施方案1至7中任一项的多肽的核苷酸序列。

9. 用实施方案8的质粒转化的宿主细胞；例如，其中所述细胞是脑膜炎球菌细菌，诸如具有mltA的下调或敲除的脑膜炎球菌细菌，并且也任选地具有以下的下调或敲除：(i)至少一种参与使得LPS的脂质A部分有毒的基因，特别是lpxl1；和/或(ii)至少一种参与荚膜多糖合成或输出的基因，特别是synX和/或ctrA。

10. 从实施方案9的宿主细胞制备的膜囊泡，其中所述囊泡包括实施方案1至7中任一项的多肽。

11. 免疫原性组合物，其包含实施方案1至7中任一项的多肽，或实施方案10的囊泡。

12. 实施方案11的组合物，其进一步包含第二多肽，当施用于哺乳动物时，所述第二多肽引发针对脑膜炎球菌杀细菌的抗体应答。

13. 实施方案11或12的组合物，其进一步包含(i)缀合的来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的荚膜糖和/或(ii)缀合的来自肺炎链球菌的荚膜糖。

14. 用于在哺乳动物中产生抗体应答的方法，其包括施用实施方案11至13中任一项的免疫原性组合物。

用于实施本发明的方式

fHbp突变

v2 fHbp被认为是不稳定的。为了分析该不期望特性的根本结构原因，着眼于工程改造序列以改善稳定性，本发明人分析了fHbp多肽的序列比对和3D结构。特别感兴趣的一个区域是N-末端和C-末端结构域之间的结构界面[168]。

本发明人鉴定了表1中鉴定的突变。鉴定用于突变的位置中的三个与参考文献24和25重叠，但本发明不涵盖现有技术中报道的多肽，即其中所述多肽包括仅在这些位置处被丙氨酸取代。例如，E240可以被组氨酸取代以匹配v1，并且理想地与残基H239处的取代匹配(突变体#1和#11)。类似地，如果F122被取代，则其优选与S151处的取代配对，两者均被半胱氨酸取代，以允许形成二硫桥(突变体#10)。此外，如果L123被取代，则其可以被精氨酸(而不是丙氨酸)取代，或者其可以与其它残基处(例如在S32处(参见突变体#3)，在S125处(参见突变体#20和#22))的取代配对、或与在残基124-128处的取代(参见突变体#12)配对。

稳定性研究

不稳定蛋白倾向于较少折叠，并且由于该原因，易于被蛋白酶切割和降解。图1显示v2 fHbp比v1和v3对胰凝乳蛋白酶更敏感，所以该测试可以用于评价突变体蛋白的稳定性。

对于图1，将野生型fHbp v1、v2和v3以0.5mg/µL制备于50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 8中。以1:100 (w/w)比率添加胰凝乳蛋白酶。将样品在24℃以50mL体积孵育，无振荡。提取样品并煮沸0、1、3或6小时；然后在12% bis-Tris凝胶(MES缓冲液)中运行。标记*的左侧泳道表明在无蛋白酶的情况下孵育6小时的样品。

表达重组蛋白的大肠杆菌的细胞裂解物已经与1:100 w/w比率胰凝乳蛋白酶在25℃下孵育3小时。在与兔中针对所有三种fHbp变体引发的免疫多克隆血清孵育之后，已经通过蛋白质印迹分析了降解模式。在较低表观分子量处的切割产物的存在(图2-4)被解释为不稳定性的指示，而对应于~30 kDa的表观MW的条带的持久性被解释为增加稳定性的指示。与野生型v2相比，突变体#1-6、#12和#22都显示对胰凝乳蛋白酶切割的增加耐受性。

DSC已被用作独立方法来评价突变对纯化的重组fHbp v2蛋白的稳定性的影响。通过DSC测量的T_m(熔融温度)对应于分析蛋白50%在折叠状态且50％在解折叠状态的温度。稳定蛋白的构象的变化将增加Tm，而不稳定性变化将降低Tm。如参考文献24的图3D中所见，野生型v2 fHbp的DSC概况显示了两种Tm值：在~40℃的T_m1，其对应于N-末端结构域的熔融温度，和在~80℃的T_m2，其对应于C-末端结构域的熔融温度。分析的突变体的T_m1和T_m2的值显示于表1中。突变体#2、#4、#5、#12、#19和#21显示N-末端结构域相对于野生型蛋白增加的T_m，并且该效果对于突变体#2、#4和#12更显著。

大小排阻层析(SEC)被用来评价单体蛋白的百分比，并且结果也显示于表1中。

突变体#2、#3和#4

突变体#3(组2B)在v2稳定性研究中给出最佳总体结果。该蛋白(SEQ ID NO:20)包括在Ser-58 (SEQ ID NO:5中的S32)和Leu-149 (SEQ ID NO:5中的L123)处的突变，分别被Val和Arg取代。通过DSC分析突变体v2蛋白(SEQ ID NO:20，包含SEQ ID NO:45)，并且与野生型序列相比，其N-末端结构域的T_m高>20℃(图5)。

在血清杀细菌测定法中，该v2突变体可以竞争与已经使用野生型v2序列产生的人抗体的结合。

尽管已经引入S58V和L149R突变以改善稳定性，并且确实实现该目标，图6显示，当通过针对固定的fH的表面等离振子共振测量时，与野生型v2序列(实线)相比时，突变体v2多肽(虚线)令人惊讶地显示出与fH的低得多的结合。S58V突变自身对fH结合影响较小，并且S58V/L149R双突变体显示比仅携带L149R突变体的fHbp更高的fH结合。

当突变体#3与v2中的‘E313A’突变进一步组合时，存在fH结合的完全丧失，如通过SPR所评价。

将等效突变引入v3序列(SEQ ID NO:17)，以得到v3突变体SEQ ID NO:44。在v3(即v2突变体#2和#4的v3等效物)中研究个别S58V和L149R突变对fH结合的影响。因此，根据SEQ ID NO:17编号，将突变S32V或L126R引入v3序列。将这两种突变体与两种不同的野生型v3序列进行比较，并且还与已知破坏v3中的fH结合的‘E313A’突变体[23]进行比较。

如图7中所示，野生型v3结合fH(最上面两行)。经设计以改善稳定性的S58V突变使SPR峰值降低约2倍。最令人惊讶地，L149R突变(再次，经设计以改善稳定性)将fH亲和力降低至与已知E313A突变体类似的水平(底部两行)。

还通过DSC研究v3中的S58V和L149R突变，并且发现其使N-末端T_m相对于野生型增加5.5℃(S58V)或6.7℃(L149R)。两种突变体的T_m比v2双突变体中所见更高(63.5℃ – 参见表1)。L149R v3突变体也显示对于其C-末端结构域更高的T_m值，而对于S58V v3突变体在此处几乎没有移位。SPR显示突变体#2的fH结合降低约一半，但对于突变体#4，fH亲和力降低至与已知E313A突变体类似的水平(同样如v2所见)。当组合两种突变(即突变体#3)时，与野生型相比的T_m增加为11.2℃。当将‘E313A’突变添加至突变体#3时，fH结合几乎完全消除，尽管当与突变体#3相比时，N-末端结构域的T_m也降低2.9℃(同时保持比v3野生型高8.3℃)。单独的‘E313A’突变的稳定性比野生型低得多，显示T_m降低6.3℃。

因此突变#2和#4可以单独使用，或组合(即，突变体#3)使用，任选地与进一步突变使用，以稳定v2或v3 fHbp，而且破坏fH亲和力。

血清杀细菌测定法用于评价v2和v3中的突变体#3和#4的免疫原性效力。此外，单独或与#3突变组合，还在v2和v3中测试‘E313A’突变体。还测试野生型v2和v3 fHbp用于比较。该蛋白以20µg/剂量与氢氧化铝佐剂施用，并且测试所得血清针对一组七种菌株(四种v2菌株，三种v3菌株)的杀细菌活性，所述菌株包括表达与起始野生型菌株序列(即v2序列2.16和v3序列3.42)相同的fHbp的菌株。

v2蛋白的结果如下(SEQ ID用于ΔG形式；* = 同源fHbp)：

v3蛋白的结果如下：

突变体#2和#12的组合

突变体#2和#12各自显示v2稳定性的改善，所以将这两种突变体组合为单一fHbp(SEQ ID NO:58, ΔG形式)。与突变体#12相比，该组合突变体的N-末端T_m再增加4.2℃，得到任何测试的突变体v2蛋白中最高的T_m。此外，其显示强烈降低的fH结合(SPR峰值降低约8倍)。

突变体融合蛋白

突变体v2和v3序列经由GSGGGG接头(SEQ ID NO:50)、还与突变体v1序列融合，以得到SEQ ID NO:48。该序列对于v2和v3两者包括S58V和L149R突变，并且对于v1包括R41S突变[21]。SEQ ID NO:47从N-末端至C-末端包括：v2突变体#3 (SEQ ID NO:45)；v3突变体#3 (SEQ ID NO:44)；和v1 ‘R41S’突变体(SEQ ID NO:49)，其通过富含甘氨酸的接头序列SEQ ID NO:50连接。融合蛋白可以方便地通过添加Met-[SEQ ID NO:37]-的N-末端序列来表达，因此提供成熟蛋白SEQ ID NO:48。

该融合蛋白因此利用这样的观察结果：突变体#3为v2和v3两者提供了稳定性(T_m)的大大增加和fH亲和力的大大降低。对于v1，R41S突变对热稳定性具有较小影响，但强烈降低fH结合。

三重融合蛋白的DSC研究(图8)显示，三种N-末端转变一起落在以68℃为中心的宽峰中。三种C-末端转变也落在一起。UPLC显示，该蛋白为94.9％纯，并且HPLC分析显示<1.5％寡聚物。

‘GMMA’膜囊泡中表达的突变体蛋白

用mltA、lpxL1和synX的敲除制备v1脑膜炎球菌菌株，以提供‘GMMA’疫苗中在‘ST2’启动子[157]控制下超表达v2和v3 fHbp脂蛋白的遗传背景。将v2基因整合入缺失的lpxL1基因座处的基因组，而将v3基因整合于synX基因座处。此外，天然v1 fHbp基因缺失，使得可以在无干扰的情况下研究v2和v3。

对于v2测试突变体#3和#4，并且对于v3测试突变体#4。此外，制备具有v2和v3 #4突变体两者的菌株。对于这些细菌，通过FACS评价fHbp表达和fH结合。

用于仅表达v2 fHbp的菌株，FACS显示，各种蛋白以类似水平表达，该水平比背景Δfhbp菌株高2个log。然而，在fH结合方面，突变体#3和#4显示少得多的结合，其中突变体#4的结合仅略高于背景。这些结果反映用重组v2蛋白获得的SPR数据。

对于表达v3突变体#4的菌株，FACS显示fHbp的充分表达，但其fH结合被废除(匹配用‘H222R’突变所见的fH结合[19,25])。

对于从v2和v3表达突变体#4的菌株，可以通过FACS检测到两种fHbp蛋白，但fH结合仅略高于背景Δfhbp菌株中所见。

蛋白质印迹分析用于测试当在液体培养物中生长6天时这些细菌中的fHbp表达的稳定性。突变体v2蛋白的表达随着时间保持稳定，甚至当共表达v3时。突变体v3蛋白的表达也保持稳定，除了在表达v2和v3突变体两者的菌株中，其中v3表达随着时间下降。

应该理解的是，本发明仅借助实例进行描述，并且可以作出修改，而仍在本发明的范围和精神内。

序列表

>SEQ ID NO:1 [MC58, v1]

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:2 [2996, v2]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:3 [M1239, v3]

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:4 [2996，成熟]

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:5 [2996 ΔG]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:6 [NHBA]

MFKRSVIAMACIFALSACGGGGGGSPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTADNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADGMQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD

>SEQ ID NO:7 [NadA]

MSMKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW

>SEQ ID NO:8 [NspA]

MKKALATLIALALPAAALAEGASGFYVQADAAHAKASSSLGSAKGFSPRISAGYRINDLRFAVDYTRYKNYKAPSTDFKLYSIGASAIYDFDTQSPVKPYLGARLSLNRASVDLGGSDSFSQTSIGLGVLTGVSYAVTPNVDLDAGYRYNYIGKVNTVKNVRSGELSAGVRVKF

>SEQ ID NO:9 [HmbR]

MKPLQMLPIAALVGSIFGNPVLAADEAATETTPVKAEIKAVRVKGQRNAPAAVERVNLNRIKQEMIRDNKDLVRYSTDVGLSDSGRHQKGFAVRGVEGNRVGVSIDGVNLPDSEENSLYARYGNFNSSRLSIDPELVRNIEIVKGADSFNTGSGALGGGVNYQTLQGRDLLLDDRQFGVMMKNGYSTRNREWTNTLGFGVSNDRVDAALLYSQRRGHETESAGNRGYAVEGEGSGANIRGSARGIPDSSKHKYNHHALGKIAYQINDNHRIGASLNGQQGHNYTVEESYNLTASSWREADDVNRRRNANLFYEWMPDSNWLSSLKADFDYQKTKVAAVNNKGSFPMDYSTWTRNYNQKDLDEIYNRSMDTRFKRFTLRLDSHPLQLGGGRHRLSFKTFVSRRDFENLNRDDYYFSGRVVRTTSSIQHPVKTTNYGFSLSDQIQWNDVFSSRAGIRYDHTKMTPQELNAECHACDKTPPAANTYKGWSGFVGLAAQLNQAWRVGYDITSGYRVPNASEVYFTYNHGSGNWLPNPNLKAERSTTHTLSLQGRSEKGMLDANLYQSNYRNFLSEEQKLTTSGTPGCTEENAYYGICSDPYKEKLDWQMKNIDKARIRGIELTGRLNVDKVASFVPEGWKLFGSLGYAKSKLSGDNSLLSTQPLKVIAGIDYESPSEKWGVFSRLTYLGAKKVKDAQYTVYENKGWGTPLQKKVKDYPWLNKSAYVFDMYGFYKPAKNLTLRAGVYNLFNRKYTTWDSLRGLYSYSTTNAVDRDGKGLDRYRAPGRNYAVSLEWKF

>SEQ ID NO:10 [NhhA]

MNKIYRIIWNSALNAWVVVSELTRNHTKRASATVKTAVLATLLFATVQASANNEEQEEDLYLDPVQRTVAVLIVNSDKEGTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTAREITLKAGDNLKIKQNGTNFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSANGNKVNITSDTKGLNFAKETAGTNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAGWNIKGVKPGTTASDNVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGKDKGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATVSKDDQGNITVMYDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMTPQFSSVSLGAGADAPTLSVDGDALNVGSKKDNKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW

>SEQ ID NO:11 [App]

MKTTDKRTTETHRKAPKTGRIRFSPAYLAICLSFGILPQAWAGHTYFGINYQYYRDFAENKGKFAVGAKDIEVYNKKGELVGKSMTKAPMIDFSVVSRNGVAALVGDQYIVSVAHNGGYNNVDFGAEGRNPDQHRFTYKIVKRNNYKAGTKGHPYGGDYHMPRLHKFVTDAEPVEMTSYMDGRKYIDQNNYPDRVRIGAGRQYWRSDEDEPNNRESSYHIASAYSWLVGGNTFAQNGSGGGTVNLGSEKIKHSPYGFLPTGGSFGDSGSPMFIYDAQKQKWLINGVLQTGNPYIGKSNGFQLVRKDWFYDEIFAGDTHSVFYEPRQNGKYSFNDDNNGTGKINAKHEHNSLPNRLKTRTVQLFNVSLSETAREPVYHAAGGVNSYRPRLNNGENISFIDEGKGELILTSNINQGAGGLYFQGDFTVSPENNETWQGAGVHISEDSTVTWKVNGVANDRLSKIGKGTLHVQAKGENQGSISVGDGTVILDQQADDKGKKQAFSEIGLVSGRGTVQLNADNQFNPDKLYFGFRGGRLDLNGHSLSFHRIQNTDEGAMIVNHNQDKESTVTITGNKDIATTGNNNSLDSKKEIAYNGWFGEKDTTKTNGRLNLVYQPAAEDRTLLLSGGTNLNGNITQTNGKLFFSGRPTPHAYNHLNDHWSQKEGIPRGEIVWDNDWINRTFKAENFQIKGGQAVVSRNVAKVKGDWHLSNHAQAVFGVAPHQSHTICTRSDWTGLTNCVEKTITDDKVIASLTKTDISGNVDLADHAHLNLTGLATLNGNLSANGDTRYTVSHNATQNGNLSLVGNAQATFNQATLNGNTSASGNASFNLSDHAVQNGSLTLSGNAKANVSHSALNGNVSLADKAVFHFESSRFTGQISGGKDTALHLKDSEWTLPSGTELGNLNLDNATITLNSAYRHDAAGAQTGSATDAPRRRSRRSRRSLLSVTPPTSVESRFNTLTVNGKLNGQGTFRFMSELFGYRSDKLKLAESSEGTYTLAVNNTGNEPASLEQLTVVEGKDNKPLSENLNFTLQNEHVDAGAWRYQLIRKDGEFRLHNPVKEQELSDKLGKAEAKKQAEKDNAQSLDALIAAGRDAVEKTESVAEPARQAGGENVGIMQAEEEKKRVQADKDTALAKQREAETRPATTAFPRARRARRDLPQLQPQPQPQPQRDLISRYANSGLSEFSATLNSVFAVQDELDRVFAEDRRNAVWTSGIRDTKHYRSQDFRAYRQQTDLRQIGMQKNLGSGRVGILFSHNRTENTFDDGIGNSARLAHGAVFGQYGIDRFYIGISAGAGFSSGSLSDGIGGKIRRRVLHYGIQARYRAGFGGFGIEPHIGATRYFVQKADYRYENVNIATPGLAFNRYRAGIKADYSFKPAQHISITPYLSLSYTDAASGKVRTRVNTAVLAQDFGKTRSAEWGVNAEIKGFTLSLHAAAAKGPQLEAQHSAGIKLGYRW

>SEQ ID NO:12 [Omp85]

MKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSAIIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIEFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRILDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQMTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKTRDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTERSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTADGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNTYNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIALPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVRGYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDGKTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKKKPEDEIQRFQFQLGTTF

>SEQ ID NO:13 [NMB2091]

MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYDRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATRARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQR

>SEQ ID NO:14 [NHBA融合体]

MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDMAAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDEGAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAENNQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ

>SEQ ID NO:15 [NadA片段]

ATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG

>SEQ ID NO:16 [MC58, ΔG]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:17 [M1239, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:18 [突变体#1

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ

>SEQ ID NO:19 [突变体#2]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ

>SEQ ID NO:20 [突变体#3]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:21 [突变体#4]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:22 [突变体#5]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:23 [突变体#6]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:24 [突变体#7]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKSDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:25 [突变体#8]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSCRKNEKCKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:26 [突变体#9]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKCAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRCDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:27 [突变体#10]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSCLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSCDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:28 [突变体#11]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ

>SEQ ID NO:29 [突变体#12]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRIGDIAGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:30 [突变体#13]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:31 [突变体#14]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKCAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:32 [突变体#15]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSCLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:33 [突变体#19]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVTGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:34 [突变体#20]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVTGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:35 [突变体#21]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:36 [突变体#22]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVGGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:37

GPDSDRLQQRR

>SEQ ID NO:38

GSKDISS

>SEQ ID NO:39

GSKDISSGGGG

>SEQ ID NO:40 [M1239, 成熟]

CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:41 [v3(M1239), E243A, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ

>SEQ ID NO:42 [v3(M1239), S32V+E243A, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ

>SEQ ID NO:43 [v3(M1239), S32V+L126R+E243A, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ

>SEQ ID NO:44 [v3, S32V + L126R, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:45 [v2 突变体#3 S32V + L123R, ΔG]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:46 [MC58, v1, 成熟]

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:47 [v2-v3-v-1 突变体融合体]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVSKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:48 [v2-v3-v-1 突变体融合体，具有接头]

MGPDSDRLQQRRVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVSKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:49 [MC58, ΔG, ‘R41S’突变]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVSKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:50 [接头]

GSGGGG

>SEQ ID NO:51 [野生型v2序列，例如，用于GMMA方法]

VAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:52 [野生型v3序列，例如，用于GMMA方法]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:53 [m1239, L126R突变]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:54 [v2, 8047菌株，野生型]

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:55 [v2, 8047菌株, ΔG]

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>SEQ ID NO:56 [v2, ‘E313A’突变体, ΔG]

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>SEQ ID NO:57 [v2, 突变体#3 + ‘E313A’, ΔG]

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>SEQ ID NO:58 [突变体#2 + #12]

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>SEQ ID NO:59 [v2, 菌株8047菌株, 突变体#4, 成熟]

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>SEQ ID NO:60 [v2, 菌株8047菌株, 突变体#3, 成熟]

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>SEQ ID NO:61 [v3, 突变体#2 + #12, ΔG]

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