用于不进行比对预测微生物对抗微生物剂的抗性的基因测试的制作方法

文档序号：14915521发布日期：2018-07-11 00:36阅读：558来源：国知局

抗生素抗性是药物抗性的一种形式，从而使微生物亚群如细菌物种的菌株，尽管暴露于抗生素类药物，但也可存活并增殖。对于个体患者以及主要公共卫生问题而言，这是严重的健康问题。细菌感染的及时治疗需要分析获得自患者的临床分离株的抗生素抗性，以选择有效的疗法。通常，出于此目的，将鉴定的抗性与某一微生物(即ID)关联是必要的。

抗菌药物抗性(ADR)代表了主要的健康负担。根据正在监督的世界卫生组织的抗微生物抗性全球报告，ADR在欧洲每年导致25,000例死亡，在美国每年导致23,000例死亡。在欧洲，额外的250万住院日导致15亿欧元的社会成本。在美国，2百万的直接疾病成本导致200亿美元的直接成本。总成本估计高得多，将国内生产总值(GDP)降低达1.6％。

葡萄球菌属(Staphylococcus)是葡萄球菌科(Staphylococcaceae)的革兰氏阳性兼性厌氧菌，其是球形的、不动的并呈葡萄样簇。该属包括至少40个物种。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起葡萄球菌感染的最常见的葡萄球菌属物种。它频繁在人体呼吸道和皮肤上发现。尽管金黄色葡萄球菌并不总是致病的，但是它是皮肤感染(例如疮)、呼吸系统疾病(例如鼻窦炎)和食物中毒以及威胁生命的疾病(诸如肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征(TSS)、菌血症和败血症)的常见病因。金黄色葡萄球菌在干燥的环境表面上可以存活数小时至数周，或甚至数月，这取决于菌株。金黄色葡萄球菌作为最重要的机会性人类病原体之一的地位很大程度上归因于其毒力潜力与作为人类、家畜和牲畜中的移殖者无处不在的存在相组合。

金黄色葡萄球菌是报告给国家医疗保健安全网(NHSN)的医疗保健相关感染的第二最常见原因。当前的估计表明，报告给NHSN的49-65％的与医疗保健相关的金黄色葡萄球菌感染是由甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的。在医院、监狱和疗养院，MRSA是麻烦的，具有开放性创伤、侵袭性装置和较弱的免疫系统的患者比一般公众具有更大的医院感染风险。MRSA开始是作为医院获得性感染，但已经发展成有限的地方性流行状态，并且现在有时是社区获得性的。医疗保健相关MRSA(HA-MRSA)与延长住院时间有关，并且是当前世界上许多地方医院中最频繁鉴定的病原体之一。此外，社区获得性MRSA(CAMRSA)已经显示出日益增长的趋势，因此已由数位医疗官员发布了用于预防和监督的指南。

2011年，CDC估计在美国发生了80,461例侵入性MRSA感染和11,285例相关死亡。在社区和医疗保健机构中均发生了未知但较高数量的不太严重的感染。MRSA难以治疗，因为它对大多数抗生素有抗性。用万古霉素(常被认为是抗MRSA的最后一道防线的糖肽类抗生素)的治疗已经导致万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌(VRSA)的出现，对于万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌，几乎没有药剂是有效的。另外，使用万古霉素衍生的抗生素替考拉宁已经引起了替考拉宁抗性的MRSA菌株的增加。其他药剂也可用于治疗MRSA感染，尽管许多具有有限的治疗益处，但主要是由于严重的副作用。

一般而言，细菌针对抗微生物治疗的抗性机制很大一部分依赖于生物体的遗传。各自的基因或分子机制在细菌基因组中编码或者在可在不同细菌之间互换的质粒上编码。最常见的抗性机制包括：

1)外排泵是位于膜内的高亲和力反向运输系统，其将抗生素运输至细胞外，例如针对四环素的抗性。

2)特定的酶以使抗生素丧失其活性的方式对抗生素进行修饰。在链霉素的情况下，抗生素被化学修饰，以使其不再结合核糖体，从而不再阻止蛋白合成。

3)产生降解抗生素的酶，从而使其失活。例如，青霉素酶是一组剪切青霉素分子的β内酰胺环的β-内酰胺酶。

此外，一些病原体显示出针对药物的天然抗性。例如，生物体可以缺乏针对抗生素的运输系统，或者生物体中不存在抗生素分子的靶标。

对甲氧西林和相关药物的抗性是由mecA基因赋予的，该基因编码对结合β-内酰胺类(盘尼西林类、头孢菌素类和碳青霉烯类)具有较低亲和力的改变的盘尼西林结合蛋白(PBP2a或PBP2′)。这使得在MRSA感染期间，对所有β-内酰胺类抗生素具有抗性并且排除了它们的临床使用。因此，糖肽万古霉素通常用于抗MRSA。

原则上对药物敏感的病原体可以通过既有遗传物质的修饰(例如，抗生素抗性的自发突变，其在感染中以约1/1亿个细菌的频率发生)或者从其它来源获得新的遗传物质而变得具有抗性。一个实例是水平基因转移，其是这样的过程：DNA小包中包含的遗传物质可在同一物种的单个细菌之间，甚至在不同物种之间转移。水平基因转移可以通过转导、转化或接合发生。

通常，通过在不同浓度的这些试剂中培养生物体来进行针对抗微生物剂的敏感性/抗性的测试。

简言之，将琼脂平板接种患者样品(例如，尿、痰、血液、粪便)过夜。在第二天，通过培养或者利用质谱法，用各个克隆鉴定生物体。基于生物体的身份，接种含有增加浓度的用于处理这些生物体的药物的新平板，并另外生长12-24小时。使用抑制生长的最低药物浓度(最小抑菌浓度-MIC)以确定对所测试的药物的敏感性/抗性。该过程耗费至少2至3个工作日，期间以经验为主对患者进行治疗。自动化系统来自数个公司，例如Biomeriux(Vitek)、Beckman Coulter(Microscan)。特别是在患有危及生命的疾病的患者中或者为了克服抗生素的普遍滥用，需要显著降低的结果效率(time-to-result)。

近期的发展包括用于快速细菌鉴定的基于PCR的测试试剂盒(例如，Biomerieux Biofire Tests、Curetis Unyvero Tests)。利用这些测试，对于非常有限数目的药物而言，检测所选择的抗性基因座是可能的，但是不能给出与基于培养的AST的关联。质谱法越来越多地用于鉴定临床样品中的病原体(例如，Bruker Biotyper)，并且正在进行研究以建立检测针对抗生素的敏感性/抗性的方法。

使用分子技术直接检测MRSA已经变得越来越普遍，特别是用于筛选目的。对甲氧西林的抗性是由mec操纵子介导的，mec操纵子是葡萄球菌盒式染色体mec(SCCmec)的一部分。最近引入了PCR测试，其基于将SCCmec的右端序列与金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性标记物组合的检测。尽管检测到存在赋予抗性的基因，最初的报告存在描述基于培养物的敏感性报告。

对于一些药物而言，已知找到至少两个靶标，例如在环丙沙星(drug bank ID 00537；http：//www.drugbank.ca/drugs/DB00537)的情况下，靶标包括DNA拓扑异构酶IV、DNA拓扑异构酶II和DNA回旋酶。可以预期，对于其它药物而言也是这样的情况，尽管还未鉴定出各自的第二靶标。在常见的调节情况下，两个相关的基因位点将自然显示出共相关或冗余。

已知药物抗性可与遗传多态性相关。这适用于病毒，其中在临床实践中建立了抗性测试(例如，HIV基因型分型)。最近，已显示，抗性在细菌甚至更高级生物体(如人类)中也有遗传原因，其中肿瘤对某些细胞抑制剂的抗性可与基因组突变相关。

Wozniak等人(BMC Genomics 2012，13(Suppl 7)：S23)基于基因型和表型数据公开了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的药物抗性的遗传决定因子。Stoesser等人利用全基因组序列数据，公开了大肠杆菌(Escherichia coli)分离株和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)分离株的抗微生物敏感性的预测(J Antimicrob Chemother 2013；68：2234-2244)。

Chewapreecha等人(Chewapreecha等人(2014)Comprehensive Identification of single nucleotid polymorphisms associated with beta-lactam resistance within pneumococcal mosaic genes.PLoS Genet 10(8)：e1004547)利用类似的方法鉴定出革兰氏阳性肺炎链球菌(Streptococcus Pneumonia)中的突变。

Gordon等人(Gordon等人(2014)，Prediction of Staphylococcus aureus Antimicrobial Resistance by Whole-Genome Sequencing，J.Clin.Microbiol.2014，52(4)：1182)和Dordel等人(Dordel，J.，Kim，C.等人(2014)Novel Determinants of Antibiotic Resistance：Identification of Mutated Loci in Highly Methicillin-Resistant Subpopulations of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.mBio，5(2)，e01000-13；doi：10.1128/mBio.01000-13)集中于鉴定已知基因的新标记物。

快速且准确地检测微生物尤其是微生物物种(例如金黄色葡萄球菌)感染以及预测对抗微生物疗法的应答，代表了高度未满足的临床需求。

通过本发明解决了这一需求。

发明概述

本发明的发明人通过下述解决该需求：进行一大组微生物尤其是细菌微生物，尤其是金黄色葡萄球菌临床分离株的全基因组测序，并将基因突变谱与分离株的抗性表型和/或基于标准培养的抗微生物敏感性测试进行比较，目标是开发可利用分子测试用以检测细菌对抗微生物药物的敏感性/抗性的测试。

本发明的发明人对于对抗微生物药物如抗生素类药物敏感或具有抗性，尤其是对甲氧西林以及相关药物敏感或具有抗性的细菌物种，尤其是葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌的基因组进行了广泛研究。基于该信息，现可以提供基于在核苷酸水平的各个突变对葡萄球菌属菌株，尤其是金黄色葡萄球菌菌株的抗性模式的详细分析。这一分析包括鉴定对各个抗微生物药物如抗生素类药物以及它们集群的抗性。这不仅允许确定对单个抗微生物药物如抗生素类药物的抗性，还允许确定对抗微生物药物组(例如，抗生素类如内酰胺类或喹诺酮类抗生素)的抗性，甚至对所有相关抗生素类药物的抗性。

因此，本发明将极大地促进用于治疗患者微生物如葡萄球菌属，尤其是金黄色葡萄球菌感染的合适的抗微生物药物如抗生素类药物的选择，从而极大地提高诊断和治疗的质量。

目前的方法是基于使用无参考SNP调用和相关测试来覆盖基因抗性的不同来源以及细菌如何变得有抗性的不同方式。这样，抗性的检测不再局限于参考基因组。

与其他工作(例如，Gordon等人、Dordel等人，见上文)相比，新标记物的鉴定不是集中在已知的基因上，而是进行了无参考SNP调用，并且注释是基于数个参考基因组。

根据第一方面，本发明涉及确定微生物尤其是细菌微生物的抗微生物药物如抗生素的抗性谱的方法，所述方法包括：

获得或提供所述微生物的多种临床分离株的基因序列的第一数据集，

其中组装所述第一数据集的基因序列的至少一部分；

分析所述第一数据集的基因序列的基因变体以获得基因变体的第三数据集；

提供所述微生物的多种临床分离株的抗微生物药物如抗生素的抗性和/或敏感性的第二数据集；

将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及

确定所述微生物的基因组中具有抗微生物药物如抗生素抗性的基因位点。

在第二方面，本发明公开了确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的微生物尤其是细菌微生物的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含微生物尤其是细菌微生物的样品；

b)如通过第一方面的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的至少一个位置的至少一个基因变体的存在，其中存在所述至少一个基因变体表明所述患者感染具有抗微生物药物抗性的微生物。

本发明的第三方面涉及选择对感染了可能具有抗性的微生物尤其是细菌微生物的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含微生物尤其是细菌微生物的样品；

b)如通过第一方面的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的至少一个位置的至少一个基因变体的存在，其中存在所述至少一个基因变体表明对一种或多种抗微生物药物的抗性；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗所述微生物尤其是细菌微生物感染的一种或多种抗微生物药物。

本发明的第四方面涉及，获得、分别确定微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的抗微生物药物如抗生素的抗性谱的方法，其包括：

获得或提供微生物尤其是细菌微生物的所述临床分离株的至少一个基因序列；以及

如通过本发明的第一方面的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的所述临床分离株的至少一个基因序列中基因变体的存在。

此外，本发明的第五方面公开了计算机程序产品，其包含计算机可执行的指令，所述指令被执行时实施本发明的第一方面至第三方面中任一项所述的方法。

此外，本发明的第六方面涉及确定患者感染对抗微生物药物如抗生素治疗可能具有抗性的葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含至少一种葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的样品；

b)确定就具有下面表1中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少两个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少两个遗传变异表明所述患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置。

表1：具有编号1-50的位置列表

本发明的第七方面涉及选择对感染了可能具有抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表1中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少两个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少两个遗传变异表明对一种或多种抗微生物药物如抗生素药物的抗性，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

此外，本发明的第八方面涉及确定患者感染对抗微生物药物如抗生素治疗可能具有抗性的葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有下面表3a和/或3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少两个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少两个遗传变异表明所述患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置。

表3a：具有编号1-50的位置列表

表3b：具有编号1-50的位置列表

本发明的第九方面涉及选择对感染了可能具有抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表3a和/或3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少两个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少两个遗传变异表明对一种或多种抗微生物药物如抗生素药物的抗性，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

从属权利要求公开了本发明的其它方面和其它实施方案，并且其可以从下述描述、附图和实施例中得出，但不限于此。

附图说明

附图应当阐明本发明的实施方案，并传达其进一步的理解。与描述相结合，它们将作为本发明的概念和原理的解释。结合附图，可以得到其它实施方案和许多所阐明的优势。附图的要素相对于彼此不一定是按比例的。除非另外指明，相同的、功能等同的以及作用相同的特性和组件在附图的图中用同一参考编号表示。

图1示意性地示出了根据本发明的方法的诊断测试的读取概念。

本发明的详细描述

定义

除非另外限定，否则本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。

本发明中的“抗微生物药物”指一组药物，其包括抗生素、抗真菌剂、抗原生动物剂和抗病毒剂。根据某些实施方案，抗微生物药物是抗生素。

术语“核酸分子”指具有确定序列的多核苷酸分子。其包含DNA分子、RNA分子、核苷酸类似物分子及其组合和衍生物，如掺入核苷酸类似物的DNA分子或RNA分子或者cDNA。

术语“核酸序列信息”涉及可来源于核酸分子的序列的信息，所述核酸分子的序列是例如序列自身或者与参考序列相比的序列上的变异。

通常，术语“遗传变异”涉及在物种至少两个随机生物体的基因组中的不同位置。术语“遗传变异”尤其涉及与一个或多个参考序列相比，序列中的变异，例如单核苷酸多态性(SNP)、突变、拷贝数变异等。此类参考序列可以是在优势野生型生物体或参考生物体(例如，如金黄色葡萄球菌的细菌物种的确定的和已知的细菌菌株或亚株)中确定的序列，其在密切相关的菌株中在基因含量上可能具有很大的变异。遗传变异是例如一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入，或者一个或多个核苷酸的取代、一个或一系列核苷酸的重复、一个或一系列核苷酸的易位，尤其是单核苷酸多态性(SNP)。

为了清楚地识别变异，可以将这些变异注释到一个或多个参考序列(例如，确定的和已知的细菌菌株或亚株)以及如金黄色葡萄球菌的微生物的泛基因组。泛基因组通常包括存在于所有微生物(例如细菌物种)菌株中的基因以及存在于两种或更多种菌株中的基因和单个菌株特异性的基因。

根据某些实施方案，用无比对方法获得遗传变异，例如，用于检测单个碱基交换的方法，例如基于通过组装构建的重叠群。例如，可将获得自测序的读取组装成重叠群并可将重叠群相互比较。

在本发明的背景下，“样品”是包含来自细菌微生物的至少一种核酸分子的样品。样品的实例是：细胞、组织、体液、活检标本、血液、尿液、唾液、痰、血浆、血清、细胞培养上清液、拭子样品等。根据某些实施方案，样品是患者样品(临床分离株)。

被称为下一代测序的新的且高效的核酸测序方法已开启了大规模基因组分析的可能性。术语“下一代测序”或“高通量测序”指高通量测序技术，其将测序过程并行，一次产生数千条或数百万条序列。实例包括大规模平行信号测序(MPSS)、聚合酶克隆测序(Polony sequencing)、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope(TM)单分子测序、单分子SMRT(TM)测序、单分子实时(RNAP)测序、纳米孔DNA测序、通过杂交进行的测序、扩增子测序、GnuBio。

在本描述中，术语“微生物(microorganism)”包含术语微生物(microbe)。除非另外或者明显指明，微生物的类型没有特别限制，并且其例如包括细菌、病毒、真菌、微小的藻类和原生动物及其组合。根据某些方面，微生物是指一种或多种金黄色葡萄球菌菌株。

本描述中提及微生物包括提及一种微生物以及多种微生物，例如两种、三种、四种、五种、六种或者更多种微生物。

本发明中的脊椎动物是指含有椎骨的动物，其包括哺乳动物-包括人类、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类。因此本发明不仅适用于人类医学，还适用于兽医学。

根据某些实施方案，本发明的方法中的患者是脊椎动物，更优选哺乳动物，并且最优选人类患者。

在示例性地详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的方法的过程步骤的具体组成部分，因为此类方法可以改变。还应当理解，本文使用的技术仅出于描述具体实施方案的目的，并且其不意图具有限制性。必须注意，除非上下文另外明确规定，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括单数和/或复数指示物。例如，本文使用的术语“一个/一种”可以理解为一个单个的实体或者意味着“一个或多个/一种或多种”实体。还应当理解，除非上下文另外明确规定，复数形式包括单数和/或复数指示物。此外，应当理解，如果给出由数值限定的参数范围，则认为所述范围包括这些限制值。

关于抗微生物药物，例如抗生素类药物的剂量，其参考人类医学和兽医学中建立的药理学原理。例如，Forth，Henschler，Rummel″Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie″，第9版，2005，pp.781-919，其可用作指南。关于即用型药剂的配制，参考″Remington，The Science and Practice of Pharmacy″，第22版，2013，pp.777-1070。

基因序列的组装可以通过任何已知的方法进行，并无特别限定。

根据本发明的第一方面，本发明涉及确定微生物尤其是细菌微生物的抗微生物药物如抗生素的抗性谱的方法，所述方法包括：

获得或提供所述微生物的多种临床分离株的基因序列的第一数据集；

其中组装所述第一数据集的基因序列的至少一部分；

分析所述第一数据集的基因序列的基因变体以获得基因变体的第三数据集；

提供所述微生物的多种临床分离株的抗微生物药物如抗生素的抗性和/或敏感性的第二数据集；

将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及

确定所述微生物的基因组中具有抗微生物药物如抗生素抗性的基因位点。

在该方法以及本发明的其他方法中，可以以任何方式(优选非侵入性方式)提供或获得多种临床分离株的基因序列的第一数据集，并且例如可以是由体外样品提供。

根据某些实施方案，该方法以及本发明的其它方法中，多种临床分离株的基因序列的获得或提供可以包含下述：

例如，提供或者获得脊椎动物(例如人类)的样品，以及通过未特别限定的记录核酸的已知方法来记录核酸序列(例如DNA或RNA序列)。例如，可以通过测序方法记录核酸，其中任何测序方法均适合，尤其是这样的测序方法：可在短时间内对大批样品成分，如血液样品成分中所包含的核酸和/或核酸片段和/或其部分，包括至少一种目标微生物尤其是细菌微生物(例如金黄色葡萄球菌物种)的核酸和/或核酸片段和/或其部分进行分析。例如，可以利用聚合酶链式反应(PCR)，尤其是多重PCR或高通量测序或下一代测序，优选利用高通量测序进行测序。对于测序，优选使用体外样品。

通过测序获得的数据可以是任何形式，并且其随后可用于通过已知的下述方法来鉴定待鉴定的微生物(例如金黄色葡萄球菌物种)的核酸：例如指纹分析法、比较基因组和/或与目标微生物的一个或多个物种的至少一个或多个基因组(即参考基因组)进行比对等，形成微生物尤其是金黄色葡萄球菌的比对基因的第三数据集-排除来自其它来源(例如脊椎动物)的其它数据。因此，根据某些实施方案，组装第一数据集的至少一部分基因序列，其中可以通过任何已知的方法进行组装并且没有特别的限制。根据某些实施方案，组装基本上全部的或全部的基因序列的数据。此外，也可以将已知的(例如，来自如NCBI的数据库的)来自已知物种(例如，来自如金黄色葡萄球菌的细菌物种)的基因组的数据用于第一数据集。

对于一些生物体，在全基因组相关研究中，使目标点(例如，突变)参考一个恒定参照，以提高标准化可能是有用的。在个体之间具有高的基因组一致性和99％相同的序列的人类的情况下，这是简单的，并且代表了标准，因为相应的参考基因组可获自数据库。

在引发传染性疾病的微生物(例如，细菌和病毒)的情况下，这要困难的多，当将序列数据与参考基因组比对时，尤其是不在基因(尤其是已知基因)上的遗传变异可能被遗漏。克服这个问题的一个可能性是回到包含某个属的所有序列的虚拟的泛基因组上，或执行无参考变异的调用。另外的可能性是分析所有可获得的参照，这更复杂。其中从数据库(例如，RefSeq)提取全部n个参照，并将其与新测序的细菌基因组k进行比较。在这之后，应用矩阵(定位读取的百分比，覆盖基因组的百分比)并且可以将数据与数个参考基因组进行比较。在这种情况下，进行n×k个完全比对。如同例如金黄色葡萄球菌的情况，有大量的参照，可以获得稳定的结果。此外，由于压力下的高分裂率/外源信号，可以观察到突变率的跳跃。

根据本发明，可以用已知的方法，例如通过重新组装或者定位组装，来至少部分组装第一数据集的基因序列。未特别限定序列组装，并且可以使用任何已知的基因组组装程序，例如基于Sanger、454、Solexa、Illumina、SOLid技术等，及其杂交物/混合物。

根据某些实施方案，可在鉴定目标核酸之后，移出与目标微生物(例如细菌微生物，如金黄色葡萄球菌)不同来源的核酸的数据，例如通过过滤数据。此类数据可以例如包括患者(例如，脊椎动物(如人类)和/或其它微生物等)的核酸。这可以通过例如Meyerson等人2002年开发的计算减法完成。为此，与脊椎动物等的基因组进行比对也是可能的。对于比对，数种比对工具都是可用的。以这种方式可以大幅降低来自样品的原始数据量。

在此类“过量”数据移出之后，如上所述，可以对于微生物(例如金黄色葡萄球菌)获得第三数据集。

使用这些技术，可以获得不同物种的目标微生物(例如，细菌微生物如金黄色葡萄球菌)的基因序列中的遗传变异。

当如下所述，例如在吸收有抗微生物药物如抗生素的板上，利用标准培养方法，测试这些相同物种对多种抗微生物药物如抗生素的抗微生物药物如抗生素的敏感性时，可将这些抗微生物药物如抗生素敏感性测试的结果与各自微生物(例如金黄色葡萄球菌)的基因组中的遗传变异相互参考/关联。利用一些，例如50或超过50、100或超过100、200或超过200、400或超过400、800或超过800或者900或超过900种相同种或不同种的微生物(例如金黄色葡萄球菌)的不同分离株，可以利用已知的方法，对获得的这些微生物的遗传变异与抗微生物药物如抗生素的敏感性之间的相互参考的数据进行统计学分析。

关于培养方法，可将微生物样品例如培养过夜。在第二天，可以通过培养或者利用质谱法将各个克隆用于生物体鉴定。基于生物体的身份，接种至含有增加浓度的用于处理这些生物体的药物的新平板，并另外生长12-24小时。可以使用抑制生长的最低药物浓度(最小抑菌浓度-MIC)确定所测试的抗生素的敏感性/抗性。

而且，可以通过确定例如在不同分离株中已知的抗性基因来进行抗性测试，如在甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)，以及关于葡萄球菌属对一种或多种(不同的)药物如抗生素的抗性的情况下。为了分别确定抗性、敏感性，可以使用来自培养方法的数据和/或来自确定的已知抗性基因的数据，以及以不同方式如基于质谱(可能还与培养有关)获得的数据。

可以按常规方式将遗传变异与抗微生物药物如抗生素的抗性相关联，并且没有特别的限制。例如，抗性可以被关联到相应微生物的全基因组或仅其部分(例如仅基因组的编码部分)中的遗传变异。在某些情况下，甚至可以只确定基因中(例如某些基因)的遗传变异或基因中的某些基因突变(例如SNP)。关联后，可以进行统计分析。

根据某些实施方案，在第一数据集的基因序列中的遗传变异是单核苷酸多态性(SNP)。

根据某些实施方案，可以在可能注释到泛基因组和/或参考基因组以及与抗性/敏感性数据关联之前，过滤第一数据集的数据，尤其是SNP。

例如，要减少类似注释的数量，可以通过以下一项或多项来过滤和聚集类似注释：

·只能保留所考虑的位于蛋白上的SNP的注释，并丢弃进一步的数据。

·只能保留不包含“假设蛋白”的注释。

·可以通过SNP识别号(ID)和基因产物对注释进行分类。

·对于唯一的一对SNP ID和基因产物，只能保留第一个注释。

另外，根据某些实施方案，可以排除以下SNP：

·没有任何注释的SNP或其所有注释包含标签“同义突变”的SNP，因此只考虑具有至少一个非同义突变注释(例如非同义突变编码)的SNP。

·恒定的SNP，即所有样品具有相同的值。

·几乎恒定的SNP：其最高频率值具有≥95％的频率的SNP，即所有样品中最少95％具有相同的SNP值。

·也可以移出对于超过10％的样品具有缺失值(“-”)的SNP。

根据某些实施方案，无比对检测SNP。这样也可以发现在一个或多个特定参考基因组中没有发现的SNP。例如，如上所述，可以将组装好的基因序列相互比较。尽管如此，如上所述，还可以包括已知的例如葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的相同物种的微生物的基因序列，它们是例如为公众存放(例如，存放于NCBI)，并且也使用这些数据用于寻找遗传变异。

根据某些实施方案，将SNP注释到微生物的泛基因组和/或注释到微生物(例如葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌)的一个或多个参考基因组。例如，根据某些实施方案，上述方法中使用的微生物是葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌，并且抗微生物药物是甲氧西林和/或如下所述的一种或多种抗生素。对于此类实施方案，获得的根据本发明的方法确定的具有最高统计概率的50种遗传变异(尤其是使用包括染色体和可用质粒的来自NCBI的49种完成的金黄色葡萄球菌基因组，以及具有组装的995种金黄色葡萄球菌重新组装)是表1中所给出的那些。在表1中，参考来自NCBI的一个或多个已知的参考基因组(NCBI编号示于“参考基因组”栏中，基因组名称示于“基因组名”栏中)，给出了每个变异(以连续数字1-50示出)的遗传变异的位置(命名为“位置”，其中R是反向，F是正向)。参考基因组以序列表附于本申请。

表1中用于注释的参考基因组由以下金黄色葡萄球菌菌株获得，其如下所示：NC_017340、NC_010079、NC_022222、NC_021670、NC_017351、NC_002953、NC_017337、NC_018608、NC_007795、NC_021059、NC_021554、NC_016912、NC_022226和NC_022113，在下面以相同的顺序更详细地示出：

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_017340

基因座 NC_017340 2821452 bp DNA环形CON 15-JUL-2015

定义金黄色葡萄球菌04-02981，完整基因组。

登录号 NC_017340

版本 NC_017340.1 GI：387149188

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02603764

组装：GCF_000025145.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌04-02981

生物体金黄色葡萄球菌04-02981

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2821452)

作者 Nubel，U.，Dordel，J.，Kurt，K.，Strommenger，B.，Westh，H.，Shukla，S.K.，Zemlickova，H.，Leblois，R.，Wirth，T.，Jombart，T.，Balloux，F.和Witte，W。

标题 A timescale for evolution，population expansion，and spatial spread of an emerging clone of methicillin-resistant Staphylococcus aureus

期刊 PLoS Pathog.6(4)，E1000855(2010)

PUBMED 20386717

备注发布状态：仅在线

参考2 (碱基1至2821452)

作者 Nuebel，U.，Dordel，J.，Kurt，K.，Strommenger，B.，Westh，H.，Shukla，S.K.，Zemlickova，H.，Leblois，R.，Wirth，T.，Jombart，T.，Balloux，F.和Witte，W。

标题直接提交

期刊提交(05-NOV-2010)Nosocomial Infections，Robert Koch Institute，Burgstr.37，Wernigerode 38855，Germany

备注由提交者更新序列

参考3 (碱基1至2821452)

作者 Nuebel，U.，Dordel，J.，Kurt，K.，Strommenger，B.，Westh，H.，Shukla，S.K.，Zemlickova，H.，Leblois，R.，Wirth，T.，Jombart，T.，Balloux，F.和Witte，W.

标题直接提交

期刊提交(22-DEC-2009)Nosocomial Infections，Robert Koch Institute，Burgstr.37，Wernigerode 38855，Germany

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_010079

基因座 NC_010079 2872915 bp DNA环形CON 15-JUL-2015

定义金黄色葡萄球菌金黄色亚种USA300_TCH1516，完整基因组

登录号 NC_010079

版本 NC_010079.1 GI：161508266

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN00253845

组装：GCF_000017085.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种USA300_TCH1516

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种USA300_TCH1516

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2872915)

作者 Highlander，S.K.，Hulten，K.G.，Qin，X.，Jiang，H.，Yerrapragada，S.，Mason，E.O.Jr.，Shang，Y.，Williams，T.M.，Fortunov，R.M.，Liu，Y.，Igboeli，O.，Petrosino，J.，Tirumalai，M.，Uzman，A.，Fox，G.E.，Cardenas，A.M.，Muzny，D.M.，Hemphill，L.，Ding，Y.，Dugan，S.，Blyth，P.R.，Buhay，C.J.，Dinh，H.H.，Hawes，A.C.，Holder，M.，Kovar，C.L.，Lee，S.L.，Liu，W.，Nazareth，L.V.，Wang，Q.，Zhou，J.，Kaplan，S.L.和Weinstock，G.M.

标题 Subtle genetic changes enhance virulence of methicillin resistant and sensitive Staphylococcus aureus

期刊 BMC Microbiol.7，99(2007)

PUBMED 17986343

备注发布状态：仅在线

参考2 (碱基1至2872915)

作者 Muzny，D.，Qin，X.，Buhay，C.，Dugan-Rocha，S.，Ding，Y.，Chen，G.，Hawes，A.，Holder，M.，Jhangiani，S.，Johnson，A.，Khan，Z.，Li，Z.，Liu，W.，Liu，X.，Perez，L.，Shen，H.，Wang，Q.，Watt，J.，Xi，L.，Xin，Y.，Zhou，J.，Deng，J.，Jiang，H.，Liu，Y.，Qu，J.，Song，X.-Z.，Zhang，L.，Villasana，D.，Johnson，A.，Liu，J.，Liyanage，D.，Lorensuhewa，L.，Robinson，T.，Song，A.，Song，B.-B.，Dinh，H.，Thornton，R.，Coyle，M.，Francisco，L.，Jackson，L.，Javaid，M.，Korchina，V.，Kovar，C.，Mata，R.，Mathew，T.，Ngo，R.，Nguyen，L.，Nguyen，N.，Okwuonu，G.，Ongeri，F.，Pham，C.，Simmons，D.，Wilczek-Boney，K.，Hale，W.，Jakkamsetti，A.，Pham，P.，Ruth，R.，San Lucas，F.，Warren，J.，Zhang，J.，Zhao，Z.，Zhou，C.，Zhu，D.，Lee，S.，Bess，C.，Blankenburg，K.，Forbes，L.，Fu，Q.，Gubbala，S.，Hirani，K.，Jayaseelan，J.C.，Lara，F.，Munidasa，M.，Palculict，T.，Patil，S.，Pu，L.-L.，Saada，N.，Tang，L.，Weissenberger，G.，Zhu，Y.，Hemphill，L.，Shang，Y.，Youmans，B.，Ayvaz，T.，Ross，M.，Santibanez，J.，Aqrawi，P.，Gross，S.，Joshi，V.，Fowler，G.，Nazareth，L.，Reid，J.，Worley，K.，Petrosino，J.，Highlander，S.和Gibbs，R.

标题直接提交

期刊提交(20-JUN-2007)Molecular Virology and Microbiology and the Human Genome Sequencing Center，Baylor College of Medicine，One Baylor Plaza，Houston，TX 77030，USA

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_022222

基因座 NC_022222 2736560 bp DNA环形CON 17-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌金黄色亚种6850，完整基因组

登录号 NC_022222

版本 NC_022222.1 GI：537441500

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02604264

组装：GCF_000462955.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种6850

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种6850

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2736560)

作者 Fraunholz，M.，Bernhardt，J.，Schuldes，J.，Daniel，R.，Hecker，M.和Sinha，B.

标题 Complete Genome Sequence of Staphylococcus aureus 6850，a Highly Cytotoxic and Clinically Virulent Methicillin-Sensitive Strain with Distant Relatedness至Prototype Strains

期刊 Genome Announc 1(5)(2013)

PUBMED 24072870

备注发布状态：仅在线

参考2 (碱基1至2736560)

作者 Fraunholz，M.J.，Bernhardt，J.，Hecker，M.，Schuldes，J.，Daniel，R.和Sinha，B.

标题直接提交

期刊提交(26-AUG-2013)Department of Microbiology，University of Wuerzburg，Am Hubland，Wuerzburg 97074，Germany

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_021670

基因座 NC_021670 2980548 bp DNA环形CON 07-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌Bmb9393，完整基因组

登录号 NC_021670

版本 NC_021670.1 GI：521210823

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02603524

组装：GCF_000418345.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌Bmb9393

生物体金黄色葡萄球菌Bmb9393

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2980548)

作者 Costa，M.O.，Beltrame，C.O.，Ferreira，F.A.，Botelho，A.M.，Lima，N.C.，Souza，R.C.，de Almeida，L.G.，Vasconcelos，A.T.，Nicolas，M.F.和Figueiredo，A.M.

标题 Complete Genome Sequence of a Variant of the Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ST239 Lineage，Strain BMB9393，Displaying Superior Ability至Accumulate ica-Independent Biofilm

期刊 Genome Announc 1(4)(2013)

PUBMED 23929475

备注发布状态：仅在线

参考2 (碱基1至2980548)

作者 Costa，M.O.C.，Beltrame，C.O.，Lima，N.C.B.，Almeida，L.G.P.，Vasconcelos，A.T.R.，Ferreira，F.A.，Nicolas，M.F.和Figueiredo，A.M.S.

标题直接提交

期刊提交(15-APR-2013)Labinfo，LNCC-Laboratorio Nacional de Computacao Cientifica，Rua Getulio Vargas 333，Petropolis，RJ 25651070，Brazil

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_017351

基因座 NC_017351 2846546 bp DNA环形CON 07-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌金黄色亚种11819-97，完整基因组

登录号 NC_017351

版本 NC_017351.1 GI：385780298

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02603886

组装：GCF_000239235.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种11819-97

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种11819-97

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2846546)

作者 Stegger，M.，Price，L.B.，Larsen，A.R.，Gillece，J.D.，Waters，A.E.，Skov，R.和Andersen，P.S.

标题 Genome sequence of Staphylococcus aureus strain 11819-97，an ST80-IV European community-acquired methicillin-resistant isolate

期刊 J.Bacteriol.194(6)，1625-1626(2012)

PUBMED 22374956

参考2 (碱基1至2846546)

作者 Stegger，M.，Price，L.B.，Larsen，A.R.，Gillece，J.D.，Waters，A.E.，Skov，R.和Andersen，P.S.

标题直接提交

期刊提交(13-DEC-2011)Department of Microbiological Surveillance and Research，Statens Serum Institut，Oerestads Boulevard 5，2300 Copenhagen S，5 Artillerivej，Denmark

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_002953

基因座 NC_002953 2799802 bp DNA环形CON 07-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌菌株MSSA476，完整基因组

登录号 NC_002953

版本 NC_002953.3 GI：49484912

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

组装：GCF_000011525.1

关键词 RefSeq；完整基因组

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种MSSA476

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种MSSA476

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2799802)

作者 Holden，M.T.，Feil，E.J.，Lindsay，J.A.，Peacock，S.J.，Day，N.P.，Enright，M.C.，Foster，T.J.，Moore，C.E.，Hurst，L.，Atkin，R.，Barron，A.，Bason，N.，Bentley，S.D.，Chillingworth，C.，Chillingworth，T.，Churcher，C.，Clark，L.，Corton，C.，Cronin，A.，Doggett，J.，Dowd，L.，Feltwell，T.，Hance，Z.，Harris，B.，Hauser，H.，Holroyd，S.，Jagels，K.，James，K.D.，Lennard，N.，Line，A.，Mayes，R.，Moule，S.，Mungall，K.，Ormond，D.，Quail，M.A.，Rabbinowitsch，E.，Rutherford，K.，Sanders，M.，Sharp，S.，Simmonds，M.，Stevens，K.，Whitehead，S.，Barrell，B.G.，Spratt，B.G.和Parkhill，J.

标题 Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains：evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance

期刊 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(26)，9786-9791(2004)

PUBMED 15213324

参考2 (碱基1至2799802)

作者 Holden，M.T.G.

标题直接提交

期刊提交(23-JUN-2004)Submitted on behalf of the Pathogen Sequencing Unit，Sanger Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB 10 1SA，E-mail：mh3@sanger.ac.uk

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_017337

基因座 NC_017337 2832478 bp DNA环形CON 07-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌金黄色亚种ED133，完整基因组

登录号 NC_017337

版本 NC_017337.1 GI：384546269

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02604166

组装：GCF_000210315.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种ED133

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种ED133

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2832478)

作者 Guinane，C.M.，Ben Zakour，N.L.，Tormo-Mas，M.A.，Weinert，L.A.，Lowder，B.V.，Cartwright，R.A.，Smyth，D.S.，Smyth，C.J.，Lindsay，J.A.，Gould，K.A.，Witney，A.，Hinds，J.，Bollback，J.P.，Rambaut，A.，Penades，J.R.和Fitzgerald，J.R.

标题 Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus reveals insights into the origin and molecular basis of ruminant host adaptation

期刊 Genome Biol Evol 2，454-466(2010)

PUBMED 20624747

备注发布状态：仅在线

参考2 (碱基1至2832478)

作者 Guinane，C.M.，Ben Zakour，N.L.，Tormo-Mas，M.A.，Weinert，L.A.，Lowder，B.V.，Cartwright，R.A.，Smyth，D.S.，Smyth，C.J.，Lindsay，J.，Gould，K.A.，Witney，A.，Hinds，J.，Bollback，J.P.，Rambaut，A.，Penades，J.and Fitzgerald，J.R.

标题直接提交

期刊提交(29-MAR-2010)The Roslin Institute and Centre for Infectious Diseases，Royal(Dick)School of Veterinary Studies，University of Edinburgh，The Chancellor′s Building，New Royal Infirmary，49 Little France Crescent，Edinburgh EH16 4SB，United Kingdom

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_018608

基因座 NC_018608 2782313 bp DNA环形CON 07-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌08BA02176，完整基因组

登录号 NC_018608

版本 NC_018608.1 GI：404477334

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02603722

组装：GCF_000296595.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌08BA02176

生物体金黄色葡萄球菌08BA02176

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2782313)

作者 Golding，G.R.，Bryden，L.，Levett，P.N.，McDonald，R.R.，Wong，A.，Graham，M.R.，Tyler，S.，Van Domselaar，G.，Mabon，P.，Kent，H.，Butaye，P.，Smith，T.C.，Kadlec，K.，Schwarz，S.，Weese，S.J.和Mulvey，M.R.

标题 whole-genome sequence of livestock-associated st398 methicillin-resistant Staphylococcus aureus Isolated from Humans in Canada

期刊 J.Bacteriol.194(23)，6627-6628(2012)

PUBMED 23144384

参考2 (碱基1至2782313)

标题直接提交

期刊提交(31-AUG-2012)Antimicrobial Resistance and Nosocomial Infections，Public Health Agency of Canada，National Microbiology Laboratory，1015 Arlington Street，Winnipeg，Manitoba R3E 3R2，Canada

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_007795

基因座 NC_007795 2821361 bp DNA环形CON 16-DEC-2014

定义金黄色葡萄球菌金黄色亚种NCTC 8325染色体，完整基因组

登录号 NC_007795

版本 NC_007795.1 GI：88193823

DBLINK 生物项目：PRJNA57795

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种NCTC 8325

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种NCTC 8325

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2821361)

作者 Gillaspy，A.F.，Worrell，V.，Orvis，J.，Roe，B.A.，Dyer，D.W.和Iandolo，J.J.

标题 The Staphylococcus aureus NCTC8325 Genome

期刊 (于)Fischetti，V.，Novick，R.，Ferretti，J.，Portnoy，D.和Rood，J.(编)；GRAM POSITIVE PATHOGENS；ASM Press(2006)

参考2 (碱基1至2821361)

CONSRTM NCBI基因组计划

标题直接提交

期刊提交(18-FEB-2006)National Center for Biotechnology Information，NIH，Bethesda，MD 20894，USA

参考3 (碱基1至2821361)

作者 Gillaspy，A.F.，Worrell，V.，Orvis，J.，Roe，B.A.，Dyer，D.W.和Iandolo，J.J.

标题直接提交

期刊提交(27-JAN-2006)Microbiology and Immunology，The University of Oklahoma Health Sciences Center，940 Stanton L.Young Boulevard，Oklahoma City，OK 73104，USA

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_021059

基因座 NC_021059 2864125 bp DNA环形CON 01-MAR-2015

定义金黄色葡萄球菌M1，完整基因组

登录号 NC_021059

版本 NC_021059.1 GI：479328021

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

组装：GCF_000367745.1

关键词 RefSeq；完整基因组

来源金黄色葡萄球菌M1

生物体金黄色葡萄球菌M1

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1

作者 Larner-Svensson，H.，Worning，P.，Bartels，M.D.，Hestbjerg Hansen，L.，Boye，K.和Westh，H.

标题 Complete Genome Sequence of Staphylococcus aureusStrain M1，a Unique t024-ST8-IVa Danish Methicillin-Resistant S.aureusClone

期刊 Genome Announc 1(3)(2013)

PUBMED 23792746

备注发布状态：仅在线

参考2 (碱基1至2864125)

作者 Worning，P.

标题直接提交

期刊提交(18-MAR-2013)Dept.of Clinical Microbiology，Hvidovre Hospital，Kettegaard Alle 30，DK-2650，DENMARK

http：//www，genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_021554

基因座 NC_021554 2850503 bp DNA环形CON 07-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌CA-347，完整基因组

登录号 NC_021554

版本 NC_021554.1 GI：514064966

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02603909

组装：GCF_000412775.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌CA-347

生物体金黄色葡萄球菌CA-347

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2850503)

作者 Stegger，M.，Driebe，E.M.，Roe，C.，Lemmer，D.，Bowers，J.R.，Engelthaler，D.M.，Keim，P.和Andersen，P.S.

标题 Genome Sequence of Staphylococcus aureusStrain CA-347，a USA600 Methicillin-Resistant Isolate

期刊 Genome Announc 1(4)(2013)

PUBMED 23887918

备注发布状态：仅在线

参考2 (碱基1至2850503)

作者 Stegger，M.，Driebe，E.M.，Roe，C.，Lemmer，D.，Engelthaler，D.M.，Keim，P.和Andersen，P.S.

标题直接提交

期刊提交(10-JUN-2013)CPHCP，TGen North，3051 W.Shamrell Blvd.，Ste.106，Flagstaff，AZ 86001，USA

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_016912

基因座 NC_016912 2692570 bp DNA环形CON 07-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌金黄色亚种VC40，完整基因组

登录号 NC_016912

版本 NC_016912.1 GI：379013365

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02603393

组装：GCF_000245495.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种VC40

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种VC40

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2692570)

作者 Sass，P.，Berscheid，A.，Jansen，A.，Oedenkoven，M.，Szekat，C.，Strittmatter，A.，Gottschalk，G.和Bierbaum，G.

标题 Genome sequence of Staphylococcus aureusVC40，a vancomycin-and daptomycin-resistant strain，to study the genetics of development of resistance to currently applied last-resort antibiotics

期刊 J.Bacteriol.194(8)，2107-2108(2012)

PUBMED 22461548

参考2 (碱基1至2692570)

作者 Sass，P.，Berscheid，A.，Jansen，A.，Oedenkoven，M.，Szekat，C.，Strittmatter，A.，Gottschalk，G.和Bierbaum，G.

标题直接提交

期刊提交(25-AUG-2011)Institute of Medical Microbiology，Immunology and Parasitology，University of Bonn，Sigmund-Freud-Str.25，Bonn 53105，Germany

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_022226

基因座 NC_022226 2751266 bp DNA环形CON 01-MAR-2015

定义金黄色葡萄球菌金黄色亚种CN1，完整基因组

登录号 NC_022226

版本 NC_022226.1 GI：537459744

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN02603420

组装：GCF_000463055.1

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种CN1

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种CN1

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2751266)

作者 Chen，Y.，Chatterjee，S.S.，Porcella，S.F.，Yu，Y.S.和Otto，M.

标题 Complete genome sequence of a Panton-Valentine leukocidin-negative community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureusstrain of sequence type 72 from Korea

期刊 PLoS ONE 8(8)，E72803(2013)

PUBMED 23977354

备注发布状态：仅在线

参考2 (碱基1至2751266)

作者 Otto，M.和Porcella，S.F.

标题直接提交

期刊提交(04-DEC-2012)Laboratory of Human Bacterial Pathogenesis，NIAID/NIH，9000Rockville Pike，Bethesda，MD 20892，USA

http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_022113

基因座 NC_022113 2756919 bp DNA环形CON 07-FEB-2015

定义金黄色葡萄球菌金黄色亚种55/2053，完整基因组

登录号 NC_022113NZ_ACJR01000000-NZ_ACJR01000094 NZ_GG700533-NZ_GG700558

版本 NC_022113.1 GI：532358222

DBLINK 生物项目：PRJNA224116

生物样品：SAMN00103091

组装：GCF_000160335.2

关键词 RefSeq.

来源金黄色葡萄球菌金黄色亚种55/2053

生物体金黄色葡萄球菌金黄色亚种55/2053

细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌属

参考1 (碱基1至2756919)

作者 Feldgarden，M.，Robinson，A.，Wong，A.，Smyth，D.，Young，S.K.，Zeng，Q.，Gargeya，S.，Fitzgerald，M.，Haas，B.，Abouelleil，A.，Alvarado，L.，Arachchi，H.M.，Berlin，A.，Brown，A.，Chapman，S.B.，Chen，Z.，Dunbar，C.，Gearin，G.，Goldberg，J.，Griggs，A.，Gujja，S.，Heiman，D.，Howarth，C.，Larson，L.，Lui，A.，MacDonald，P.J.P.，Montmayeur，A.，Murphy，C.，Neiman，D.，Pearson，M.，Priest，M.，Roberts，A.，Saif，S.，Shea，T.，Sisk，P.，Stolte，C.，Sykes，S.，Wortman，J.，Nusbaum，C.和Birren，B.

CONSRTM The Broad Institute Genome Sequencing Platform

标题 The Genome Sequence of Staphylococcus aureusstrain 55-2053

期刊未出版

参考2 (碱基1至2756919)

CONSRTM The Broad Institute Genome Sequencing Platform

标题直接提交

期刊提交(10-MAY-2013)Broad Institute of MIT and Harvard，7Cambridge Center，Cambridge，MA 02142，USA

参考3 (碱基1至2756919)

作者 Feldgarden，M.，Robinson，A.，Wong，A.，Smyth，D.，Young，S.K.，Zeng，Q.，Koehrsen，M.，Godfrey，P.，Alvarado，L.，Berlin，A.，Borenstein，D.，Chen，Z.，Engels，R.，Freedman，E.，Gellesch，M.，Goldberg，J.，Griggs，A.，Gujja，S.，Heiman，D.，Hepburn，T.，Howarth，C.，Jen，D.，Larson，L.，Lewis，B.，Mehta，T.，Park，D.，Pearson，M.，Roberts，A.，Saif，S.，Shea，T.，Shenoy，N.，Sisk，P.，Stolte，C.，Sykes，S.，Walk，T.，White，J.，Yandava，C.，Wirth，D.F.，Galagan，J.，Nusbaum，C.和Birren，B.

CONSRTM The Broad Institute Genome Sequencing Platform

标题直接提交

期刊提交(02-APR-2009)Broad Institute of MIT and Harvard，7Cambridge Center，Cambridge，MA 02142，USA

此外，也可以将遗传变异注释到来自利用的基因组构建的泛基因组中，并且可以利用连续数字编号。在本发明的方法中，泛基因组的构建没有特别限制，可以使用已知方法完成。

然而，可以在公众可获得的数据库如在NCBI中找到其它合适的参考基因组(例如在实例中使用的，但也用于其他微生物)。

基因突变与抗微生物药物如抗生素抗性之间的关联的统计学分析未被具体限定，并且可以例如用50、100、200、300、400、800或者900的样品大小n，以及例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小的显著性水平(α-误差-水平)，根据例如数据的量，以不同的方式进行，例如利用方差分析(ANOVA)、学生t-检验或者费舍尔精确检验进行。可以获得基因组中各个遗传变异和/或基因组中的每个位置以及所测试的所有抗生素、一组抗生素或者单个抗生素的统计值。如果需要，也可以调整获得的p值用于统计误差。

为了统计学上合理的结果，应当抽取大量个体，其中n＝50、100、200、300、400、800或900，以及显著性水平(α-误差-水平)为，例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小。根据某些实施方案，对于n＝200、300、400、800或900，可以获得特别显著的结果。

为了统计学上合理的结果，应当抽取大量个体，其中n＝50或更多、100或更多、200或更多、300或更多、400或更多、800或更多或者900或更多，以及显著性水平(α-误差-水平)为，例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小。根据某些实施方案，对于n＝200或更多、300或更多、400或更多、800或更多、或者900或更多，可以获得特别显著的结果。

在对超过900株(例如987株)葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的个体菌株进行上述过程后，获得了表1和表2中公开的数据，用于进行遗传变异和抗微生物药物如抗生素的抗性尤其是甲氧西林抗性之间的统计学最佳关联。因此，就上述数个参考基因组而言，表1和表2中给出的位置中的遗传变异被证明是抗微生物药物如抗生素抗性的有效标志物。

当提及第二数据集时，其中所述第二数据集例如包含分别是多种临床分离株的一组抗微生物药物(例如抗生素)抗性，在本发明的范围内，这还可以指自我学习数据库，不管何时分析新样品，均可以将该样品列入第二数据集，从而扩展该数据库。因此第二数据集不一定是静止的，并且由于自我学习，其可以通过外部输入或者通过并入新数据来扩展。但是，这不局限于本发明的第三方面，还适用于本发明提及第二数据集的其它方面，其不一定必须涉及抗微生物药物抗性。在适用的情况下，例如在第三方面，这同样适用于第一数据集。

根据某些实施方案，利用费舍尔检验进行本发明的方法中的统计学分析，其中p＜10^-6，优选地p＜10^-9。

根据某些实施方案，本发明第一方面的方法以及相关方法，例如根据第二方面、第三方面和第四方面的方法可以包括将不同的基因位点相互关联。这样，可以达到甚至更高的统计学显著性。

根据第一方面的方法以及如上所述的相关方法的某些实施方案，可以通过在提供有不同浓度的抗微生物药物(例如抗生素)的琼脂板上培养微生物的临床分离株来提供第二数据集，以及可以通过采用抑制各微生物(例如金黄色葡萄球菌)生长的最小浓度的板来获得第二数据。

根据第一方面的方法以及相关方法的某些实施方案，抗微生物药物例如抗生素类药物选自：β-内酰胺类、β-内酰胺抑制剂类、喹啉类及其衍生物(如氟喹诺酮类)、氨基糖苷类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、硝基呋喃类、恶唑烷酮聚酮类，分别地四环素类，以及叶酸合成抑制剂(例如，苯衍生的/磺胺类抗生素)，优选地，其选自：阿莫西林/克拉维酸(Amoxicillin/Clavulanate)、氨苄西林(Ampicillin)、氨苄西林/舒巴坦(Ampicillin/Sulbactam)、阿奇霉素(Azithromycin)、头孢噻酚(Cefalothin)、头孢唑啉(Cefazolin)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢曲松(Ceftriaxone)、头孢呋辛(Cefuroxime)、氯霉素(Chloramphenicol)、环丙沙星(Ciprofioxacin)、克林霉素(Clindamycin)、达托霉素(Daptomycin)、厄他培南(Ertapenem)、红霉素(Erythromycin)、磷霉素(Fosfomycin)、夫西地酸(Fusidic acid)、庆大霉素(Gentamicin)、亚胺培南(Imipenem)、左氧氟沙星(Levofioxacin)、利奈唑胺(Linezolid)、美罗培南(Meropenem)、甲氧西林(Methicillin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、莫匹罗星(Mupirocin)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、苯唑西林(Oxacillin)、盘尼西林G(Penicillin G)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/Tazobactam)、奎奴普丁/达福普丁(Quinupristin/Dalfopristin)、利福平(Rifampicin)、替考拉宁(Teicoplanin)、四环素(Tetracycline)、替加环素(Tigecycline)、妥布霉素(Tobramycin)、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑(Trimethoprim/Sulfamethoxazole)和万古霉素(Vancomycin)。

根据第二方面，本发明公开了确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的微生物尤其是细菌微生物的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含微生物尤其是细菌微生物的样品；

b)如通过本发明的第一方面的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的至少一个位置的至少一个基因变体的存在，其中存在所述至少一个基因变体表明所述患者感染具有抗微生物药物抗性的微生物。

此外，根据某些实施方案，微生物可以是葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌，以及药物甲氧西林和/或如下文(例如，就第八和第九方面而言)所述的药物。

用这种方法，可以确定与抗微生物药物例如抗生素抗性关联的微生物，如葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌(例如，微生物尤其是细菌微生物的未知菌株的临床分离株)基因组中的任何突变，并且可以建立完整的抗微生物药物如抗生素抗性谱。

此外，在此，可以如本发明第一方面所述，实施不同的步骤。

根据这一方面，可以使用测序方法确定患者感染微生物尤其是细菌微生物(例如葡萄球菌属，尤其是金黄色葡萄球菌)，以及与常规方法相比，可以在短时间内确定微生物(例如葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌)的抗微生物药物如抗生素的抗性。

在第三方面，本发明涉及选择对感染了可能具有抗性的微生物尤其是细菌微生物的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含微生物尤其是细菌微生物的样品；

b)如通过本发明的第一方面的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的至少一个位置中至少一个基因变体的存在，其中存在所述至少一个基因变体表明对一种或多种抗微生物药物的抗性；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗所述微生物尤其是细菌微生物感染的一种或多种抗微生物药物。

可以与本发明第二方面类似地实施这一方法，并且使得可以为任何未知的微生物尤其是细菌微生物(例如，金黄色葡萄球菌)感染快速选择合适的抗生素治疗。

在这一方法以及类似方法中，不需要进行比对，因为未知样品可以在基因组或基因组序列产生后直接与第二数据集关联，并因此可以确定遗传变异和抗微生物药例如抗生素抗性。例如，可以使用已知技术来组装第一数据集。

根据某些实施方案，利用费舍尔检验进行本发明的方法中的统计学分析，其中p＜10^-6，优选地p＜10^-9。而且，根据某些实施方案，该方法还包括使不同基因位点彼此关联。

本发明的第四方面涉及获得、分别确定微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的抗微生物药物如抗生素的抗性谱的方法，其包括：

获得或提供微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的至少一个基因序列；以及

如通过本发明的第一方面的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的所述临床分离株的至少一个基因序列中基因变体的存在。

利用这一方法，可以确定微生物(例如金黄色葡萄球菌)未知分离株的抗微生物药物(例如抗生素)抗性。

在图1中示意性地显示了在这个方面中描述的用于诊断检测的简单读出概念。

根据图1，例如使用下一代测序(NGS)可以将样品1(如来自患者的血液)用于分子测试2，然后进行分子指纹分析3(例如在NGS的情况下)，组装所选择的基因组/质粒区域的序列或者全基因组例如在NGS的情况下，组装选择的基因组/质粒区域的序列或整个基因组获取分子指纹3。然后，将其与包含如通过第一方面的方法获得的数个参考基因组和/或泛基因组的参考文库4进行比较，即将所选序列或整个序列与一个或多个参考序列和/或泛基因组进行比较，并将遗传变异(SNP、序列/基因的添加/缺失等)与参考文库的参考菌株的敏感性谱/抗性谱关联。本文的参考文库4包含许多基因组和/或泛基因组，并且不同于参考基因组。然后报告结果5，其可以包括ID(病原体鉴定)，即样品中鉴定的所有(致病的)物种的列表，以及AST(抗微生物敏感性测试)，即包括基于结构变异的所列出的所有物种的敏感性/抗性谱的列表。

此外，根据某些实施方案，在第三和第四方面中，可以如本发明的第一方面所述实施不同步骤，并且微生物可以是葡萄球菌属，尤其是金黄色葡萄球菌，以及根据某些实施方案，抗生素可以是甲氧西林和/或如下所述的另一种抗生素。在这方面，应该指出的是，对甲氧西林的抗性可以表明尤其是在葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌中，对β-内酰胺抗生素的抗性。

在本发明第五方面涉及一种或多种计算机程序产品，其包含计算机可执行的指令，所述指令被执行时实施本发明的第一方面至第四方面中任一项方法。

在某些实施方案中，计算机程序产品是存储用于执行所述方法的计算机程序的程序命令或程序代码的计算机程序产品。根据某些实施方案，计算机程序产品是存储介质。如上所示，本发明的计算机程序产品可以自我学习，例如，对于第一和第二数据集而言。

为了从高度复杂的遗传数据中获得最可能的信息并开发用于诊断和治疗用途以及本发明方法的可稳定适用于临床常规过程的最优模型，全面的计算机模拟分析可能是必要的。所提出的原则是基于不同方法的组合，例如组装微生物的基因组，至少部分地并任选地将基因组注释至一个或多个参考序列和/或泛基因组，或在第二、第三和/或第四方面中，用一个或多个参考序列和/或泛基因组确定临床分离株的序列数据的比对，以及将各个样品(例如，来自各个患者)(分别地未知的临床分离株)中所发现的遗传变异与所有参照和药物(例如抗生素)或它们中的仅一个或一些相关联，以及寻找一种或数种药物和一种或数种菌株中发生的突变。

利用以上步骤，产生了一系列涉及一个或多个参考基因组和/或泛基因组的遗传变异。这些可储存在数据库中，并且统计模型可以源自所述数据库。统计模型可以基于至少一个或多个位置中至少一个或多个遗传变异。可以自遗传变异和位置组合成可训练的统计模型。可以产生此类模型的算法的实例是关联规则、支持向量机(Support Vector Machines)、决策树、决策森林、判别分析、聚类法(Cluster-Method)以及更多算法。

训练的目标是在常规程序期间允许可再现的、标准化的应用。

为此，例如，可将来自待诊断患者的微生物的基因组或基因组部分进行测序。然后，可从序列数据得到核心特征，其可用于预测抗性。这些是用于最终模型的数据库中的点，即至少一个遗传变异或至少一个位置，以及遗传变异的组合等。

可将对应的特征用作统计模型的输入，从而使得能够进行新患者的预后。可将关于所有微生物(例如金黄色葡萄球菌)针对所有药物或仅一些药物或一种药物(例如抗生素)的所有抗性的信息整合进计算机决策支持工具中，还可将对应的指令(例如EUCAST)整合进计算机决策支持工具中，以便仅给出与指令一致的治疗建议。

本发明的第十方面涉及根据第五方面的计算机程序产品的用途，例如，用于获得本发明第四方面的微生物的抗微生物药物(例如抗生素)的抗性谱和/或用于本发明第二方法的诊断方法和/或用于选择本发明的第三方面的治疗和/或本发明的第一方面的方法。

本发明的第六方面涉及确定患者感染对抗微生物药物如抗生素治疗可能具有抗性的葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表1中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少两个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少两个遗传变异表明所述患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置。

如上所述，在表1中，就来自NCBI的一个或多个已知参考基因组而言(具有在“参考基因组”栏中给出的NCBI编号和在“基因组名”栏中给出的基因组名称)，给出了每个变异(以连续数字1-50给出)的遗传变异的位置(命名为“位置”，其中R是反向，F是正向)。

本文中，患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的葡萄球菌属尤其金黄色葡萄球菌意味着患者感染了金黄色葡萄球菌，其中不清楚是否葡萄球菌属菌株尤其金黄色葡萄球菌菌株对特定抗微生物药物治疗敏感或者不清楚是否其对抗微生物药物具有抗性。

在上述步骤b)以及相应的步骤中，确定至少两个位置中至少一个遗传变异，从而总共确定至少两个遗传变异，其中两个遗传变异在不同位置中。同样，需要注意的是，在表1中，可以将某个位置注释到多于一个参考基因，因此，在此，仅使用不同的位置，而不是注释到不同参考基因组的相同位置。

在该方法以及本发明的其他方法中，可以以任何方式，优选非侵入性方式，提供或获得样品，并且可以是例如作为体外样品提供或制备成体外样品。

根据某些方面，在本发明的任何方法中，确定在至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个位置中的遗传变异，例如，在至少两个位置中，或者在至少三个位置中。并非仅测试单个位置，数个变体位置的组合可以提高精度并进一步减少受其他因素影响的假阳性结果。因此，特别优选确定在选自表1的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个(或更多个)位置中遗传变异的存在。

对于上述位置，即表1中所示的位置，可以观察到对至少一种抗微生物药物(例如抗生素)抗性的最高概率，其p值小于10^-140，尤其是小于10^-160，表明这些值(n＝987；α＝10^-9)的高度显著性。关于表1的细节可以取自实施例中公开的表2(分别为表2a和表2b)。具有确定的至少两个位置的遗传变异，可以确定抗微生物药物(例如抗生素)的高概率。因此，如上文和下文所述，就甲氧西林抗性/敏感性而言，表1中的基因代表在葡萄球菌属，尤其是金黄色葡萄球菌的基因组中观察到遗传变异的50个最佳基因。

根据某些方面，在该方法以及本发明的其他方法中，获得或提供来自患者的包含或疑似包含至少一种葡萄球菌属物种的样品，可以包括下述：

例如，提供或获得脊椎动物(例如人类)的样品，以及通过未特别限定的记录核酸的已知方法来记录核酸序列(例如DNA或RNA序列)。例如，可以通过测序方法记录核酸，其中任何测序方法均适合，尤其是这样的测序方法：可在短时间内对大批样品成分(如血液样品成分)中包含的核酸和/或核酸片段和/或其部分进行分析，这包括葡萄球菌属，尤其是金黄色葡萄球菌的核酸和/或核酸片段和/或其部分。例如，可以利用聚合酶链式反应(PCR)，尤其是多重PCR或高通量测序或下一代测序，优选利用高通量测序进行测序。对于测序，优选使用体外样品。

通过测序获得的数据可以是任何形式，然后可以如本发明的第一至第四方面所述进行分析。

在第七方面，本发明涉及选择对感染了可能具有抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

在该方法中，步骤a)获得或提供样品，以及步骤b)确定至少一个遗传变异的存在，与第六方面的方法相同。

然后步骤c)中至少一种或多种抗微生物药物例如抗生素的鉴定基于步骤b)中获得的结果，并且对应于与遗传变异相关的抗微生物药物例如抗生素药物。一旦排除了这些抗微生物药物例如抗生素，其余的抗微生物药物(例如抗生素类药物/抗生素类)可以在步骤d)中选择为适于治疗的药物。

在说明书中，第六方面和第七方面的参照也适用于第11方面、第12方面、第13方面和第14方面，是指相同位置，除非从上下文中清楚地看出它们不适用。

根据第六方面或第七方面的某些实施方案，在第六方面或第七方面的方法中，抗微生物药物例如抗生素选自下述的至少一种：β-内酰胺类、β-内酰胺抑制剂类、喹啉类及其衍生物(如氟喹诺酮类)、氨基糖苷类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、硝基呋喃类、恶唑烷酮聚酮类，分别地四环素类，以及叶酸合成抑制剂(例如苯衍生的/磺胺类抗生素)，尤其选自：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢噻酚、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素、厄他培南、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、甲氧西林、莫西沙星、莫匹罗星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、盘尼西林G、哌拉西林/他唑巴坦、奎奴普丁/达福普丁、利福平、替考拉宁、四环素、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑和万古霉素，尤其是甲氧西林。

在本发明的方法中，根据某些实施方案可以确定葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌对一种或多种抗微生物药物如抗生素药物的抗性。

根据本发明的第六方面和/或第七方面的某些实施方案，确定核酸序列信息或遗传变异的存在包括确定在单个位置存在单个核苷酸。因此，本发明包括检测在单个核苷酸位置存在单核苷酸多态性或突变的方法。

根据本发明的第六方面和/或第七方面的某些实施方案，可以确定金黄色葡萄球菌菌株对1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种、17种、18种、19种、20种或更多种抗生素药物的抗性。

根据本发明第六方面和/或第七方面的某些实施方案，检测的遗传变异是导致例如在来自各个基因的多肽中的改变的氨基酸序列的遗传变异，其中检测的遗传变异位于所述基因中。根据这一方面，检测的遗传变异因此可以导致多肽的截短形式(其中通过突变产生新的终止密码子)或在各自位置处具有氨基酸交换的多肽的突变形式。

根据本发明的第六方面和/或第七方面的某些实施方案，确定具有遗传变异的位置或存在遗传变异的位置的核酸序列信息包括确定包含具有遗传变异的位置的部分序列或整个序列。

根据本发明第六方面和/或第七方面的某些实施方案，确定具有遗传变异的位置或存在遗传变异的位置的核酸序列信息包括使用下一代测序或高通量测序方法。根据本发明第六方面和/或第七方面的优选实施方案，通过利用下一代测序或高通量测序方法测定葡萄球菌属菌株，尤其是金黄色葡萄球菌菌株的部分或全部基因组序列。

根据第六方面和/或第七方面的某些实施方案，确定核酸序列信息或遗传变异的存在包括确定葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的基因组的部分或全部序列，其中所述基因组的部分或全部序列包含至少一个具有遗传变异的位置。

本发明的第十一方面涉及治疗感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌的患者的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

e)用所述一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物治疗患者。

在文中，可以如第七方面所述实施步骤a)至步骤d)。步骤e)可以充分实施而不受限制，并且可以例如非侵入性地实施。

本发明的第十二方面公开确定患者感染对抗微生物药物如抗生素治疗可能具有抗性的葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表1中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少一个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少一个遗传变异表明所述患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置。

在第十三方面，本发明涉及选择对感染了可能具有抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表1中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少一个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少一个遗传变异表明对一种或多种抗微生物药物如抗生素药物的抗性，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

此外，在第十二方面和第十三方面中的步骤对应于第六方面或第七方面中的步骤，尽管仅确定至少一个基因中的突变。

本发明的第十四方面涉及治疗感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌的患者的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种金黄色葡萄球菌菌株的样品；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

e)用所述一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物治疗患者。

同样在本发明的第十四方面中，步骤a)至步骤d)类似于本发明第十一方面的方法中的步骤。步骤e)可以再次充分实施而不受限制，并且可以例如非侵入性地实施。

本发明的第八方面公开确定患者感染对抗微生物药物如抗生素治疗可能具有抗性的葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表3a和/或3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，尤其是具有就表3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少两个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少两个遗传变异表明所述患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置。

如上所述，在表3a和表3b中，就来自NCBI的一个或多个已知参考基因组而言(具有在“参考基因组”栏中给出的NCBI编号和在“基因组名”栏中给出的基因组名称)，给出了每个变异(以连续数字1-50给出)的遗传变异的位置(命名为“位置”，其中R是反向，F是正向)。

本文中，患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的葡萄球菌属物种尤其金黄色葡萄球菌意味着患者感染了葡萄球菌属物种尤其金黄色葡萄球菌，其中不清楚是否葡萄球菌属物种尤其金黄色葡萄球菌对特定抗微生物药物治疗敏感或者不清楚是否其对抗微生物药物具有抗性。

在上述步骤b)以及相应的步骤中，确定至少两个位置中至少一个遗传变异，从而总共确定至少两个遗传变异，其中两个遗传变异处于不同的位置。同样，需要注意的是，在表3a和表3b中，可以将某个位置注释到多于一个参考基因，因此，在此，仅使用不同的位置，而不是注释到不同参考基因组的相同位置。

在该方法以及本发明的其他方法中，可以以任何方式，优选非侵入性方式，提供或获得样品，并且可以是例如作为体外样品提供或制备成体外样品。

根据某些方面，在本发明的任何方法中，确定在至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个位置中的遗传变异，例如，在至少两个位置中，或者在至少三个位置中。并非仅测试单个位置，数个变体位置的组合可以提高精度并进一步减少受其他因素影响的假阳性结果。因此，特别优选确定在选自表3a和/或表3b中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个(或更多个)位置中遗传变异的存在。

对于上述位置，即表3a和/或表3b中所示的位置，可以观察到对至少一种抗微生物药物(例如抗生素)抗性的最高概率，其p值小于10^-160，尤其是小于10^-190，表明这些值(n＝985；α＝10^-9)的高度显著性。关于表3a和/或表3b中的细节可以取自实施例中公开的表4，尤其是表4a-d(就表3a而言)以及表4e-h(就表3b而言)。具有确定的至少两个位置的遗传变异，可以确定抗微生物药物(例如抗生素)的高概率。因此，表3a中的基因代表在葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌的基因组中观察到突变的50个最佳基因，尤其就对以下描述的抗生素的抗性而言，即选自：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢噻酚、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素、厄他培南、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、莫西沙星、莫匹罗星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、盘尼西林G、哌拉西林/他唑巴坦、奎奴普丁/达福普丁、利福平、替考拉宁、四环素、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑和万古霉素，而表3b中的基因代表对如下所述的葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌，对于抗微生物药物如抗生素敏感性测试，尤其就如上关于表3a的抗生素的抗性而言，可观察到相互关联的50个最佳基因。

根据某些方面，在该方法以及本发明的其他方法中，获得或提供来自患者的包含或疑似包含至少一种葡萄球菌属的样品，可以包括下述：

例如，提供或获得脊椎动物(例如人类)的样品，以及通过未特别限定的记录核酸的已知方法来记录核酸序列(例如DNA或RNA序列)。例如，可以通过测序方法记录核酸，其中任何测序方法均适合，尤其是这样的测序方法：可在短时间内对大批样品成分(如血液样品成分)中包含的核酸和/或核酸片段和/或其部分进行分析，这包括葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌的核酸和/或核酸片段和/或其部分。例如，可以利用聚合酶链式反应(PCR)，特别是多重PCR或高通量测序或下一代测序，优选利用高通量测序进行测序。对于测序，优选使用体外样品。

通过测序获得的数据可以是任何形式，然后可以如本发明的第一至第四方面所述进行分析。

在第九方面，本发明涉及选择对感染了可能具有抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表3a和/或3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，尤其是就具有表3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少两个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少两个遗传变异表明对一种或多种抗微生物药物如抗生素药物的抗性，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

在该方法中，步骤a)获得或提供样品，以及步骤b)确定至少一个遗传变异的存在，与第八方面的方法相同。

在说明书中，第八方面和第九方面的参考也适用于第15方面、第16方面、第17方面和第18方面，是指相同位置，除非从上下文中清楚地看出它们不适用。

根据第八方面和第九方面的某些实施方案，在第八方面和第九方面的方法以及本发明的其他方法中，抗微生物药物例如抗生素，选自下述的至少一种：β-内酰胺类、β-内酰胺抑制剂类、喹啉类及其衍生物(如氟喹诺酮类)、氨基糖苷类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、硝基呋喃类、恶唑烷酮聚酮类，分别地四环素类，以及叶酸合成抑制剂(例如苯衍生的/磺胺类抗生素)，尤其选自：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢噻酚、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素、厄他培南、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、甲氧西林、莫西沙星、莫匹罗星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、盘尼西林G、哌拉西林/他唑巴坦、奎奴普丁/达福普丁、利福平、替考拉宁、四环素、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑和万古霉素。在第八方面和/或第九方面，以及第十五方面至第十八方面，抗微生物药物如抗生素优选地选自下述的至少一种：β-内酰胺类、β-内酰胺抑制剂类、喹啉类及其衍生物(如氟喹诺酮类)、氨基糖苷类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、硝基呋喃类、恶唑烷酮聚酮类，分别地四环素类，以及叶酸合成抑制剂(例如苯衍生的/磺胺类抗生素)，尤其是选自：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢噻酚、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素、厄他培南、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、莫西沙星、莫匹罗星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、盘尼西林G、哌拉西林/他唑巴坦、奎奴普丁/达福普丁、利福平、替考拉宁、四环素、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑和万古霉素。

在本发明的方法中，根据某些实施方案可以确定葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌对一种或多种抗微生物药物如抗生素药物的抗性。

根据本发明的第八方面和/或第九方面的某些实施方案，确定核酸序列信息或遗传变异的存在包括确定在单个位置存在单个核苷酸。因此，本发明包括检测在单个核苷酸位置存在单核苷酸多态性或突变的方法。

根据本发明的第八方面和/或第九方面的某些实施方案，确定葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株对1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种、17种、18种、19种、20种或更多种抗生素药物的抗性。

根据本发明第八方面和/或第九方面的某些实施方案，检测的遗传变异是导致例如在来自各个基因的多肽中的改变的氨基酸序列的遗传变异，其中检测的遗传变异位于所述基因中。根据这个方面，检测的遗传变异因此可以导致多肽的截短形式(其中通过突变产生新的终止密码子)或在各自位置处具有氨基酸交换的多肽的突变形式。

根据本发明的第八方面和/或第九方面的某些实施方案，确定具有遗传变异的位置或存在遗传变异的位置的核酸序列信息包括确定包含具有遗传变异的位置的部分序列或整个序列。

根据本发明第八方面和/或第九方面的某些实施方案，确定具有遗传变异的位置或存在遗传变异的位置的核酸序列信息包括使用下一代测序或高通量测序方法。根据本发明第八方面和/或第九方面的优选实施方案，通过利用下一代测序或高通量测序方法测定葡萄球菌属菌株，尤其是金黄色葡萄球菌菌株的部分或全部基因组序列。

根据第八方面和/或第九方面的某些实施方案，确定核酸序列信息或遗传变异的存在包括确定葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的基因组的部分或全部序列，其中所述基因组的部分或全部序列包含至少一个具有遗传变异的位置。

根据本发明的第八方面和/或第九方面，以及第15方面、第16方面、第17方面和/或第18方面的某些实施方案，位置来自表3a，并且抗生素类别是表4a中相应位置给出的那些类别(列：显著_表型_类别)中的至少一种和/或抗生素是表4a中相应位置给出的那些抗生素(列：显著_表型)中的至少一种。

根据本发明的第八方面和/或第九方面，以及第15方面、第16方面、第17方面和/或第18方面的某些实施方案，位置来自表3a，并且至少一种抗生素来自表4d中相应位置给出的抗生素类别(列：最佳_表型_类别)和/或至少一种抗生素是表4d中相应位置给出的抗生素(列：最佳_表型)。

根据本发明的第八方面和/或第九方面，以及第15方面、第16方面、第17方面和/或第18方面的某些实施方案，位置来自表3b，并且抗生素类别是表4e中相应位置给出的那些类别(列：显著_表型_类别)中的至少一种和/或抗生素是表4e中相应位置给出的那些抗生素(列：显著_表型)中的至少一种。

根据本发明的第八方面和/或第九方面，以及第15方面、第16方面、第17方面和/或第18方面的某些实施方案，位置来自表3b，并且至少一种抗生素来自表4h中相应位置给出的抗生素类别(列：最佳_表型_类别)和/或至少一种抗生素是表4h中相应位置给出的抗生素(列：最佳_表型)。

本发明的第十五方面涉及治疗感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌的患者的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

e)用所述一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物治疗患者。

在文中，可以如第九方面所述实施步骤a)至步骤d)。步骤e)可以充分实施而不受限制，并且可以例如非侵入性地实施。

本发明的第十六方面公开确定患者感染对抗微生物药物如抗生素治疗可能具有抗性的葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表3a和/或3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，尤其是就具有表3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少一个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少一个遗传变异表明所述患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置。

在第十七方面，本发明选择对感染了可能具有抗性的葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

b)确定就具有表3a和/或3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，尤其是就具有表3b中给出的基因组名称的参考基因组而言，来自由编号1-50注释的位置的至少一个位置中至少一个遗传变异的存在，其中存在所述至少一个遗传变异表明对一种或多种抗微生物药物如抗生素药物的抗性，其中对于一些位置，在不同参考基因组中注释了多于一个的位置；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

此外，在第十六方面和第十七方面中的步骤对应于第八方面或第九方面中的步骤，尽管仅确定至少一个基因中的突变。

本发明的第十八方面涉及治疗感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌的患者的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种葡萄球菌属菌株尤其是金黄色葡萄球菌菌株的样品；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌感染的一种或多种抗微生物药物如抗生素药物。

e)用所述一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物治疗患者。

同样在本发明的第十八方面中，步骤a)至步骤d)类似于本发明第十五方面的方法中的步骤。步骤e)可以再次充分实施而不受限制，并且可以例如非侵入性地实施。

实施例

现在将参考本发明的一些实施例详细描述本发明。但是这些实施例是说明性的，并且不限制本发明的范围。

实施例1：确定MRSA/MSSA表型的基因抗性谱

除了经典的抗微生物剂敏感性测试之外，还对一组1001种金黄色葡萄球菌样品(其中995种具有组装体，987种具有组装体和MRSA/MSSA表型)的相同分离株进行全基因组测序。这些987种样品被用于进一步分析。全基因组测序允许进行全基因组相关性研究，以找到与针对一种或数种药物的抗性显著相关的基因组和质粒中的基因变体(例如，点突变、小的插入和缺失、较大的结构变体、质粒拷贝数增加、基因剂量效应)。该方法还允许将基因组中的相关位点相互比较。

在该方法中，涵盖了基因抗性的不同来源以及细菌如何变得具有抗性的不同方式。通过测量在广泛的地理区域内并经过三十年的宽时间跨度收集的临床分离株，试图产生远超出实验室产生的抗性机制的人工步骤的全貌。

以下给出了详细步骤：

细菌菌株

如上所述，发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento，CA)的微生物菌株保藏中心选择了1001种金黄色葡萄球菌用于敏感性测试和全基因组测序，其中987种被进一步分析。为了包括如何获得抗性机制的不同方式的数据，分析了三十多年来收集的金黄色葡萄球菌分离株，以便可能发现水平的基因转移。

确定甲氧西林抗性/敏感性

通过根据标准程序培养来确定MRSA菌株和MSSA菌株，确定菌株的表型，并通过利用例如遗传信息的进一步测试进行确认。

DNA提取

利用具有下述改变的MagAttract HMW DNA试剂盒(Qiagen)步骤进行DNA的提取和纯化。达到2x10⁹个细菌(1ml培养物)之后，在2ml离心管中离心(1min，5000xg)并将上清液排出，再次离心1min并取出样品。将产生的沉淀分散在160μL的P1中，添加并混合20μL的溶菌酶(100mg/ml)和4μL的溶葡萄球菌酶，并且在热混合仪中在37℃，900rpm孵育悬浮液30分钟。然后加入300μL裂解缓冲液和蛋白酶K(30μL)(均来自Promega的Maxwell的血液试剂盒)并且将整体再次在56℃和900rpm下孵育30分钟。然后将样本作为整体(～510μL)转移到Maxwell暗盒中，利用组织LEV总RNA试剂盒AS1220或XAS1220定制试剂盒(Promega)作进一步处理。

下一代测序

在文库制备之前，利用Qubit 2.0荧光计(Qubit dsDNA BR Assay Kit，Life Technologies)和Agilent 2200磁带机(Genomic DNA ScreenTape，Agilent Technologies)对分离的细菌DNA进行质量控制。根据制造商的说明书，利用NexteraXT DNA样品制备试剂盒以及96索引(Indexes)的NexteraXT Index试剂盒(Illumina)来制备96孔形式的NGS文库。利用KAPA SYBR FAST qPCR MasterMix试剂盒(Peqlab)在ViiA 7实时PCR系统(Life Technologies)上，在基于qPCR的方法中将所得到的测序文库定量。利用TruSeq PE Cluster v3和TruSeq SBS v3测序化学(Illumina)，在Illumina Hiseq2000或Hiseq2500测序仪上，每道混合96个样品用于配对末端测序(2x100bp)。利用FastQC质量控制工具对高通量测序数据确定基础的测序质量参数(Babraham Bioinformatics Institute)。

数据分析

Trimmomatic(版本0.32，BolgerAM，Lohse M，Usadel B.Trimmomatic：a flexible trimmer for Illumina sequence data.Bioinformatics.2014；30(15)：2114-2120.doi：10.1093/bioinformatics/btu170)被用于接头和原始读取的质量修整，原始读取具有以下参数ILLUMINACLIP：NexteraPE-PE.fa：1：50：30前导：3追踪：3滑动窗口：4：15最小长度：36。利用SPAdes(版本3.0.0，Bankevich A，Nurk S，Antipov D等人SPAdes：A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing.Journal of Computational Biology.2012；19(5)：455-477.doi：10.1089/cmb.2012.0021)构建重新组装，具有参数-t 20-m 256-k 21，33，55，77-careful-1 fp.fastq.gz-2 rp.fastq.gz。为了确定组装的质量，发明人运行QUAST(版本2.3)，最小长度阈值为500bp。突出显示不符合RefSeq组装质量标准(N50＞5000，L50＜20，#重叠群＜1000)的获得的度量值。

SNP调用：

利用应用k-met分析的工具kSNP3进行无参考SNP调用，即该工具考虑在给定数据中找到的所有可能的k-mer。k-mer的中心碱基是SNP(例如k＝21“AAAGTTTCGCAGTTGGTAATA”，SNP＝A)，其左侧位点碱基和右侧位点碱基是SNP的背景(context)。

·工具URL：http：//sourceforge.net/projects/ksnp/files/

使用以下输入：

·包括染色体和可用质粒的来自NCBI的49种完成的金黄色葡萄球菌基因组

·995种金黄色葡萄球菌重新组装(见上文)

·总计：995+49＝1044个样品

利用完成的基因组来选择参数k，如通过工具确定选择的值是21。

SNP调用结果：

利用给出的完成基因组来注释包含487,415个SNP的输出，总共产生9,419,797个注释。SNP可以具有以下值：碱基A/T/C/G或“-”(缺失)，后者意味着所考虑的基因组部分缺失(例如基因缺失)。作为结果，获得了表2中使用的注释以及其他注释(详见表2和注释)。

提取SNP注释：

为了减少类似注释的数量，如下所示过滤和聚集类似的注释：

·只保留所考虑的位于蛋白上的SNP注释。

·只保留“产品”条目和“注释”条目不包含“假定蛋白质”的注释。

·注释按SNP ID(“基因座号”)和基因产物(“产物”)分选。

·对于每一对唯一的SNP ID和基因产物，只保留第一行。