本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种快速鉴定有棱丝瓜‘雅绿6号’杂交种子纯度的核苷酸引物组合及检测方法。
背景技术：
杂交种子纯度是衡量种子质量的重要标准。杂交种子不纯不仅影响作物产量，使得农民收入减少，处理不当还可能引发群体事情，影响社会稳定。近年来，在多种作物中因杂交种子不纯引发的事件时有发生。因此，迫切需要在各种作物中开发杂交种子快速鉴定的相关方法。
对于瓜类蔬菜作物而言，由于一般农民种植面积少，单位面积用种量少，杂交种子出现混杂更容易被农民发现，对作物的产量和农民的情绪影响更大。相对于大田作物而言，瓜类蔬菜作物对种子混杂率耐受度较低，因此对纯度要求更高。丝瓜是异花授粉作物，目前丝瓜杂交种商业制种方法均采用人工去雄、辅助授粉的方法。具体操作方法为：选好隔离地，分别将父本和母本种在不同田块，开花期时，每天在丝瓜雌花开放前，人工将母本植株上所有的雄花花蕾摘除，待雌花开放时，人工辅助将父本的花粉授到母本植株的雌花柱头上，这样母本植株上结的种子即为杂交种。在实际操作中，如果母本植株雄花摘除不彻底，昆虫可能将母本的花粉带到母本的雌花柱头上，产生自交种子，从而产生混杂。在生产实践中，人工去雄不彻底产生自交种的事件很难避免，因此在种子销售前，必须进行纯度鉴定。
目前，商业上丝瓜种子纯度鉴定均采用形态鉴定法，即随机抽取一定数量的杂交种和父本、母本一同种在田里，通过全生育期形态观察、对比，识别假杂种，估算杂交种子纯度。这种方法周期长（广东地区一般需要50-80天）、需要占用一定面积的土地和相应的人工，同时受到种植数量（样本数量）的限制，影响对种子纯度的统计准确率。在水稻、小麦、黄瓜、南瓜等许多作物中，都开发了利用DNA分子标记的方法鉴定杂交种子纯度的方法，并且已经开始应用的生产。与传统的形态学鉴定方法相比，此方法可以直接对种子或者杂交种苗期进行鉴定，快速（依据鉴定量的不同，从DNA提取、PCR扩增到跑胶结束，一般2-3天可以结束）、操作简便，准确度高，是一种省时、省地、省力的好方法。目前，在丝瓜中尚无利用分子标记鉴定杂交种子纯度的方法。
技术实现要素：
针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种快速鉴定有棱丝瓜‘雅绿6号’杂交种子纯度的核苷酸引物组合及检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于快速鉴定有棱丝瓜‘雅绿6号’杂交种子纯度的核苷酸引物组，其为引物组1或引物组2，其中：
引物组1在有棱丝瓜‘雅绿6号’杂交种子的PCR产物中可产生含有如SEQIDNO.5所示核苷酸序列的母本特异性标记条带，以及含有如SEQIDNO.6所示核苷酸序列的父本特异性标记条带；
引物组2在有棱丝瓜‘雅绿6号’杂交种子的PCR产物中可产生含有如SEQIDNO.7所示核苷酸序列的母本特异性标记条带，以及含有如SEQIDNO.8所示核苷酸序列的父本特异性标记条带。
作为优选的，所述引物组1的序列如下所述：
SGJ750-F：5’-GATGGCGATAGGGAATCAAA-3’（SEQIDNO:1），
SGJ750-R：5’-CCATTGCCACAGAGTCTCAC-3’（SEQIDNO:2）；
所述引物组2的序列如下所示：
SGJ760-F：5’-CGCTTCTCTCGCTAGTCTTCA-3’（SEQIDNO:3），
SGJ760-R：5’-TCATCGCTCTCCCTTTCTCT-3’（SEQIDNO:4）。
一种用于快速鉴定有棱丝瓜‘雅绿6号’杂交种子纯度的试剂盒，其包括如上所述的引物组1和/或引物组2。
一种快速鉴定有棱丝瓜‘雅绿6号’杂交种子纯度的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测丝瓜样品基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的待测样品DNA为模板，利用引物1和引物组2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述引物组1和引物组2如权利要求1或2所述；
（3）将步骤（2）的PCR扩增产物采用电泳检测，显色，统计电泳结果；
（4）对步骤（3）的电泳结果进行分析，只有两对引物组合中每对引物都同时具有两亲本特异性条带的植株才被认定为杂交种，任意一对引物缺少其中一条带或者为非亲本特异性条带的植株被认定为假杂种。
本发明的有益效果是：
本发明能够快速、简便、经济、高效、准确的对有棱丝瓜‘雅绿6号’的杂交种子进行纯度鉴定，同时采用两对引物进行鉴定，能够起到相互印证的作用，避免操作失误引起的误判，大大提高种子纯度鉴定的准确性。与传统的田间形态鉴定相比，该方法从DNA提取到跑胶鉴定结束，仅需1-3天，操作简便，节省人工，不需要占用土地，鉴定结果更加准确可靠，极大的提高了鉴定效率，大幅缩减鉴定费用。本发明在‘雅绿6号’制种、繁重和销售企业中具有极大的应用和推广价值。
附图说明
图1：引物SGJ750在丝瓜‘雅绿6号’杂交种父本、母本及F1植株中PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（1-3：‘雅绿6号’母本；4-6：‘雅绿6号’父本；7-13：‘雅绿6号’杂交F1）；
图2：引物SGJ760在丝瓜‘雅绿6号’杂交种父本、母本及F1植株中PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（1-3：‘雅绿6号’母本；4-6：‘雅绿6号’父本；7-13：‘雅绿6号’杂交F1）；
图3：引物SGJ750鉴定广东省农科院蔬菜研究所基地‘雅绿6号’种子纯度部分结果（M：分子量标准；1：‘雅绿6号’母本；2：雅绿6号’父本；3-7、9-26：抽样商品种‘雅绿6号’；8：假杂种）；
图4：引物SGJ760鉴定广东省农科院蔬菜研究所基地‘雅绿6号’种子纯度部分结果（M：分子量标准；1：‘雅绿6号’母本；2：雅绿6号’父本；3-7、9-26：抽样商品种‘雅绿6号’；8：假杂种）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1有棱丝瓜‘雅绿6号’的杂交种子纯度检测方法的建立
1、有棱丝瓜EST-SSR引物开发和可用于‘雅绿6号’的杂交种子纯度鉴定引物的筛选
本单位通过丝瓜转录组测序，成功开发了1046对丝瓜EST-SSR引物。利用这些引物，对‘雅绿6号’品种的母本、父本及F1进行多态性筛选，获得2对在两亲本间存在明显差异的共显性EST-SSR引物组合，分别为SGJ750和SGJ760，这两对引物组合在两亲本间带型差异明显、特异性高、重复性好，可用于雅绿6号’杂交一代种子纯度检测。引物序列如下：：
引物SGJ750
SGJ750-F：5’-GATGGCGATAGGGAATCAAA-3’（SEQIDNO:1）
SGJ750-R：5’-CCATTGCCACAGAGTCTCAC-3’（SEQIDNO:2）
引物SGJ760
SGJ760-F：5’-CGCTTCTCTCGCTAGTCTTCA-3’（SEQIDNO:3）
SGJ760-R：5’-TCATCGCTCTCCCTTTCTCT-3’（SEQIDNO:4）
引物SGJ750在有棱丝瓜‘雅绿6号’的PCR产物中产生的特异条带为：146bp的母本特异性标记SGJ750-146(SEQIDNO:5)，以及152bp的父本特异性标记SGJ750-152(SEQIDNO:6)。引物SGJ760在有棱丝瓜‘雅绿6号’产生的特异条带为：216bp的母本特异性标记SGJ760-216(SEQIDNO:7)，以及207bp的父本特异性标记SGJ760-207(SEQIDNO:8)。
2、供试杂交种及亲本的种植
根据实践需要，随机取适量有棱丝瓜‘雅绿6号’F1杂交种和少量父本、母本种子种植于育苗盘中。
3、丝瓜基因组的提取
采用改良的简易SDS法提取丝瓜叶片基因组DNA，步骤如下：
（1）取适量新鲜叶片，放入2ml离心管中，加入液氮,用微量研磨棒或十字型螺丝刀将叶片捣磨成粉末，加入600微升1.5％SDS微量抽提液（0.5％SDS，250mmol/LNaCL，25mmol/LEDTA，200mmol/LTris-HCL缓冲液（pH7.5））；
（2）将样品管置于65oC水浴锅中孵育30分钟，每隔5-10分钟颠倒混匀一次；
（3）取出样品，冷却至室温，加入等体积（600-700微升）的氯仿/异戊醇/乙醇（76：4：20），振荡10分钟，充分混匀；
（4）将样品管12000rpm离心12分钟，小心将上清液转移到另一1.5ml离心管中；
（5）加入等体积异丙醇或两倍体积无水乙醇沉淀，静置3-5分钟，12000rpm离心5分钟；
（6）去上清，用0.5ml70％的乙醇漂洗沉淀，风干，溶于50-100ulTE中。
4、PCR扩增
PCR的反应体系（20μL）：2μL10×buffer；0.5μLTaq酶（2U·μL-1）；0.4μLdNTP（10mmol·L-1）；上、下游引物各0.1μL（50pmoL·μL-1）；1μL模板DNA（50ng·μL-1）；15.9μLddH2O。
PCR程序为Touch-downPCR：94℃预变性3min；94℃30S，65℃（-1℃/cycle）1min，72℃1min，15个循环；94℃30S，50℃1min，72℃1min，25个循环；72℃终延伸10min。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
（1）试剂的配置
1×6%丙烯酰胺贮存液(100mL)：5.7g丙烯酰胺；0.3gBis；12g尿素；10mL10×TBE；加ddH2O定容至100mL；灌胶前，每10mL胶液，加入10%过硫酸铵70μL，TEMED3μL
染色液(1×)：0.1%AgNO3
显影液(1×)：0.5gNaOH；0.019g四硼酸钠；0.4mL甲醛（用前加）；ddH2O定容至100Ml
（2）聚丙烯酰胺凝胶的制备
首先将玻璃板底端开口用琼脂糖凝胶封口，待其凝固,将配制好的1×6%丙烯酰胺溶液搅匀，将玻璃板与桌面成30°左右的角，缓缓注胶，避免气泡的产生。注满后放平玻璃板使其与桌面成10°左右的角，插入合适的梳子。待其凝固0.5h以后，小心拔出梳子。用蒸馏水反复冲洗点样孔，清除多余没有凝固的物质。
（3）电泳
将玻璃板固定在垂直电泳槽上，加入适量的1×TBE缓冲液。PCR结束后，取出样品，每管加入3μL含溴酚兰和二甲苯青两种指示剂的载样缓冲液。用微量进样器取出3μL样品上样。
（4）银染法染色
电泳完毕后，将玻璃板从电泳槽上拆下，取出凝胶，在蒸馏水中漂洗两次，每次约1min。然后转入染色液中，在摇床上轻摇，染色10min。染色结束后，将凝胶转移到蒸馏水中漂洗两次，每次约1min。然后转入显影液中显色，着色之后转入清水中保存，凝胶成像，记录结果。
6、试验结果分析
标记SGJ750在有棱丝瓜‘雅绿6号’母本植株和父本植株中分别扩增出唯一主带，杂交F1植株中兼有母本和父本的特异条带（如图1所示）。将特异性条带回收测序，结果表明：‘雅绿6号’母本产生的为146bp特异条带，命名为SGJ750-146，序列如SEQIDNO:5所示；‘雅绿6号’父本产生的为152bp特异条带，命名为SGJ750-152，序列如SEQIDNO:6所示：
SEQIDNO:5
GATGGCGATAGGGAATCAAACACCCAGAAATGCAGAGAGGAAAGGAAACTGAAAGGGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTCTCTTAGCTGTATTGTCTTCTTGTTATGAACTCTGTTATTCATCTCTGTGAGACTCTGTGGCAATGG
SEQIDNO:6
GATGGCGATAGGGAATCAAACACCCAGAAATGGAAATGCAGAGAGGAAAGGAAACTGAAAGGGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTCTCTTAGCTGTATTGTCTTCTTGTTATGAACTCTGTTATTCATCTCTGTGAGACTCTGTGGCAATGG
标记SGJ760在有棱丝瓜‘雅绿6号’母本植株和父本植株中分别扩增出唯一主带，杂交F1植株中兼有母本和父本的特异条带（如图2所示）。将特异性条带回收测序，结果表明：‘雅绿6号’母本产生的为216bp特异条带，命名为SGJ760-216，序列如SEQIDNO:7所示；‘雅绿6号’父本产生的为207bp特异条带，命名为SGJ760-207，序列如SEQIDNO:8所示：
SEQIDNO:7
CGCTTCTCTCGCTAGTCTTCAAGCATCTGGTTCTTCTTTTCTCTGAGTTATCGAGATTAACATCAATCTAAATCAATACAAGAAAATACTACGTCTTTTTTTTTTGGTTAAAACAAAATATTTTTATGTTGAAAAAAGAAAAGAACAGAGATAGCGACGCTGAAAGAAAGAAAGAAAATTCGATTGCTAAAGAGAAAGAGAAAGGGAGAGCGATGA
SEQIDNO:8
CGCTTCTCTCGCTAGTCTTCAAGCATCTGGTTCTTCTTTTCTCTGAGTTATCGAGATTAACATCAATCTCAAGAAAATACTACGTCTTTTTTTTTTGGTTAAAACAAAATATTTTTATGTTGAAAAAAGAAAAGAACAGAGATAGCGACGCTGAAAGAAAGAAAGAAAATTCGATTGCTAAAGAGAAAGAGAAAGGGAGAGCGATGA
需对供试材料在引物组合SGJ750和SGJ760的电泳结果进行综合分析，只有两对引物组合中每对引物都同时具有两亲本特异性条带的植株才被认定为杂交种，任意一对引物缺少其中一条带或者为非亲本特异性条带的植株被认定为假杂种。
杂交种子纯度=（检测所得真种子数/检测种子总数）×100%
实施例2广东省农科院蔬菜所实验基地50株‘雅绿6号’F1植株纯度鉴定
从广东省农科院蔬菜所实验基地中取50株有棱丝瓜‘雅绿6号’F1样品，对其单株编号，提取基因组DNA，采用实施例1的方法对杂交种子纯度进行鉴定（见图3、4），结果表明，50株样品中，杂交株为49株，母本1株，种子纯度为98%。
同时采用传统的田间观察法对供试的杂交植株进行鉴定，即对基地中50株有棱丝瓜‘雅绿6号’F1植株进行多性状全生育期观察，并用与母本植株和父本植株进行对比，田间观察鉴定杂交种子的纯度。结果表明分子标记杂交种子纯度鉴定方法与田间调查结果一致。
以上实施例表明，本发明的方法能够快速、简便、经济、高效、准确的对有棱丝瓜‘雅绿6号’的杂交种子进行纯度鉴定，从图3和图4的检测结果来看，同时采用两对引物进行鉴定，能够起到相互印证的作用，避免操作失误引起的误判，大大提高种子纯度鉴定的准确性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
<110>广东省农业科学院蔬菜研究所
<120>快速鉴定有棱丝瓜'雅绿6号'杂交种子纯度的核苷酸引物组合及检测方法
<130>
<160>8
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gatggcgatagggaatcaaa20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
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<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tcatcgctctccctttctct20
<210>5
<211>146
<212>DNA
<213>有棱丝瓜'雅绿6号'
<400>5
gatggcgatagggaatcaaacacccagaaatgcagagaggaaaggaaactgaaagggagc60
ttcttcttcttcttctcttctcttagctgtattgtcttcttgttatgaactctgttattc120
atctctgtgagactctgtggcaatgg146
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<212>DNA
<213>有棱丝瓜'雅绿6号'
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<210>7
<211>216
<212>DNA
<213>有棱丝瓜'雅绿6号'
<400>7
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<210>8
<211>207
<212>DNA
<213>有棱丝瓜'雅绿6号'
<400>8
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