一种连接肽及其应用的制作方法

文档序号：14721369发布日期：2018-06-17 15:39阅读：192来源：国知局

本发明属于基因工程和发酵工程领域，具体涉及一种连接肽及其应用。

背景技术：

肝素酶（heparinase）是一类可作用于肝素（heparin）或者硫酸乙酰肝素（heparinsulfate）分子的糖苷键的多糖裂解酶。目前已知的肝素酶种类有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种，是从革兰氏阴性棒杆菌肝素黄杆菌中发现的。三种酶底物特异性和作用方式各不相同，肝素酶I底物为肝素，肝素酶II的底物为肝素和硫酸乙酰肝素，肝素酶III的底物为硫酸乙酰肝素。肝素酶在科研与应用领域有重要的应用价值。

硫酸软骨素酶（chondroitinase或chondroitinsulfaeyase，简称ChSase）是一种能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖。ChSase包括硫酸软骨素酶B、硫酸软骨素酶AC。近年来，ChSase作为一种研究机体蛋白聚糖的结构与功能的工具以及作为一种新型药用酶而日益受到人们的重视。

鉴于肝素酶、硫酸软骨素酶的重要应用价值，研究人员很早就对其在微生物系统中的重组表达进行研究，但效果很差，主要的技术瓶颈在于难以实现肝素酶、硫酸软骨素酶的可溶表达，同时其催化活性与热稳定性比较低，距离工业应用要求还有很大距离。

融合蛋白策略可提高肝素酶、硫酸软骨素酶的可溶表达效果。结构生物学中，通过构建融合蛋白来增加可溶蛋白的表达和方便蛋白的纯化（HongyuanM.Aself-cleavablesortasefusionforone-steppurificationoffreerecombinantproteins.ProteinExpressionandPurification,2004,37(1):253-263；和Sun-okK,YoungIL.High-levelexpressionandsimplepurificationofrecombinanthumaninsulin-likegrowthfactorI.JournalofBiotechnology,1996,48:97-105.）已经成为一种行之有效的方法。连接肽作为融合蛋白策略中的关键元件，其可变性远大于酶本身，并能对融合酶性能产生重大影响（CahalonL,LiderO,SchorH,et.al.Heparindisaccharidesinhibittumornecrosisfactor-αproductionbymacrophagesandarrestimmueinflammationinrodents.Int.Immunol.,1997,9:1517-1522；和KakkarA.Low-andultra-low-molecular-weightheparins.BestPractice&ResearchClinicalHaematology,2004,17(1):77-87.）。具有合适长度和刚柔度的连接肽可以把两个酶（结构域）适当地隔开，从而避免了不同结构与在折叠、催化过程中的相互干扰。虽然连接肽对于融合蛋白的功能有重要影响，但令人遗憾的是，至今接连肽在肝素酶、硫酸软骨素酶等多糖裂解酶的研究较少，现有相关酶距离工业应用要求还有较大的距离。

技术实现要素：

本发明提供一种连接肽，其序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。

所述的连接肽在制备MBP（麦芽糖结合蛋白）融合多糖裂解酶中的应用。

连接肽在制备MBP融合多糖裂解酶中的过程如下：

（1）基于刚、柔性氨基酸序列单元的排列组合，设计连接肽L1、L2，其核苷酸序列分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2；

（2）将序列SEQIDNO.1或SEQIDNO.2插入MBP融合多糖裂解酶中MBP序列与多糖裂解酶基因序列之间，获得含有所述连接肽序列的MBP融合多糖裂解酶表达载体，再进行MBP融合多糖裂解酶的表达，得到含所述连接肽的MBP融合多糖裂解酶。

所述的多糖裂解酶基因源于肝素黄杆菌。

所述的多糖裂解酶基因中的多糖裂解酶为肝素黄杆菌中的肝素酶或硫酸软骨素酶，其中肝素酶包括肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ，硫酸软骨素酶包括硫酸软骨素酶B、硫酸软骨素酶AC。

一种含有连接肽SEQIDNO.1的MBP融合肝素酶，包括MBP融合肝素酶Ⅰ、MBP融合肝素酶Ⅱ、MBP融合肝素酶Ⅲ，其核苷酸序列分别为序列表中SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5。

一种含有连接肽SEQIDNO.1的MBP融合硫酸软骨素酶，包括MBP融合硫酸软骨素酶B、MBP融合硫酸软骨素酶AC，其核苷酸序列分别为序列表中SEQIDNO.6、SEQIDNO.7。

一种含有连接肽SEQIDNO.2的MBP融合肝素酶，包括MBP融合肝素酶Ⅰ、MBP融合肝素酶Ⅱ、MBP融合肝素酶Ⅲ，其核苷酸序列分别为序列表中SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10。

一种含有连接肽SEQIDNO.2的MBP融合硫酸软骨素酶，包括MBP融合硫酸软骨素酶B、MBP融合硫酸软骨素酶AC，其核苷酸序列分别为序列表中SEQIDNO.11、SEQIDNO.12。

本发明设计一种连接肽，用于重组蛋白的分子改造。对于肝素黄杆菌中的多糖裂解酶，采用MBP融合表达的方法，对该连接肽重新设计及替换提高了MBP融合酶的催化活性及热稳定性。MBP融合表达系统中，通过该连接肽的重新设计以及替换来提高MBP助溶、助折叠、增加目标蛋白活性以及热稳定性。

本发明通过基因工程的手段对MBP融合多糖裂解酶的连接肽进行重新设计与替换，最终获得在大肠杆菌中的发酵酶活初步达到工业应用水平、且具有优秀热稳定性的MBP融合肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，硫酸软骨素酶B、AC。

附图说明

图1MBP融合肝素酶I连接肽替换前后表达效果表征，

其中T：TotalProtein，表示总蛋白样品，S：SolubleProtein，表示可溶性蛋白，I：InsolubleProtein，表示不可溶蛋白。

图2MBP融合肝素酶Ⅱ连接肽替换前后表达效果表征，

其中T：TotalProtein，表示总蛋白样品，S：SolubleProtein，表示可溶性蛋白，I：InsolubleProtein，表示不可溶蛋白。

图3MBP融合肝素酶Ⅲ连接肽替换前后表达效果表征，

其中T：TotalProtein，表示总蛋白样品，S：SolubleProtein，表示可溶性蛋白，I：InsolubleProtein，表示不可溶蛋白。

图4MBP融合硫酸软骨素酶B连接肽替换前后表达效果表征，

其中T：TotalProtein，表示总蛋白样品，S：SolubleProtein，表示可溶性蛋白，I：InsolubleProtein，表示不可溶蛋白，P为经MBPTrapHP一部纯化后的纯化蛋白。

图5MBP融合硫酸软骨素酶AC连接肽替换前后表达效果表征，

其中T：TotalProtein，表示总蛋白样品，S：SolubleProtein，表示可溶性蛋白，I：InsolubleProtein，表示不可溶蛋白，P为经MBPTrapHP一部纯化后的纯化蛋白。

图6MBP融合肝素酶I连接肽替换前后热稳定性比较。

图7MBP融合肝素酶Ⅱ连接肽替换前后热稳定性比较。

图8MBP融合肝素酶III连接肽替换前后热稳定性比较。

图9MBP融合硫酸软骨素酶B连接肽替换前后热稳定性比较。

图10MBP融合硫酸软骨素酶AC连接肽替换前后热稳定性比较。

图11MBP融合肝素酶I连接肽替换前后底物降解机制解析：产物总体分析，

其中，11A示差检测器；11B紫外检测器。

图12MBP融合肝素酶I连接肽替换前后底物降解机制解析：二糖组分分析，

其中，12A：MBP-HepA；12B：MBP-R-HepA；12C：MBP-F-HepA。

图13MBP融合肝素酶Ⅱ连接肽替换前后底物降解机制解析：产物总体分析，

其中，13A示差检测器；13B紫外检测器。

图14MBP融合肝素酶Ⅱ连接肽替换前后底物降解机制解析：二糖组分分析，

其中，14A：MBP-HepA；14B：MBP-R-HepA；14C：MBP-F-HepA。

图15MBP融合肝素酶Ⅲ连接肽替换前后底物降解机制解析：产物总体分析，

其中，15A示差检测器；15B紫外检测器。

图16MBP融合肝素酶Ⅱ连接肽替换前后底物降解机制解析：二糖组分分析，

其中，16A：MBP-HepA；16B：MBP-R-HepA；16C：MBP-F-HepA。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作具体说明。

实施例1连接肽的设计、含目标连接肽MBP融合多糖裂解酶载体构建与表达

1、连接肽的设计

（1）连接肽的由来：

由于连接肽的长度与性质（刚柔度）可以显著影响融合蛋白的性质，这主要是由于改变了融合蛋白中两个元件之间的空间距离与位置关系，造成相互之间的作用力与空间位阻不同，进而对蛋白的结构造成不同程度的影响，最终影响两个元件的生物学功能特别是作为主要的催化酶的生物学功能。长度对于融合蛋白的性质的影响最为显著，然而也因为这个原因，很难预测长度的变化在什么程度上影响融合蛋白，所以对于我们应用上想要理性设计融合蛋白非常不利。如果在合适长度的基础上，通过连接肽的刚柔度来对融合蛋白两个元件之间的空间距离以及位置关系进行“微调”，则可以实现对融合蛋白理化性质的逐步调节，这样我们在对目标蛋白有充分了解的基础上，可以根据不同连接肽的性质设计所需要的融合蛋白，从而得到不同理化属性的融合蛋白。

基于上述的总体设想，我们就把自然界中的柔性肽单元F（包含5个氨基酸）以及刚性肽单元R（包含5个氨基酸）作为我们设计的基本元件，选取FFFFF和RRRRR为研究连接肽的长度单位，在5个连接肽单元长度的基础上，对立面的刚柔性单元进行替换和杂合连接，从而获得一系列刚柔度具有渐变规律的杂合连接肽文库，通过将这些连接肽替换至不同的融合蛋白中，我们就可以很轻松得获得所需的融合蛋白。

（2）设计软件：连接肽的“设计”其实还是基于刚、柔性单元的排列组合，用DiscoverStudio软件对不同的排列组合的连接肽构象进行分子模拟，通过后续的实验结果与该模拟结果进行比对、校正，获得真正能够在空间距离与位置关系上进行调节的连接肽候选文库与连接肽选取依据。最终获得连接肽L1、L2，其核苷酸序列分别为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。

2、含目标连接肽MBP融合多糖裂解酶载体构建

含目标连接肽MBP融合多糖裂解酶载体构建步骤：分别将肝素酶Ⅰ融合蛋白表达载体pMal-hepA（专利号CN1699424A）、肝素酶Ⅱ融合蛋白表达载体pMal-hepB（专利号CN101942024A）、肝素酶Ⅲ融合蛋白表达载体pMal-hepC（专利号CN101942025A）、硫酸软骨素酶B融合蛋白表达载体pMAL-ChSaseB（专利号CN103103173A）、硫酸软骨素酶AC融合蛋白表达载体pMAL-ChSaseAC（专利号CN103103174A）分别用“NdeI+HindIII”、“NdeI+PstI”、“NdeI+PstI”、“NdeI+HindIII”、“NdeI+EcoRI”，进行酶切，然后分别与带有相同首位末端酶切位点的连接肽L1、L2，用T4连接酶进行连接，得到含目标连接肽的融合多糖裂解酶载体。

实施例2目标蛋白的表达、纯化及酶活分析

将含目标连接肽融合多糖裂解酶载体表达：将构建好含目标连接肽融合多糖裂解酶载体质粒分别转化大肠杆菌，转化有重组质粒的菌株在含有100ug/mL氨苄青霉素的LB培养基中震摇培养过夜（37℃，180rpm，14-16h）后，按照1:100的比例接种到LB/M9YE发酵培养基中，37℃，180rpm摇至对数生长期，加入IPTG后转至200rpm，15℃低温诱导培养20-22h。

蛋白提取与纯化过程：将100ml目的大肠杆菌发酵菌液集菌后用20ml蛋白提取缓冲液重悬，超声破碎菌体，破碎产物4℃，10000rpm离心30分钟，收集上清，经0.22μm膜过滤，缓慢（1mL/min）通过GEHealthcare的MBPTrapHP（1ml，5ml）亲和柱，分管收集洗脱液，检测各管蛋白浓度，SDS-PAGE电泳检测纯化效果。蛋白纯化在AKTAplus蛋白纯化系统上进行，全程在4℃低温层析柜中操作得到纯化的多糖裂解MBP融合蛋白。

酶活力检测采用232nm的光吸收法，1IU的酶活的定义为30℃每分钟产生的1um不饱和键的反应效力。具体操作用上海棱光技术有限公司的GOLDS54紫外可见分光光度计，测定吸光度随时间的变化曲线。扫描波长定为232nm，时间为3min。取反应缓冲液（20mMTris，200mMNaCl，充分溶解后用1M的盐酸调节pH值至7.4，4℃保存）与一定量的酶溶液共1000μL（具体比例需根据酶液活力的大小调节），500μL底物溶液（17mMTris，44mMNaCl，3.5mMCaCl2，25g/L底物，充分搅拌后用1M的盐酸调节pH值至7.0，4℃保存。）其中，MBP融合肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ底物：25g/L肝素钠——用于MBP融合肝素酶Ⅰ或Ⅱ的酶活测定，25g/L硫酸乙酰肝素钠——用于肝素酶III的酶活测定；硫酸软骨素酶B、AC底物：25g/L硫酸软骨素。然后于石英比色皿，混匀后立即放入分光光度计开始扫描，测单位时间内在232nm的吸光度变化△A232。消光系数ε=3800M-1?cm-1。根据比尔定律计算酶活。

1、MBP融合肝素酶Ⅰ

肝素酶I融合蛋白（专利号CN1699424A）作为对照命名为MBP-HepA，替换连接肽1的MBP融合肝素酶I命名为MBP-R-HepA；替换连接肽2的MBP融合肝素酶I命名为MBP-F-HepA。

MBP融合肝素酶I纯化后，进行SDS-PAGE电泳，结果见图1。

采用Bandscan5.0软件分析，替换前后目标蛋白可溶表达的趋势有无差异，目标蛋白占总蛋白的比重有所增加，比重均从48%左右提高到61%。

在分析酶活时均是以上清可溶蛋白S组分进行分析测定。

表1MBP融合肝素酶I连接肽替换前后摇瓶发酵总酶活测定

经连接肽替换后，MBP融合肝素酶I在摇瓶中的发酵总酶活达到41230.18IU/L，是目前已知最高值。

（2）MBP融合肝素酶Ⅱ

肝素酶Ⅱ融合蛋白（专利号CN101942024A）作为对照，命名为MBP-HepB；替换连接肽1的MBP融合肝素酶Ⅱ命名为MBP-R-HepB；替换连接肽2的MBP融合肝素酶I命名为MBP-F-HepB。

MBP融合肝素酶Ⅱ纯化后，进行SDS-PAGE电泳，结果见图2。

连接肽替换后，MBP-R-HepB目标蛋白占总蛋白的比重增加1倍，MBP-F-HepB目标蛋白占总蛋白的比重无明显差异。

表2MBP融合肝素酶Ⅱ连接肽替换前后摇瓶发酵总酶活测定

经连接肽替换后，MBP融合肝素酶II在摇瓶中的发酵总酶活达到3674.82IU/L，是目前已知最高值。

（3）MBP融合肝素酶Ⅲ

肝素酶Ⅲ融合蛋白（专利号CN101942025A）作为对照，命名为MBP-HepC；替换连接肽1的MBP融合肝素酶Ⅱ命名为MBP-R-HepC；替换连接肽2的MBP融合肝素酶I命名为MBP-F-HepC。

MBP融合肝素酶Ⅲ纯化后，进行SDS-PAGE电泳，结果见图3。

连接肽替换后，MBP-R-HepC目标蛋白占总蛋白的比重增加1.5倍，MBP-F-HepB目标蛋白占总蛋白的比重增加1倍。

表3肝素酶Ⅲ连接肽替换前后摇瓶发酵总酶活测定

经连接肽替换后，MBP融合肝素酶III在摇瓶中的发酵总酶活达到12934.34IU/L，是目前已知最高值。

（4）MBP融合硫酸软骨素酶B

MBP融合硫酸软骨素酶B纯化后，进行SDS-PAGE电泳，MBP融合硫酸软骨素酶B连接肽替换前后表达效果见图4。

连接肽替换后，MBP-R-HepB目标蛋白占总蛋白的比重增加1倍，MBP-F-HepB目标蛋白占总蛋白的比重无明显差异。

表4MBP融合硫酸软骨素酶B连接肽替换前后摇瓶发酵总酶活测定

经连接肽替换后，MBP融合硫酸软骨素酶B在摇瓶中的发酵总酶活达到24206.2IU/L，是目前已知最高值。

（5）MBP融合硫酸软骨素酶AC

MBP融合硫酸软骨素酶AC纯化后，进行SDS-PAGE电泳，MBP融合硫酸软骨素酶B连接肽替换前后表达效果见图5。

连接肽替换后，MBP-R-HepB目标蛋白占总蛋白的比重增加2.5倍，MBP-F-HepB目标蛋白占总蛋白的比重增加1.5倍。

表5MBP融合硫酸软骨素酶AC连接肽替换前后摇瓶发酵总酶活测定

经连接肽替换后，MBP融合硫酸软骨素酶AC酶在摇瓶中的发酵总酶活达到22162IU/L，是目前已知最高值。

实施例4连接肽替换前后MBP融合多糖裂解酶热稳定性分析

将蛋白纯化后立即测定酶活性作为时间点为0时刻的酶活，将纯酶至于检测温度中水浴，选取不同的时间点进行取样测酶活，与0时刻酶活进行比对，计算该时刻相对于0时刻酶活的百分比。持续该操作至酶活降至较低未知，这样就获得了一系列温浴时间点与剩余酶活的对应关系点，将这些点进行连接即得该酶在该温度下的失活曲线，也就可以对该酶在该温度下的稳定性进行评价。

1.MBP融合肝素酶I连接肽替换前后摇瓶发酵后酶热稳定性分析

经连接肽替换后，MBP融合肝素酶I在30℃下的酶活半衰期从10min提高到35min左右，结果见图6。

2、MBP融合肝素酶Ⅱ连接肽替换前后摇瓶发酵后酶热稳定性分析

经连接肽替换后，MBP融合肝素酶Ⅱ在30℃下的酶活半衰期从80h提高到250h左右，结果见图7。

3、MBP融合肝素酶Ⅲ连接肽替换前后摇瓶发酵后酶热稳定性分析

经连接肽替换后，MBP融合肝素酶Ⅲ在30℃下的酶活半衰期从60h提高到250h以上，结果见图8。

4、MBP融合硫酸软骨素酶B连接肽替换前后摇瓶发酵后酶热稳定性分析

经连接肽替换后，MBP融合硫酸软骨素酶B热稳定性实验测定结果见表6；MBP融合硫酸软骨素酶B在30℃下的酶活半衰期从24h提高到500h以上左右，结果见图9。

表6MBP融合硫酸软骨素酶B稳定性对比表

5、MBP融合硫酸软骨素酶AC连接肽替换前后摇瓶发酵后酶热稳定性分析

经连接肽替换后，MBP融合硫酸软骨素酶AC热稳定性实验测定结果见表7；MBP融合硫酸软骨素酶AC在30度下的酶活半衰期从8.3h提高到100h左右，结果见图10。

表7MBP融合硫酸软骨素酶AC稳定性对比表

实施例5连接肽替换前后MBP融合多糖裂解酶对底物降解机制的影响

选取一个MBP融合多糖裂解酶为研究对象，通过大肠杆菌表达与蛋白提取、纯化的操作步骤，获得该酶的纯品。选取对应的底物，将纯酶加入底物中，在合适的条件下进行底物降解反应，以232nm下的光吸收值为检测指标，以该吸收值不再变化时为反应终点。将反应产物经过离心、取上清、过滤等一系列纯化步骤去除里面的蛋白等杂质，将收集的寡糖组分进行HPLC的分析，得到该酶降解产物的图谱，根据不同的目的选取不同的对照样品，比如比较连接肽替换前后的降解产物差异就以连接肽替换之前的融合酶的降解产物作为对照。具体比较参数包括出峰时间与峰面积，只有这两个数值基本一致，才能够判断两个融合酶对底物的降解机制是否相同。HPLC的检测类型主要包括降解产物主成分的谱图分析以及降解产物中二糖组分的谱图分析，这两个检测项所用的检测波长是不一样的，因此为了严谨性，需要这两个波长都进行测定。

1、MBP融合肝素酶I连接肽替换前后对底物降解机制影响分析

对连接肽替换前后的MBP融合肝素酶I对肝素底物彻底降解后的组分做了分析，结果如图11。对降解产物二糖组分分析见图12。

2、MBP融合肝素酶Ⅱ连接肽替换前后对底物降解机制影响分析

对连接肽替换前后的MBP融合肝素酶Ⅱ对肝素底物彻底降解后的组分做了分析，结果如图13。对降解产物二糖组分分析见图14。

3、MBP融合肝素酶Ⅲ连接肽替换前后对底物降解机制影响分析

对连接肽替换前后的MBP融合肝素酶Ⅱ对肝素底物彻底降解后的组分做了分析，结果如图15。对降解产物二糖组分分析见图16。

由上可知，通过HPLC手段对总体降解产物以及产物中二糖组分的分析表明，MBP融合肝素酶Ⅰ、MBP融合肝素酶Ⅱ、MBP融合肝素酶Ⅲ中连接肽的替换不影响肝素酶对底物的降解机制。

序列表

<110>清华大学无锡应用技术研究院

<120>一种连接肽及其应用

<160>12

<210>1

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gaggctgccgcaaaggaagcggcagcgaaagaggcggccgcaaaagaggcagcggcgaaa60

gaagctgcggccaag75

<210>2

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ggtggtggcggcagcggtggcggcggtagcggcggtggtggatccggtggcggtggttct60

ggtggtggtggcagcc76

<210>3

<211>2268

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggt60

ctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcat120

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<210>4

<211>3420

<212>DNA

<213>人工序列

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