本发明属于生物技术领域，特别涉及一种非人灵长类动物囊胚基因敲除的鉴定方法。
背景技术：
至今未发现与本发明相同或类似的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点与不足，提供一种非人灵长类动物囊胚基因敲除的鉴定方法。所述的方法对基因敲除的囊胚进行敲除鉴定，避免了非敲除胚胎的移植，提取囊胚单细胞不会对囊胚造成大的伤害，且能提前准确的得出敲除结果，该鉴定方法既缩短了实验时间，又节约了实验经费。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种非人灵长类动物囊胚基因敲除的鉴定方法，具体的步骤如下：
(1)提取囊胚单个细胞：利用piezo显微操作针冲击透明带，取单细胞；这种单细胞提取方式极大地减少了细胞的损伤，提高动物克隆操作的成功率；
(2)基因组DNA提取：用SIGMA的GenemePlexSingleCellWholeGenomeAmplificationKit试剂盒提取基因组DNA；
(3)NestedPCR扩增目的基因片段：设计两对引物扩增目的基因，利用TaKaRaEx进行PCR反应；
(4)参照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit说明书回收得到目的DNA片段；
(5)连接载体：利用TAKARA的DNALigationKitVer.2.1将目的基因连接到骨架载体上，转化DH5α后涂布到铺有LB固体培养基的培养皿中37℃培养12h，次日挑单克隆菌落加到LB液体培养基中摇菌过夜；
(6)测序：收集菌液利用TINGENTIANprepMiniPlasmidKit试剂盒提取质粒，测序验证敲除效果。
步骤(2)中基因组DNA提取的具体步骤为：在盛有步骤(1)获取的单细胞的PCR管中加入ProteinaseKSolution0.1ul，加10×SingleCellLysis&FragmentationBuffer1.6ul，用无菌双蒸水补足10ul；瞬时离心后，将PCR管放入PCR仪进行反应：50℃60min；99℃4min，获得基因组DNA。
步骤(3)中所述的目的基因为食蟹猴SHANK3基因时，两对引物中的外引物F为GACCCCTGTTTGTGGATGTACAGG，外引物R为CCGTGGCCCGGGGTCTGCTGGGGTGCCGC，产物大小为385bp；
两对引物中的内引物F为GGTCCCTGGCTTCCCCGGCCTTCTCC，内引物R为GCTGGGCAGGGGGCTCTGCCACAGCTGC，产物大小为298bp。
步骤(4)中参照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit说明书回收得到目的DNA片段的具体步骤如下：加两倍PCR产物体积的BufferPB，混匀后过柱离心，弃废液，向柱子中加200ul的BufferPE，离心弃废液，空柱离心2min；加入10ulBufferEB离心洗脱，获得目的DNA片段。
验证灵长类动物囊胚团敲除效果时，不仅可通过提取单细胞验证，也可以通过提取多个细胞进行验证；基因组DNA的提取、目的基因的扩增和纯化回收可采用其它的试剂盒，如ZYMORESEARCH的DNAClean&ConcentratorTM-5试剂盒进行纯化回收。回收得到的目的基因可直接送生工进行连接转化，挑单克隆和测序。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明所述的方法可用于鉴定非人灵长类动物囊胚基因敲除的效果，鉴定后移植给代孕动物，提高了基因敲除动物的生产效率；
2.本发明减少了实验中非人灵长类受精卵的使用数量，有效减少了实验经费的开支；
3.本发明利用piezo显微操作针细微冲击透明带获取单细胞，这种单细胞提取方式极大地减少了细胞的损伤，提高动物克隆操作的成功率。
4.本发明为其他濒危珍稀灵长类动物转基因技术的研究提供经验借鉴。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1)选取一个食蟹猴囊胚团，提取单细胞：利用piezo显微操作针冲击透明带，获取单细胞，这种单细胞提取方式极大地减少了细胞的损伤，提高动物克隆操作的成功率；
2)细胞基因组DNA提取：用SIGMA的GenemePlexSingleCellWholeGenomeAmplificationKit试剂盒提取基因组DNA，在盛有单细胞的PCR管中加入ProteinaseKSolution0.1ul，加10×SingleCellLysis&FragmentationBuffer1.6ul，用无菌双蒸水补足10ul；瞬时离心后，将PCR管置于PCR仪进行如下反应：50℃60min；99℃4min。检测DNA含量和纯度合格后，进行下一步操作；
3)NestedPCR扩增目的基因：设计两对引物扩增目的片段，利用TaKaRaEx进行PCR反应；对食蟹猴SHANK3基因来讲，外引物F为GACCCCTGTTTGTGGATGTACAGG，外引物R为CCGTGGCCCGGGGTCTGCTGGGGTGCCGC，产物大小为385bp。内引物F为GGTCCCTGGCTTCCCCGGCCTTCTCC，内引物R为GCTGGGCAGGGGGCTCTGCCACAGCTGC，产物大小为298bp。
4)参照QIAGEN的QIAquickPCRPurificationKit说明书回收得到目的的DNA片段；加两倍PCR产物体积的BufferPB，混匀后过柱离心弃废液，向柱子中加200ul的BufferPE，离心弃废液，空柱离心2min；加入10ulBufferEB离心洗脱；检测DNA含量和纯度合格后，进行下一步操作；
5)连接载体：利用TAKARA的DNALigationKitVer.2.1将SHANK3基因连接到PMD18-T载体上，转化DH5α后涂布到铺有LB固体培养基的培养皿中37℃培养12h，次日挑单克隆菌落加到LB液体培养基中摇菌过夜。
6.测序：收集菌液，利用TINGENTIANprepMiniPlasmidKit试剂盒提取质粒，送生工进行测序，验证敲除效果。测序结果显示，其中的一个测序序列如下：
GCTGGGCAGGGGGCTCTGCCACAGCTGCTGACTGCATGGGGGCCGGGGCCAACTCCGGGGTGCCCGGGCGCTCCTCTTCGGCCCCCGCCAGCCTGCTGGGCTCCTGCCCGTTGCTGGTGGCGTGCACAGCTGGCCGCTGCAGGGATGTGTCCAGGACGCTGAGGATCATGGACTTCTTGTCCTCGGGTGACTTCCGCTCCTCCCGGGGCGCCTTCTCTGCCTCCCTGCGAGCAGGCACAGGAATCCAGGCCGGGCTCCGTGGGGAGAAGGCCGGGGAAGCCAGGGACC。结果测序结果与NCBI已报道的序列比对，减少了12bp碱基。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。