本发明涉及肝癌相关的特异性siRNA和包含所述siRNA的高效双链寡RNA分子。所述双链寡RNA分子具有如下结构：其中亲水和疏水化合物通过简单的共价键或接头介导的共价键与双链寡RNA分子的两末端缀合，从而使其有效递送入细胞且可通过双链寡RNA分子的疏水相互作用在水溶液中转化成纳米颗粒。双链寡RNA分子中包含的siRNA可优选为肝癌相关基因，特别是Gankyrin或BMI-1特异性siRNA。此外，本发明涉及制备双链寡RNA分子的方法，和用于预防和治疗癌症特别是肝癌的药物组合物，其包含双链寡RNA分子。
背景技术：
：抑制基因表达的技术是开发用于治疗疾病治疗剂和证实靶标中的重要工具。在这些技术中，自从发现了RNA干扰(下文称作‘RNAi’)的作用，发现RNAi可作用于多种哺乳动物细胞中的序列特异性mRNA(SilenceoftheTranscripts:RNAInterferenceinMedicine,J.Mol.Med.83:764-773,2005)。当长链双链RNA递送入细胞时，递送的双链RNA转换成小干扰RNA(下文称为‘siRNA’)，由称为Dicer的内切核酸酶加工成为21-23个碱基对(bp)，其中所述siRNA与RNA-诱导的沉默复合物(RISC)结合，然后引导(反义)链识别并降解靶mRNA，由此所述siRNA序列特异性地抑制靶基因的表达(Nucleic-AcidTherapeutics:BasicPrinciplesandRecentApplications,NatureReviewsDrugDiscovery1:503-514,2002)。根据Bertrand等，发现siRNA在体内和体外与反义寡核苷酸(ASO)相比对相同的靶基因具有更优异的抑制mRNA表达的效果(ComparisonofAntisenseOligonucleotidesandsiRNAsinCellCultureandinVivo,Biochem.Biophys.Res.Commun.,296:1000-1004,2002)。此外，由于siRNA的作用机制是siRNA与靶mRNA互补结合以序列特异性地控制靶基因的表达，因此siRNA所应用的靶标与现有基于抗体的药物或小分子药物相比可显著扩大(ProgresstowardsinVivoUseofsiRNAs,MolecularTherapy13(4):664-670,2006)。尽管siRNA具有优异效果和多种用途，为将siRNA开发为治疗剂，应将所述siRNA通过改进siRNA在体内的稳定性和细胞递送效率有效递送入靶细胞(HarnessinginvivosiRNAdeliveryfordrugdiscoveryandtherapeuticdevelopment,DrugDiscov.Today11(1-2):67-73,Jan.2006)。为解决上述问题，已积极实施了对一些核苷酸或siRNA骨架修饰的技术的研究用于改进其体内稳定性从而对核酸酶具有抗性或使用载剂如病毒载体、脂质体、纳米颗粒等。在使用病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等的递送系统中，转染效率高但免疫原性和致癌性同样很高。另一方面，包括纳米颗粒的非病毒递送系统与病毒递送系统相比具有低的细胞递送效率但具有优势，其中非病毒递送系统在体内可具有高度的稳定性、可靶向特异性递送、通过将包含其中的RNAi寡核甘酸摄入或内化入细胞或组织改进递送效率等，且几乎不导致细胞毒性和免疫刺激，因而目前与病毒递送系统相比已将非病毒递送系统评估为潜在的递送系统(NonviralDeliveryofSyntheticsiRNAinvivo,J.Clin.Invest.,117(12):3623–3632,December3,2007)。在非病毒递送系统中，在使用纳米载剂的方法中，纳米颗粒通过使用多种多聚物如脂质体、阳离子多聚复合物等形成，然后将iRNA支持于这些纳米颗粒上，即由此将纳米载剂递送入细胞。在使用纳米载剂的方法中，主要使用多聚纳米颗粒、多聚胶束、脂质复合物等。其中，脂质复合物由阳离子脂质组成且与细胞中内涵体的阴离子脂质相互作用以将内涵体去稳定化，由此发挥将iRNA递送入细胞的作用(Proc.Natl.Acad.Sci.15；93(21):11493-8,1996)。此外，已知siRNA在体内的效率可通过将化学化合物等缀合于siRNA的过客(passenger)(有义)链末端位点以允许siRNA具有改进的药物动力学特征(Nature11；432(7014):173-8,2004)。在这种情况中，siRNA的稳定性可根据缀合于siRNA的有义(过客)或反义(引导)链的末端的化学化合物的性质改变。例如，阳离子化合物存在时，与多聚化合物如聚乙二醇(PEG)缀合的siRNA与siRNA的阴离子磷酸基团相互作用以形成复合物，由此获得包含改进的siRNA稳定性的载剂(J.ControlRelease129(2):107-16,2008)。具体地，由于由多聚复合物组成的胶束具有显著均匀的分布，和自发形成的结构同时包含与微球、纳米颗粒等相比显著小的尺寸，因此其为用作药物递送载剂的另一系统，其在产品的质量易于管理且再现性易于保障方面存在优势。此外，为改进siRNA的细胞内递送效率，已使用通过将作为生物兼容多聚物的亲水化合物(例如聚乙二醇(PEG))与siRNA经由简单共价键或接头介导的共价键缀合而获得的siRNA缀合物开发了用于保障siRNA的稳定性和实施有效细胞膜通透性的技术(韩国专利登记号883471)。然而，即使siRNA是化学修饰的且与聚乙二醇(PEG)缀合，仍存在缺点如在体内的低稳定性和将siRNA递送入靶器官的难度。为解决这些缺点，已开发了其中亲水和疏水化合物与寡核苷酸结合的双链寡RNA分子，特别是双链寡RNA如siRNA。所述分子通过疏水化合物的疏水相互作用形成自身组装的纳米颗粒(其也称作自身组装的胶束抑制性RNA(SAMiRNATM))(参见韩国专利登记号1224828)。SAMiRNATM技术具有优势，其可获得包含与现有递送技术相比显著小尺寸的均质(hemogenous)纳米颗粒。同时，四分之一的韩国人死于癌症(死亡的首要原因)，且对应诊断方法的建立和日期收集方法、年龄群体、环境变化等，死于癌症的患者数目每年显著增加。此外，癌症的生成和由于癌症的死亡在世界也已增加，由此预防、诊断和治疗癌症的方法对于人们来说是普遍且急需的任务(Bio-Technology(BT)TrendsReport,CurrentDevelopmentTrendofNewDrugforMajorDiseases,BiotechnologyPolicyResearchCenter,2007,EditionNo.72)。癌症是全世界导致最大数目人类死亡的疾病之一，且创新性癌症治疗剂的开发可减少在治疗癌症时付出的医疗花费并创造高附加值。癌症的疗法分为手术、放射疗法、化疗和生物疗法。其中，化疗是抑制癌细胞增殖或使用小分子药物杀伤癌细胞的治疗方法。由于在正常细胞中显示大多数通过抗癌药物表达的毒性，因此抗癌药物以相同程度具有毒性。此外，抗癌药物具有抗性，其中所述药物具有抗癌效果但该药物在使用固定周期后丧失抗癌效果。因此，已迫切要求能够选择性地作用于癌细胞且不生成抗性的抗癌药物的开发(CurrentStatusofConqueringCancer.BioWave6(19),2004)。近来，已实施新型抗癌药物的开发，其通过保障癌症的分子遗传信息靶向癌症的分子特征，且已报导靶向特异性分子靶标的抗癌药物未生成药物抗性。因此，可通过开发靶向仅癌细胞具有的特定分子靶标的基因治疗剂来开发与现有抗癌药物相比包含优异效果并降低副作用的治疗剂。已知基因表达可使用RNA干扰现象特异性并高效抑制后，已实施了对靶向不同基因的siRNA作为用于癌症的治疗药物的研究。这些基因的实例可包括致癌基因、抗细胞凋亡分子、端粒酶、生长因子受体基因、信号分子等，所述研究主要朝向抑制癌细胞存活所需基因的表达或诱导细胞凋亡(RNAInterferenceinCancer,BiomolecularEngineering23:17-34,2006)进行。Gankyrin是p28基因产物，它是26S蛋白酶体的控制复合物，并称为p28GANK。此外，Gankyrin是作为调节其为肿瘤抑制基因的视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)和p53的活性的细胞循环调节子的致癌蛋白。当Gankyrin过表达时，pRb的磷酸化增加，且p16INK4a的活性受到抑制，由此加速细胞分裂(GeneTherapyStrategiesforHepatocellularCarcinoma,JournalofBiomedicalScience13(4):453-68,2006)。当减少Gankyrin时，pRb的磷酸化减少，胱天蛋白酶(caspase)-8,9-介导的细胞凋亡增加，且在肝细胞癌(HCC)动物模型中观察到了肿瘤生长抑制(UseofAdenovirus-DeliveredsiRNAtoTargetOncoproteinp28GANKinHepatocellularCarcinoma,Gastroenterology128(7):2029-41,2005)。此外，B细胞特异性Molonet鼠类白血病病毒插入位点1(BcellspecificMolonetmurineleukemiavirusInsertionsite1)(BMI-1)是转录抑制子且用于调节造血干细胞和中性干细胞。BMI-1的酶活性未知，但BMI-1是调节染色质的结构和作为肿瘤抑制蛋白的p16(ink4a)和p14(Arf)的转录活性的多梳抑制性复合物-1(polycombrepressivecomplex-1)(PRC1)的关键调节因子(BMI1asaNovelTargetforDrugDiscoveryinCancer,J.CellBiochem.,112(10):2729-41,2011)。在BMI-1信号未在正常细胞中出现的情况中，细胞循环得到进展，由此抑制细胞凋亡和分裂进展。已证实BMI-1在多种癌症中过表达，且观察到当抑制BMI-1表达时，细胞增殖、集落形成和迁移在体外和体内受到显著抑制(EffectofsiRNA-MediatedSilencingofBMI-1GeneExpressiononHeLaCells,CancerScience101(2):379-386,2010)。如上文所述，已知Gankyrin和BMI-1作为抗癌药物靶标的可能性，但用于Gankyrin和BMI-1的siRNA治疗剂的开发和递送siRNA治疗剂的技术仍微不足道。因此对于能够特异性和有效抑制Gankyrin和BMI-1表达的siRNA治疗剂和递送siRNA治疗剂的技术在市场上具有显著需求。技术实现要素：技术问题本发明的客体是提供能够特异性并高度有效抑制Gankyrin或BMI-1表达的新型siRNA，包含所述siRNA的双链寡RNA分子和制备所述双链寡RNA分子的方法。本发明的另一客体是提供用于预防和治疗癌症特别是肝癌的药物组合物，其包含Gankyrin或BMI-1特异性-siRNA或含有Gankyrin或BMI-1特异性siRNA作为活性成分的双链寡RNA分子。本发明的另一客体是提供使用Gankyrin或BMI-1特异性siRNA或含有Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子预防和治疗癌症的方法。技术方案根据本发明的方面，提供了Gankyrin或BMI-1特异性siRNA(其为肝癌相关基因)，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸作为含有选自SEQIDNO.1-200的任一序列的有义链，所述第二寡核苷酸作为与上述互补的反义链。本发明的术语“Gankyrin特异性siRNA”或“BMI-1特异性siRNA”意指对于编码Gankyrin或BMI-1蛋白的基因特异的siRNA。此外，只要所述siRNA保持对Gankyrin或BMI-1的特异性，本发明的siRNA还可包含在SEQIDNO:1-200的有义链或与SEQIDNO:1-200互补的反义链中具有一个或多个核苷酸缺失、插入或取代的有义或反义链。SEQIDNO.1-100指示Gankyrin特异性siRNA的有义链的序列，且SEQIDNO.101-200指示BMI-1特异性siRNA的有义链的序列。优选地，根据本发明的siRNA可具有含有SEQIDNO.1、10、13、56或99的序列的Gankyrin特异性siRNA的有义链或含有SEQIDNO.102、180、197、199或200的序列的BMI-1特异性siRNA的有义链，更优选地，可具有含有SEQIDNO.1、10或99的序列的Gankyrin特异性siRNA的有义链或含有SEQIDNO.102、199或200的序列的BMI-1特异性siRNA的有义链，且最优选地，可具有含有SEQIDNO.1的序列的Gankyrin特异性siRNA的有义链或含有SEQIDNO.102的序列的BMI-1特异性siRNA的有义链。根据本发明的siRNA的有义链或反义链可由19-31个核苷酸构成。由于本发明提供的Gankyrin或BMI-1特异性siRNA具有碱基序列，所述碱基序列经设计而与编码与其对应的基因的mRNA互补结合，因此Gankyrin或BMI-1特异性siRNA可有效抑制对应基因的表达。此外，Gankyrin或BMI-1特异性siRNA可包含突出端，其为在siRNA的3’-末端含有一个或至少两个未配对核苷酸的结构，且为了改进siRNA在体内的稳定性，Gankyrin或BMI-1特异性siRNA可包含多个用于赋予针对核酸酶的抗性和减少非特异性免疫反应的修饰。关于配置siRNA的第一或第二寡核苷酸的修饰的描述，可使用至少一个选自如下的修饰：通过在至少一个核苷酸中的糖结构的2'-碳位点处用-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、-NH2、-F(氟)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫乙基、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基、-O-N-甲基乙酰氨基或-O-二甲基氨基氧乙基取代-OH基团的修饰；通过用硫取代所述核苷酸中糖结构中的氧的修饰；可组合由此使用核苷酸键变为硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键或甲基磷酸酯键的修饰，和将所述siRNA变为肽核酸(PNA)类型、锁核酸(LNA)类型或解锁核酸(UNA)类型的修饰(Ann.Rev.Med.55,61-652004；US5,660,985；US5,958,691；US6,531,584；US5,808,023；US6,326,358；US6,175,001；Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143,2003；RNA,9:1034-1048,2003；NucleicAcidRes.31:589-595,2003；NucleicAcidsResearch,38(17)5761-5773,2010；NucleicAcidsResearch,39(5)1823-1832,2011)。本发明提供的Gankyrin或BMI-1特异性siRNA可显著抑制相应蛋白的表达以及抑制相应基因的表达。此外，由于已知siRNA可改进放射疗法或化疗(其为通常与用于治疗癌症的癌症特异性RNAi组合的治疗方法)的敏感性(ThePotentialRNAi-basedCombinationTherapeutics.Arch.Pharm.Res.34(1):1-2,201)，因此根据本发明的Gankyrin特异性siRNA或BMI-1特异性siRNA可与现有的放射疗法或化疗共同使用。此外，在同时使用根据本发明的Gankyrin特异性siRNA和BMI-1特异性siRNA的情况中，相应基因的表达同时受到抑制，从而癌细胞的生长可受到显著抑制。根据本发明的另一方面，提供了一种缀合物，其中亲水和疏水化合物与siRNA的两末端缀合由此将肝癌相关基因特别是Gankyrin或BMI-1特异性siRNA有效递送入身体并改进稳定性。在亲水和疏水化合物与如上文所述的siRNA结合的情况中，自组装的纳米颗粒通过疏水化合物的疏水相互作用形成(参见韩国专利登记号1224828)。该缀合物具有明显优异的递送入身体的效率和在体内优异的稳定性，且粒度的均匀性也很优异，因此质量控制(QC)可为容易的。因此，该缀合物可具有制药过程简单的优势。作为具体的实例，根据本发明包含Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子可优选具有下列结构式(1)的结构：A-X-R-Y-B结构式(1)在结构式(1)中，A是亲水化合物，B是疏水化合物，X和Y分别为简单共价键或接头介导的共价键，且R是Gankyrin或BMI-1特异性siRNA。只要siRNA保持对Gankyrin或BMI-1的特异性，本发明的Gankyrin或BMI-1特异性siRNA还包含与Gankyrin或BMI-1mRNA部分互补(错配)的反义链，以及与Gankyrin或BMI-1mRNA完全互补(完全匹配)的反义链。本发明的siRNA的反义或有义链可具有与Gankyrin或BMI-1mRNA序列至少70％、优选80％、更优选90％且最优选95％的序列同源性或互补性。siRNA可为双链双联体或单链多核苷酸，其包括但不限于反义寡核苷酸或miRNA。更优选地，根据本发明包含Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子可具有下列结构式(2)的结构：在结构式(2)中，A、B、X和Y分别具有如结构式(1)中的那些相同的定义，S是Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的有义链，且AS是Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的反义链。更优选地，根据本发明包含Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子可具有下列结构式(3)的结构：对本发明所属领域的技术人员显而易见的是：在结构式(1)-(3)中，一至三个磷酸基团可与含有Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子的反义链的5’-末端结合，且可使用siRNA替换所述siRNA。结构式(1)-(3)中的亲水化合物可优选为包含200-10,000分子量的阳离子或非离子多聚化合物，更优选为包含1,000-2,000分子量的非离子多聚化合物。例如，作为亲水多聚化合物，可优选使用非离子亲水多聚化合物如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚噁唑啉(polyoxazoline)等，但本发明并不局限于此。结构式(1)-(3)中的疏水化合物B可用于形成由结构式(1)的寡核苷酸分子通过疏水相互作用形成的纳米颗粒。优选地，疏水化合物可具有250-1,000的分子量，且可使用甾类衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、饱和或不饱和的C12-C50烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂和脂多胺等，但本发明并不局限于此。对本发明所属领域的技术人员显而易见的是可使用任何疏水化合物，只要所述化合物可满足本发明的目标。所述甾类衍生物可选自下组：胆甾醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇甲酸酯、胆甾烷醇甲酸酯和胆甾醇胺，且所述甘油酯衍生物选自单、双和三甘油酯等。在这种情况中，甘油酯的脂肪酸可优选为非饱和或饱和C12-C50脂肪酸。具体地，在疏水化合物中，饱和或非饱和烃类或胆甾醇可为优选，由于它们可在合成根据本发明的寡核苷酸分子过程中易于结合。疏水化合物可结合至相对于亲水化合物的远端，且可结合至siRNA的有义或反义链的任何位点。结构式(1)-(3)中的亲水或疏水化合物和根据本发明的Gankyrin或BMI-1特异性siRNA可通过简单共价键或接头介导的共价键(X或Y)彼此结合。介导共价键的接头与亲水或疏水化合物在Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的末端共价结合，且只要所述接头在特定环境中可提供可降解键，根据需要，所述接头不受具体限制。因此，作为接头，可使用结合从而在制备根据本发明的双链寡RNA分子的过程中激活Gankyrin或BMI-1特异性siRNA和/或亲水(或疏水)化合物的任何化合物。共价键可为不可降解键或可降解键的任一种。在这种情况中，不可降解键的实例可包括酰胺键和磷酸键，且可降解键的实例包括二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键、酶可降解键等，但不可降解键或可降解键并不局限于此。此外，如在结构式(1)-(3)中由R代表的Gankyrin或BMI-1特异性siRNA，可使用任何siRNA而无限制，只要所述siRNA可特异性与Gankyrin或BMI-1结合。优选地，在本发明中，Gankyrin或BMI-1特异性siRNA由含有选自SEQIDNO.1-200任一序列的有义链和含有与其互补的序列的反义链构成。根据本发明的siRNA可优选具有：含有SEQIDNO.1、10、13、56或99的序列的Gankyrin特异性siRNA的有义链或含有SEQIDNO.102、180、197、199或200的序列的BMI-1特异性siRNA的有义链；更优选具有含有SEQIDNO.1、10或99的序列的Gankyrin特异性siRNA的有义链或含有SEQIDNO.102、199或200的序列的BMI-1特异性siRNA的有义链；且最优选具有含有SEQIDNO.1的序列的Gankyrin特异性siRNA的有义链或含有SEQIDNO.102的序列的BMI-1特异性siRNA的有义链。同时，与正常组织相比，肿瘤组织具有显著刚性且具有扩散限制。由于该扩散限制对肿瘤生长所需营养物、氧、废料如二氧化碳的运动具有影响，因此肿瘤组织由血管形成通过形成周围的血管克服该扩散限制。肿瘤组织中通过血管生成产生的血管可为渗漏性的且根据癌症类型为包含100nm-2um渗漏的缺陷性血管。因此，纳米颗粒易于穿透包含与正常组织工整的毛细血管相比的缺陷性或渗漏结构的癌症组织的毛细血管上皮，由此所述纳米颗粒在血管中的循环过程中易于接近肿瘤间质，且淋巴引流不存在于肿瘤组织中，使得药物可积累，这称为‘增强的渗透和保留(enhancedpermeationandretention)(EPR)作用’。纳米颗粒通过该效应被肿瘤特异性递送，这称作‘被动靶向’(NanoparticlesforDrugDeliveryinCancerTreatment,Urol.Oncol.,26(1):57-64,Jan-Feb,2008)。主动靶向意指靶向部分与纳米颗粒结合，且已报导靶向部分促进纳米颗粒在靶向组织中的优先积累或改进纳米颗粒内化入靶细胞(DoesaTargetingLigandInfluenceNanoparticleTumorLocalizationorUptakeTrends,Biotechnol.26(10):552-8mOct,2008,Epub.Aug21,2008)。在主动靶向中，可使用靶细胞特异性材料或能够与过表达的碳水化合物、受体或抗原结合的材料，即靶标部分(NanotechnologyinCancerTherapeutics:BioconjugatedNanoparticlesforDrugDelivery,Mol.CancerTher.,5(8):1909-1917,2006)。因此，在靶向部分提供于根据本发明的含有Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子中且由此形成纳米颗粒的情况中，siRNA向靶细胞内的递送可受到有效促进，使得siRNA可甚至以相对低的浓度递送入靶细胞，由此显示高的靶基因表达调节功能并防止Gankyrin或BMI-1特异性siRNA向其他器官或细胞的非特异性地递送。因此，本发明提供双链寡RNA分子，其中配体L，特别是特异性结合于受体通过受体介导的内吞作用(RME)促进内化入靶细胞的配体，额外结合于由结构式(1)-(3)代表的分子，且其中配体结合于由结构式(1)代表的双链RNA分子的形式具有下列结构式(4)的结构：(Li-Zj)-A-X-R-Y-B结构式(4)在结构式(4)中，A、B、X和Y分别具有如结构式(1)-(3)中的那些相同的定义，L是与受体特异性结合通过受体介导的内吞作用(RME)促进内化入靶细胞的配体，且i和j各自独立地为0或1。优选地，结构式(5)中的配体可选自靶受体特异性抗体、适配体、和具有特异性促进内化的靶细胞的受体介导内吞(REM)作用的肽；和化学物质，例如叶酸(盐)(通常叶酸盐和叶酸彼此相容，且本发明中的叶酸(盐)意指体内天然叶酸盐或活性叶酸盐)、四氮六甲圜(hexamine)如N-乙酰基半乳糖胺(NAG)、糖如葡萄糖、甘露糖等，碳水化合物等，但不限于此。根据本发明的另一方面，提供了一种制备包含Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子的方法。制备包含根据本发明的Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子的方法例如可包括：(1)基于固体支持物(在本发明中使用的固体支持物是受控孔径玻璃(CPG)结合亲水化合物；(2)基于亲水化合物所结合的固体支持物(CPG)合成RNA单链；(3)将疏水化合物与RNA单链的5'-末端共价结合；(4)合成包含与所述RNA单链互补的序列的RNA单链；(5)合成完成后从固体支持物(CPG)上分离RNA聚合物分子和RNA单链然后纯化所述分离的RNA聚合物分子和RNA单链；且(6)通过退火从制备的RNA聚合物分子和包含互补序列的RNA单链制备双链寡RNA分子。当步骤(5)后制备完成时，合意的RNA-多聚分子和RNA单链是否制备可使用MALDI-TOF质谱仪通过测量纯化的RNA聚合物分子和RNA单链的分子量确认。在所述方法中，包含与步骤(2)中制备的RNA单链互补的序列的RNA单链的合成(步骤(4))可在步骤(1)前或步骤(1)-步骤(5)的任一步骤中实施。此外，包含与步骤(2)中合成的RNA单链互补的序列的RNA单链可以其中磷酸基团结合于5’-末端的形式使用。同时，提供了一种制备配体结合的双链寡RNA分子的方法，其中配体额外地与根据本发明的包含Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子结合。制备包含Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的配体结合的双链寡RNA分子的方法例如可包括：(1)将亲水化合物结合至功能基团所结合的固体支持物(CPG)上；(2)将RNA单链合成于功能基团-亲水化合物所结合的固体支持物(CPG)上；(3)将疏水化合物共价结合至RNA单链的5'-末端；(4)合成包含与所述RNA单链互补的序列的RNA单链；(5)合成完成后从所述固体支持物(CPG)分离功能基团-RNA聚合物分子和包含互补序列的RNA单链；(6)使用功能基团将配体结合至亲水化合物的末端以制备配体-RNA-聚合物分子单链；且(7)通过退火从制备的配体-RNA聚合物分子和包含互补序列的RNA单链制备配体-双链RNA聚合物分子。步骤(6)后制备完成时，分离并纯化配体-RNA聚合物分子和包含互补序列的RNA单链。然后，合意的配体-RNA聚合物分子和互补RNA是否制备使用MALDI-TOF质谱仪通过测量纯化的RNA聚合物分子和RNA单链的分子量确认。配体-双链标准寡RNA聚合物分子可从制备的配体-RNA聚合物分子和包含互补序列的RNA单链通过退火制备。在所述方法中，包含与步骤(3)中制备的RNA单链互补的序列的RNA单链的合成(步骤(4))可作为独立的合成过程在步骤(1)前或步骤(1)-步骤(6)的任一步中实施。根据本发明的又一方面，提供了纳米颗粒，其包含含有Gankyrin和/或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子。如上所述，含有Gankyrin和/或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子是包含疏水和亲水化合物两者的两亲性分子。亲水部分可由于与水分子等的相互作用如氢键等而具有针对体内存在的水分子的亲和力，由此朝向外侧，而疏水化合物由于其间的疏水相互作用可朝向内侧，由此形成热稳定的纳米颗粒。也即，可形成纳米颗粒，其包含其中疏水化合物位于纳米颗粒中心而亲水化合物位于朝向Gankyrin和/或BMI-1特异性siRNA的外侧以保护Gankyrin和/或BMI-1特异性siRNA的形式。如上所述形成的纳米颗粒可改进Gankyrin和/或BMI-1特异性siRNA的细胞内递送效率和siRNA的效果。根据本发明的纳米颗粒的特征在于所述纳米颗粒由包含含有不同序列的siRNA的双链寡RNA分子形成。此处，包含不同序列的siRNA可为不同的靶基因，例如Gankyrin或BMI-1特异性siRNA，或为包含不同序列同时包含彼此对相同靶基因的特异性的siRNA。此外，包含除Gankyrin或BMI-1特异性siRNA外另一癌症特异性靶特异性siRNA的双链寡RNA分子可包含于根据本发明的纳米颗粒中。根据本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包含：Gankyrin或BMI-1特异性siRNA；含有所述siRNA的双链寡RNA分子；和/或由所述双链寡RNA分子制成的纳米颗粒。包含根据本发明的Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的组合物；包含所述siRNA的双链寡RNA分子和/或由双链寡RNA分子作为活性成分制成的纳米颗粒可诱导癌细胞的增殖和细胞凋亡以由此显示预防或治疗癌症的效果。因此，根据本发明的Gankyrin或BMI-1特异性siRNA和包含所述siRNA的组合物可有效预防或治疗多种癌症，如胃癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肾癌以及肝癌，其中报道了相应基因的过表达。具体地，在用于预防或治疗癌症的包含根据本发明的双链寡RNA分子的组合物中，可含有包含Gankyrin特异性siRNA的双链寡RNA分子或包含BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子，其中所述Gankyrin特异性siRNA由包含选自SEQIDNO.1-100的任一序列，优选选自SEQIDNO.1、10、13、56和99的任一序列，更优选SEQIDNO.1、10或99的序列，且最优选SEQIDNO.1的序列的有义链和包含与有义链互补的序列的反义链构成，其中所述BMI-1特异性siRNA由包含选自SEQIDNO.101-200的任一序列，优选选自SEQIDNO.102、180、197、199和200的任一序列，更优选SEQIDNO.102、199或200的序列且最优选SEQIDNO.102的序列的有义链和包含与有义链互补的序列的反义链构成。可替换地，可在混合的形式中包含含有Gankyrin特异性siRNA的双链寡RNA分子和含有BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子。此外，除Gankyrin或BMI-1外对另一癌症特异性靶基因具有特异性的siRNA可额外包含于本发明的组合物中。如上文所述，在使用包含含有Gankyrin特异性siRNA和BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子，或包含含有Gankyrin特异性siRNA和除BMI-1特异性siRNA外另一癌症特异性靶特异性siRNA的双链寡RNA分子的用于预防或治疗癌症的组合物的情况中，可获得与通常用于癌症治疗的组合疗法类似的协同效应。根据本发明的组合物可预防或治疗例如肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、肺癌等，但不限于此。此外，包含于含有由根据本发明的双链寡RNA分子制成的纳米颗粒的用于预防或治疗癌症的组合物中的纳米颗粒可纯粹由选自包含Gankyrin和BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子的任一分子组成或由以混合形式包含Gankyrin和BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子组成。可制备根据本发明的组合物以在如上文所述的活性成分外进一步包含至少一种药物上可接受的载剂。药物上可接受的载剂可与本发明的活性成分兼容，且可使用普通的盐水、无菌水、林格氏溶液(Ringer’ssolution)、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇中的任一种或其至少两种的混合物。另一种通用的添加剂如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等可酌情添加。此外，所述组合物可通过额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂配制成用于注射的制剂如水溶液、悬浮液、乳液等。具体地，所述组合物可优选配制成冻干制剂。可使用本发明所属领域公知的方法由此制备冻干制剂，且可添加用于冻干的稳定剂。此外，根据疾病或成分，所述组合物可优选使用本领域已知的适当方法或公开于Remington'spharmaceuticalScience(MackPublishingCompany,EastonPA)的方法配制。包含于根据本发明的组合物中的活性成分的含量和施用方法可由本领域的技术人员基于患者的症状和疾病的严重性判断。此外，所述组合物可配制成多种制剂如粉末、片剂、胶囊、液体、注射剂、软膏、糖浆等，且可提供于单位剂量容器或多剂量容器中，例如密封安、瓶等。根据本发明的组合物可口服或肠胃外施用。根据本发明的组合物的施用途径不受具体限制，但可进行口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹腔、经肠、舌下或局部施用。根据本发明的组合物的剂量可根据患者的重量、年龄、性别、健康状况和饮食、施用时间、施用方法、排泄率、疾病的严重程度等而变化，且可由本领域的技术人员容易确定。此外，所述组合物可使用本领域已知的方法配制成用于临床施用的合适制剂。根据本发明的另一方面，提供了Gankyrin或BMI-1特异性siRNA、包含所述siRNA的双链寡RNA分子和/或由双链寡RNA分子制成的纳米颗粒在制造用于预防或治疗癌症的药物中的用途。根据本发明的另一方面，提供用于预防或治疗癌症的方法，其包括将根据本发明的双链寡RNA分子、包括双链寡RNA分子的纳米颗粒和双链寡RNA分子或纳米颗粒施用至需要治疗的患者。优势效果如上文所述，包含根据本发明的Gankyrin和/或BMI-1特异性siRNA用于治疗癌症的组合物或包含所述siRNA的双链寡RNA分子可高效抑制Gankyrin和/或BMI-1基因的表达以有效治疗癌症(特别是肝癌)而无副作用，从而所述组合物在治疗无合适治疗剂的癌症中显著有用。附图简述图1是由根据本发明的双链寡RNA分子制成的纳米颗粒的示意图；图2是通过测量由包含根据本发明的SEQIDNO.1、102或201序列作为有义链的双链寡RNA分子制成的纳米颗粒的大小和分散指数(PDI)获得的图，其中，SAMiRNA-Gank意指由含有包含SEQIDNO.1序列作为有义链的siRNA的双链寡RNA分子制成的纳米颗粒；SAMiRNA-BMI意指由含有包含SEQIDNO.102序列作为有义链的siRNA的双链寡RNA分子制成的纳米颗粒；且SAMiRNA-Gank+BMI意指由含有包含SEQIDNO.1和102的序列作为有义链的siRNA的双链寡RNA分子制成的纳米颗粒；图3是用包含根据本发明的SEQIDNO.1-100序列作为有义链的siRNA(1nM)转染后确认的靶基因表达抑制水平；图4是用包含根据本发明的SEQIDNO.1-100序列作为有义链的siRNA(0.2nM)转染后确认的靶基因表达抑制水平；图5是用包含根据本发明的SEQIDNO.101-200序列作为有义链的siRNA(1nM)转染后确认的靶基因表达抑制水平；图6是用包含根据本发明的SEQIDNO.101-200序列作为有义链的siRNA(0.2nM)转染后确认的靶基因表达抑制水平；图7A和7B是用包含根据本发明的SEQIDNO.1、10、12、35、56、61、81、88和99的序列作为有义链的siRNA以低浓度分别治疗两种肝癌细胞后，通过确认靶基因表达抑制水平获得的图(A:Hep3B细胞系，B:Huh-7细胞系)；图8A和8B是用包含根据本发明的SEQIDNO.102、124、125、180、183、193、197、198、199和200的序列作为有义链的siRNA以低浓度分别治疗两种肝癌细胞后，通过确认靶基因表达抑制水平获得的图(A:Hep3B细胞系，B:Huh-7细胞系)；图9A和9B是通过确认包含根据本发明的SEQIDNO.1和102的序列作为有义链的siRNA的抑制浓度50％(IC50)获得的图(A：SEQIDNO.1的siRNA的IC50，B：SEQIDNO.102的siRNA的IC50)；图10A和10B是用根据本发明的SEQIDNO.1、102和201作为有义链的siRNA转染两种癌细胞后通过集落形成测定法(CFA)由相应的siRNA显示集落形成抑制的图(A：使用SEQIDNO.1的siRNA的集落形成测定法，B：使用SEQIDNO.102的siRNA的集落形成测定法)；图11是在用根据本发明的SEQIDNO.1、102和201作为有义链的siRNA共转染时显示靶基因表达抑制的图；图12是用根据本发明的SEQIDNO.1,102和201作为有义链的siRNA共转染时显示细胞活力降低的图；图13是在肝癌模型中，包含双链RNA分子的纳米颗粒静脉注射时显示靶基因表达抑制的图，所述双链RNA分子含有包含SEQIDNO.1和102的序列作为有义链的siRNA，且示于图13的结果通过测量靶基因在实验组中表达的mRNA水平而获得，在所述实验组中，施用包含SEQIDNO.102的siRNA的纳米颗粒，与其相比对照组在最后一次注射48小时后在肿瘤组织中施用包含SEQIDNO.201的siRNA的纳米颗粒，且X轴中所示的每个标号指示一个个体；且图14是显示通过将包含双链RNA分子的纳米颗粒静脉注射入肝癌模型中引起的肝癌生长抑制效果的图，所述双链RNA分子包含含有根据本发明的SEQIDNO.1、102和201的序列的siRNA，其中由于所述纳米颗粒的注射导致的肝癌生长抑制水平通过血清中的α-胎蛋白(AFP)值确认，其中，DPBS意指仅注射Dulbecco'sPhosphate-BufferedSaline(DPBS，用作溶剂)的对照组；201意指以5mg/kg体重注射包含SEQIDNO.201的siRNA的纳米颗粒的对照组；1意指以5mg/kg体重注射包含SEQIDNO.1的siRNA的纳米颗粒的实验组；102意指以5mg/kg体重注射包含SEQIDNO.102的siRNA的纳米颗粒实验组；1+102意指以5mg/kg体重注射包含相同含量的含有SEQIDNO.1的siRNA的双链寡RNA分子和含有SEQIDNO.102的siRNA的双链寡RNA分子的纳米颗粒的实验组(每种双链寡RNA分子以2.5mg/kg体重注射)；且索拉非尼(sorapenib)意指阳性对照组。实施方案的详述此后，将通过实施例对本发明进行详细描述。然而，这些实施例仅为阐述本发明，且本领域的技术人员将理解这些实施例不应理解为是对本发明保护范围的限制。实施例1：Gankyrin和BMI-1基因靶序列的设计和siRNA的制备设计能够与Gankyrin基因的mRNA序列(NM_002814)或BMI-1基因的mRNA序列(NM_005180)每个基因结合的100种靶序列(有义链)，且制备了包含与预期碱基序列互补的序列的反义siRNA链。首先，siRNA可能与之结合的合意的碱基序列使用由Bioneer开发的Turbosi-Designer从相应基因的mRNA序列设计。本发明针对肝癌相关基因的siRNA具有由包含19个核苷酸的有义链和与之互补的反义链组成的双链结构。此外，制备了siCONT(SEQIDNO.201)，它是包含不抑制基因表达的序列的siRNA。所述siRNA通过使用β-氰乙基氨基磷酸酯连接配置RNA骨架结构的磷酸二酯键制备(NucleicAcidsResearch,12:4539-4557,1984)。更具体地，使用RNA合成器(384Synthesizer,Bioneer,Korea)通过在核苷酸附接其上的固体支持物上重复由去封闭、偶联、氧化和加帽组成的系列步骤获得包含含有合意长度的RNA的反应物。从反应物分离RNA并使用配备DaisogelC18(Daiso,Japan)柱的HPLC(LC918,JapanAnalyticalIndustry,Japan)纯化。随后，使用MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu,Japan)确认纯化的RNA是否与合意的碱基序列一致。然后，通过将有义和反义RNA链彼此结合制备包含SEQIDNO.1-201的有义链的合意的双链siRNA(参见表1)。表1.本发明的siRNA有义链序列实施例2：双链寡RNA分子(SAMiRNALP)的制备在本发明中制备的双链寡RNA分子(SAMiRNALP)具有下列结构式(5)的结构：在结构式(5)中，S是siRNA的有义链；AS是siRNA的反义链；PEG是作为亲水化合物的聚乙二醇；C24是作为疏水化合物的包含二硫键的四二十二烷/二十四烷(tetradocosane)；且5’和3’意指双链寡RNA的末端方向。在结构式(5)的siRNA有义链的情况中，当使用根据已有发明(KR2012-0119212A)公开的实施例1中的方法作为支持制备聚乙二醇(PEG,Mn＝2,000)-CPG时，包含聚乙二醇结合于其3’-末端区的有义链的寡RNA-亲水化合物分子通过使用如上文所述的β-氰乙基氨基磷酸酯连接配置RNA骨架结构的磷酸二酯键的方法合成，然后将包含二硫键的四二十二烷(tetradocosane)与5’-末端区结合，由此制备合意的RNA聚合物分子的有义链。在将反义链与所述链退火的情况中，通过上述反应制备包含与所述有义链的序列互补的序列的反义链。合成完成后，合成的RNA单链和RNA聚合物分子通过在60℃的水浴中用氨(28％(v/v))处理反应物从CPG分离，然后通过脱保护反应去除保护残基。在70℃的炉中用N-甲基吡咯烷酮、三乙基胺和三乙基胺三氢氟酸以10:3:4的体积比处理去除保护残基的RNA单链和RNA聚合物分子，由此去除叔丁基二甲基甲硅烷基(2’TBDMS)。从反应物分离RNA并使用配备了DaisogelC18(Daiso,Japan)柱的HPLC(LC918,JapanAnalyticalIndustry,Japan)纯化。随后，使用MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu,Japan)确认纯化的RNA是否与合意的碱基序列一致。此后，为制备每种双链寡RNA聚合物分子，混合相同量的有义和反义链并将其放入1X退火缓冲剂(30mMHEPES，100mM乙酸钾，2mM乙酸酶，pH7.0～7.5)中，之后在90℃的水浴中彼此反应3分钟并在37℃彼此再次反应，由此制备分别包含SEQIDNO.1、102和201的siRNA的双链寡RNA分子(此后分别称为SAMiRNALP-Gank、SAMiRNALP-BMI、SAMiRNALP-CONT)。已通过电泳确认制备的双链寡RNA分子已退火。实施例3：由SAMiRNALP制成的纳米颗粒(SAMiRNA)的制备和大小的测量实施例2中制备的SAMiRNALP形成纳米颗粒，即通过结合于双链寡RNA末端的疏水化合物之间的疏水相互作用的胶束(参见图1)。分析了分别由SAMiRNALP-Gank、SAMiRNALP-BMI和SAMiRNALP-CONT制成的纳米颗粒的大小和分散指数(PDI)，由此确认由相应的SAMiRNALP制成的纳米颗粒(SAMiRNA)的形成。实施例3-1：纳米颗粒的制备以50μg/ml的浓度在1.5mlDulbecco'sPhosphateBufferedSaline(DPBS)中溶解SAMiRNALP-Gank后，通过在-75℃和5mTorr冻干48小时制备纳米颗粒粉末并溶解于作为溶剂的DPBS中，由此制备均质的纳米颗粒。在SAMiRNA-Gank+BMI的情况中，以50μg/ml的浓度在0.75mlDulbecco'sPhosphateBufferedSaline(DPBS)中分别溶解SAMiRNALP-Gank和SAMiRNA-BMI后，分别通过在-75℃和5mTorr冻干48小时冻干制备纳米颗粒粉末并溶解于作为溶剂的DPBS中以制备均质的纳米颗粒，随后混合两种化合物，由此制备包含含有SEQIDNO.1和102的有义链的siRNA的纳米颗粒。实施例3-2：纳米颗粒的粒度和分散指数(此后称为‘PDI’)的测量纳米颗粒的大小使用ζ电位测量进行测量。在实施例3-1制备的均质纳米颗粒的大小使用ζ电位测量(Nano-ZS,MALVERN,UK)进行测量。此处，将化合物的折射指数和吸收指数分别设置为1.459和0.001。此外，将作为溶剂的DPBS的温度输入为25℃，且其粘度和折射指数分别输入为1.0200和1.335。一次测量由15次重复大小的测量组成，且重复该测量六次。由SAMiRNALP-BMI和SAMiRNALP-Gank+BMI制成的纳米颗粒的大小通过相同方法测量。已确认由SAMiRNALP-Gank制成的纳米颗粒(SAMiRNA-Gank)具有约83nm的大小和0.24的PDI值，且由SAMiRNALP-BMI制成的纳米颗粒(SAMiRNA-BMI)具有80nm的大小和0.22的PDI值。已确认由SAMiRNALP-Gank+BMI制成的纳米颗粒(SAMiRNA-Gank+BMI)具有约85nm的大小和0.26的PDI值(参见图2)。所述PDI值是指示随PDI值减少相应的颗粒更均匀分散的值。因此，可以理解的是根据本发明的纳米颗粒的形成具有显著一致的大小。实施例4：使用siRNA确认人肝癌细胞系(Hep3B细胞系)中靶基因表达的抑制分别使用包含实施例1中制备的SEQIDNO.1-201的有义链的siRNA转染人肝癌细胞系(Hep3B细胞系)，并分析转染的Hep3B细胞系中靶基因的表达水平。实施例4-1：人肝癌细胞系的培养从AmericanTypeCultureCollection(ATCC)获得的人肝癌细胞系(Hep3B细胞系)在补充了10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Eagle氏最少必需培养基(Eagle'sminimumessentialmedium)(EMEM,GIBCO/Invitrogen,USA)中在37℃于5％(v/v)CO2气氛中培养。实施例4-2：合意的siRNA在人肝癌细胞系中的转染在使用EMEM将实施例4-1中培养的1×105Hep3B细胞系在37℃于5％(v/v)CO2的气氛中在12孔板中培养18小时后，去除所述培养基，并随后在每孔中分配500μLOpti-MEM培养基(GIBCO,US)。同时，将1.5μL的LipofectamineTMRNAiMax(Invitrogen,US)和248.5μL的Opti-MEM培养基彼此混合以制备混合溶液，然后在室温彼此反应5分钟。随后，将0.2或1μL实施例1中制备的SEQIDNO.1-201的每种siRNA(1皮摩/μL)添加至230μL的Opti-MEM培养基，由此制备包含终浓度0.2nM或1nM的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAiMax混合溶液和siRNA溶液混合并随后彼此在室温反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。其后，将500μL用于转染的溶液分配于包含肿瘤细胞系和分配的Opti-MEM培养基的每孔中并培养6小时，随后去除Opti-MEM培养基。此处，将1ml的EMEM培养基分配于每孔并在37℃于5％(v/v)CO2的气氛中培养24小时。实施例4-3：靶基因mRNA的定量分析从实施例4-2转染的细胞系中提取总RNA以制备cDNA，然后使用实时聚合酶链式反应(PCR)相对定量靶基因mRNA的表达水平。实施例4-3-1：从转染的细胞分离RNA并制备cDNA从实施例4-2中转染的细胞系通过使用RNA提取试剂盒提取总RNA(AccuPrepCelltotalRNAextractionkit,Bioneer,Korea)，且从提取的RNA使用RNA逆转录酶(AccuPowerCycleScriptRTPremix/dT20,Bioneer,Korea)如下制备cDNA。更具体地，将1μg提取的RNA放入每个包含AccuPowerCycleScriptRTPremix/dT20(Bioneer,Korea)的0.25mlEppendorf管中，添加用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的蒸馏水而具有20μL总体积。使用PCR仪(MyGenieTM96GradientThermalBlock,Bioneer,Korea)将在30℃进行RNA引物杂交1分钟和在52℃制备cDNA4分钟的两步重复六次，然后通过在95℃灭活酶5分钟终止扩增反应。实施例4-3-2：靶基因mRNA的相对定量分析肝癌相关基因mRNA的相对水平通过实时PCR使用在实施例4-3-1中制备的cDNA作为模板如下定量。将实施例4-3-1中制备的cDNA用蒸馏水在96孔板的每孔中稀释5倍，然后为精确分析靶基因mRNA的表达水平，将3μL稀释的cDNA、10μL2×GreenStarTMPCR主混合物(Bioneer,Korea)，6μL蒸馏水和1μL的GankyrinqPCR引物(F和R每种：10皮摩/μL,Bioneer,Korea，参见表2)用于制备混合溶液。同时，为标准化靶基因mRNA表达水平，将看家基因(此后称为HK基因)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作参照基因。在包含混合溶液的96孔板上使用ExicyclerTM96Real-TimeQuantitativeThermalBlock(Bioneer,Korea)实施下列反应。酶激活并通过在95℃实施反应15分钟去除cDNA的二级结构。随后，将在94℃变性30秒、在58℃退火30秒、在72℃延伸30秒和SYBR绿扫描的四步重复进行42次，然后在72℃实施最终延伸3分钟。此后，将温度在55℃维持1分钟，并分析55℃～95℃的熔解曲线。完成PCR后，获得的每种靶基因的阈循环(Ct)值使用GAPDH基因进行校正，由此获得靶基因的校正Ct值。然后，使用包含不抑制基因表达的对照序列的siRNA(siCONT)处理的实验组作为对照组计算Ct值的差(ΔCt)。分别相对定量在用包含SEQIDNO.1-100的有义链的Gankyrin特异性siRNA处理的细胞中靶基因的表达水平，使用ΔCt值和计算公式2(-ΔCt)X100(参见图3和4)。此外，在用BMI-1特异性siRNA(SEQIDNO.101-200作为有义链)处理的每个实验组中，通过使用BMI-1qPCR引物和GAPDHqPCR引物(图5和6)以相同方法相对定量靶基因的mRNA。为选择包含高效力的siRNA，选择在0.2nM和1nM的浓度通常显著减少的每种基因mRNA表达水平的情况中所使用的siRNA(SEQIDNO.1、10、13、56、99、102、180、197、199和200作为有义链)。表2.qPCR引物序列信息(F：正向引物，R：反向引物)名称序列SEQIDNO.GAPDH-FGGTGAAGGTCGGAGTCAACG202GAPDH-RACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG203Gankyrin-FAGCAGCCAAGGGTAACTTGA204Gankyrin-RCACTTGCAGGGGTGTCTTTT205BMI1-FTCATCCTTCTGCTGATGCTG206BMI1-RCCGATCCAATCTGTTCTGGT207实施例5：在人肝癌细胞系(Hep3B和Huh-7细胞系)中包含高效力的siRNA的选择和抑制浓度50％(IC50)的测量使用包含选自实施例4-3-2中选择的SEQIDNO.1、10、13、56、99、102、180、197、199、200和201的有义链的siRNA转染人肝癌细胞系(Hep3B和Huh-7)，并分析了转染的人肝癌细胞系(Hep3B和Huh-7细胞系)中靶基因的表达水平，由此选择包含高效力的siRNA。随后，通过测量包含最高效的siRNA的IC50确认siRNA的表现。实施例5-1：人肝癌细胞系的培养从AmericanTypeCultureCollection(ATCC)获得的人肝癌细胞系(Hep3B细胞系)，在与实施例4-1相同的条件下培养。从KoreanCellLineBank(KCLB)获得的人肝癌细胞系(Huh-7细胞系)在补充了10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基(GIBCO/Invitrogen,USA)中在37℃5％(v/v)CO2的气氛中培养。实施例5-2：合意的siRNA在人肝癌细胞系中的转染实施例5-1中的Hep3B细胞系在与实施例4-2相同的条件下培养后，将1.5μL的LipofectamineTMRNAiMax(Invitrogen,US)和248.5μL的Opti-MEM培养基彼此混合以制备混合溶液然后彼此在室温反应5分钟。随后，将在实施例1中制备的包含SEQIDNO.1、10、13、56、99和201的0.04、0.2或1μL的每种siRNA(1皮摩/μL)和根据相关技术(US2008/0071075)的siRNA(Gank_Ref,GGGCAGCAGCCAAGGGUAA(SEQIDNo.208),DharmaconA1,1皮摩/μL)添加至230μLOpti-MEM培养基中，由此制备终浓度为0.04、0.2或1nM的siRNA溶液。将0.008、0.04或0.2μL的每种实施例1中制备的包含SEQIDNO.102、180、197、199、200和201的有义链的siRNA(1皮摩/μL)和根据相关技术的siRNA(1皮摩/μL)添加至230μL的Opti-MEM培养基中，由此制备包含0.008、0.04或0.2nM的终浓度的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAiMax混合溶液和siRNA溶液混合并在室温彼此反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。此外，将实施例5-1中的1×105Huh-7细胞系在12孔板中使用RPMI-1640培养基在37℃5％(v/v)CO2的气氛中培养18小时后，去除培养基，然后将500μL的Opti-MEM培养基(GIBCO,US)分配在每孔中。同时，将1.5μL的LipofectamineTMRNAiMax(Invitrogen,US)和248.5μL的Opti-MEM培养基彼此混合以制备混合溶液然后在室温彼此反应5分钟。随后，将0.04、0.2或1μL的包含实施例1中制备的SEQIDNO.1、10、13、56、99和201的有义链的每种siRNA(1皮摩/μL)和根据相关技术的siRNA(Gank_Ref,1皮摩/μL)添加至230μL的Opti-MEM培养基，由此制备包含0.04、0.2或1nM终浓度的siRNA溶液。将0.008、0.04或0.2μL的包含实施例1中制备的SEQIDNO.102、180、197、199、200和201的有义链的每种siRNA(1皮摩/μL)和siRNA(BMI-1_Ref,CGTGTATTGTTCGTTACCT,(SEQIDNo.209),CancerSci.2010Feb；101(2):379-86)(1皮摩/μL)添加至230μL的Opti-MEM培养基，由此制备包含0.008、0.04或0.2nM终浓度的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAiMax混合溶液和siRNA溶液混合并在室温彼此反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。此后，将500μL用于转染的溶液分配入包含肿瘤细胞系和分配的Opti-MEM培养基的每孔并培养6小时，随后去除Opti-MEM培养基。此处，将1ml的RPMI1640培养基分配入每孔并在37℃于5％(v/v)CO2的气氛中培养24小时。实施例5-3：靶基因mRNA的定量分析从实施例5-2中转染的细胞系提取总RNA以制备cDNA，然后通过与实施例4-3相同的方法使用实时PCR相对定量靶基因mRNA的表达水平(图7A至8B)。每种siRNA的有效性可清楚地通过观察靶基因在两种肝癌细胞中的抑制水平确认。已确认包含SEQIDNO.1、10、13、102、197和199的有义链的siRNA即使以显著低的浓度也具有相对高的靶基因表达抑制水平。实施例5-4：IC50的测量从实施例5-3中确认的对应每种基因的高效siRNA选择一种siRNA，且相应siRNA的表现通过确认IC50来进行确认。实施例5-1中培养的Hep3B细胞系在与实施例4-2相同的条件下培养后，将1.5μL的LipofectamineTMRNAiMax(Invitrogen,US)与248.5μL的Opti-MEM培养基彼此混合以制备混合溶液并在室温彼此反应5分钟。随后，将0.8或0.4μL的每种实施例1中制备的SEQIDNO.1、102和201的siRNA(0.01皮摩/μL)或0.2、1或5μL的每种包含SEQIDNO.1、102和201的有义链的siRNA(1皮摩/μL)添加至230μL的Opti-MEM培养基中，由此制备包含8pM、40pM、0.2nM、1nM或5nM终浓度的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAiMax混合溶液和siRNA溶液混合并在室温彼此反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。此外，实施例5-1中培养的1×105Huh-7细胞系使用RPMI-1640培养基在12孔板中于37℃在5％(v/v)CO2的气氛中培养18小时后，去除培养基，然后在每孔分配500μL的Opti-MEM培养基(GIBCO,US)。同时，将1.5μL的LipofectamineTMRNAiMax(Invitrogen,US)和248.5μL的Opti-MEM培养基彼此混合以制备混合溶液，然后在室温彼此反应5分钟。随后，将0.8或0.4μL的每种包含实施例1中制备的SEQIDNO.1、102和201的有义链的siRNA(0.01皮摩/μL)或0.2、1或5μL每种包含SEQIDNO.1、102和201的有义链的siRNA(1皮摩/μL)添加至230μL的Opti-MEM培养基中，由此制备包含8pM、40pM、0.2nM、1nM或5nM的终浓度的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAiMax混合溶液和siRNA溶液混合并在室温彼此反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。此后，将500μL用于转染的溶液分配入包含肿瘤细胞系和分配的Opti-MEM培养基的每孔并培养6小时，随后去除Opti-MEM培养基。此处，将1mlRPMI1640培养基分配入每孔并在37℃于5％(v/v)CO2的气氛中培养24小时。从转染的细胞系提取总RNA以制备cDNA，然后通过与实施例4-3相同的方法使用实时PCR相对定量靶基因mRNA的表达水平(附图9A和9B)。已观察到包含SEQIDNO.1的有义链的siRNA在Hep3B细胞系中的IC50为40-200pM且在Huh-7细胞系中为8-40pM，且包含SEQIDNO.102的有义链的siRNA的IC50在Hep3B和Huh-7细胞系中都为8-40pM。因此，确认了选自本发明的siRNA具有高效。实施例6：用于确认Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的抑制效果的集落形成测定法通过在单细胞上体外实施的集落形成测定法测量转化的方法是半定量方法且源自癌细胞和癌细胞锚定独立表型特征的接触抑制的损失。在癌细胞用相应抗癌药物处理的情况中，使用该分析方法以通过特定的抗癌药在体外确认癌细胞的存活率(ClonogenicAssayofCellsinVitro,Nat.Protoc.1(5):2315-9,2006)。为确认多少由癌细胞形成的集落受到通过实施例5-4中选择的高效Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的抑制，实施了集落形成测定法(CFA)。将实施例5-1中培养的hep3B和Huh-7细胞系分别接种在35mm培养皿(1x104/皿)中。20小时后，将细胞通过与实施例5-4相同的方法以5nM或20nM的浓度转染。每三天替换一次转染的细胞的培养基，且转染10-14天后，用DiffQuik(Sysmex,Japan)染色细胞以比较彼此的集落形成程度(附图10A和10B)。已确认在用SEQIDNO.1和102处理的组中，与用包含SEQIDNO.201的有义链的siRNA处理的对照组相比，集落以显著低的水平浓度依赖性地形成。实施例7：通过组合Gankyrin特异性siRNA和BMI-1特异性siRNA对靶基因表达抑制和细胞生长抑制的确认细胞用实施例5-4中确认的SEQIDNO.1和102的高效siRNA的组合以5或20nM的浓度转染，其为高于IC50的浓度。随后，在两种基因的表达同时抑制的情况中，确认了靶基因表达抑制水平和对细胞生长抑制的协同作用。实施例7-1：合意的siRNA在人肝癌细胞系中的转染在将实施例5-1中培养的1×105Huh-7细胞系在12孔板中使用RPMI-1640培养基在37℃5％(v/v)CO2的气氛中培养18小时后，去除培养基，然后在每孔分配500μL的Opti-MEM培养基(GIBCO,US)。同时，将1.5μL的LipofectamineTMRNAiMax(Invitrogen,US)和248.5μL的Opti-MEM培养基彼此混合以制备混合溶液然后在室温彼此反应5分钟。随后将5μL的每种在实施例1中制备的包含SEQIDNO.1、102和201的有义链的siRNA(1皮摩/μL)添加至230μL的Opti-MEM培养基，由此制备包含5nM的终浓度的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAiMax混合溶液和siRNA溶液混合并在室温彼此反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。此后，将500μL用于转染的溶液分配入包含肿瘤细胞系和分配的Opti-MEM培养基的每孔并培养6小时，随后去除Opti-MEM培养基。此处，将1mlRPMI1640培养基分配于每孔并在37℃于5％(v/v)CO2的气氛中培养24小时。实施例7-2：通过组合Gankyrin特异性siRNA和BMI-1特异性siRNA对靶基因mRNA的量化分析从实施例7-1中转染的细胞系提取总RNA，然后通过与实施例4-3中相同的方法使用实时PCR相对定量靶基因mRNA的表达水平(附图11)。可通过观察靶基因在人肝癌细胞系(Huh-7细胞系)中的表达抑制水平确认靶基因表达受到同时使用的siRNA的抑制。具体地，可观察到即使在同时使用包含SEQIDNO.1和102的有义链的siRNA的情况中，靶基因的表达也同时被抑制。实施例7-3：通过Gankyrin特异性siRNA和BMI-1特异性siRNA的组合确认细胞生长抑制细胞生长抑制通过由Gankyrin特异性siRNA和BMI-1特异性siRNA的组合对靶基因的表达抑制而确认。在实施例4-1中培养的Hep3B细胞系在与实施例4-2相同的条件下培养后，去除培养基，然后在每孔分配500μL的Opti-MEM培养基(GIBCO,US)。同时，将1.5μL的LipofectamineTMRNAiMax(Invitrogen,US)和248.5μL的Opti-MEM培养基彼此混合以制备混合溶液然后在室温彼此反应5分钟。随后将5μL或20μL的每种实施例1中制备的SEQIDNO.1、102和201的siRNA(1皮摩/μL)添加至230μL的Opti-MEM培养基，由此制备包含5nM或20nM的终浓度的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAiMax混合溶液和siRNA溶液混合并在室温彼此反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。此后，将500μL用于转染的溶液分配入包含肿瘤细胞系和分配的Opti-MEM培养基的每孔并培养6小时，随后去除Opti-MEM培养基。此处，将1ml的RPMI1640培养基分配入每孔并在37℃于5％(v/v)CO2的气氛中培养72小时。细胞活力通过将细胞数目与用包含SEQIDNO.201(附图12)的有义链的siRNA处理的实验组进行比较确认。可确认在细胞同时用SEQIDNO.1和102处理的情况中，细胞活力被浓度依赖性地减少，且生长抑制效果比任何一种基因的表达受到抑制时显示的生长抑制效果更加优异。实施例8：在动物模型中确认包含Gankyrin和/或BMI-1特异性siRNA纳米颗粒对靶基因表达的抑制和肝癌生长的抑制为确认所选Gankyrin或BMI-1特异性siRNA在体内的作用，制备了由双链寡RNA分子制成的纳米颗粒并随后注射入小鼠肝癌模型。随后，确认了靶基因表达的抑制和肝癌生长的抑制。实施例8-1：小鼠肝癌模型(正交肝癌模型)的制备将实施例4-1中培养的人肝癌细胞系(Hep3B细胞系，2X106)移植入Balb/c裸小鼠的肝中(肝左叶)以建立肝癌模型。随后，通过测量α-甲胎蛋白(AFP)的水平(血清中的肝癌标志物)确认了肝癌细胞的形成。当血清中的AFP水平变为约1,000ng/ml时，根据AFP水平将五只小鼠分配到各实验组。实施例8-2：由双链寡RNA分子制成的纳米颗粒(SAMiRNA)对靶基因表达的抑制通过实施例3-1的方法使用包含实施例2中合成的SEQIDNO.102和201的siRNA的双链寡RNA分子(SAMiRNALP)制备了均质的纳米颗粒。将包含SEQIDNO.201的siRNA的纳米颗粒(SAMiRNA-CONT)设为对照组，且包含含有SEQIDNO.102的有义链的siRNA的纳米颗粒(SAMiRNA-BMI)设为实验组。将纳米颗粒以5mg/kg体重施用，且将100μL的制备于DPBS中的纳米颗粒使用1ml注射器(0.25mmx8mm,31Gauge,BD328820,USA)两次静脉内注射入实施例8-1中制备的小鼠肝癌模型中。为增加可靠性，实施盲测。最后注射48小时后，分离小鼠的肝癌组织。将从分离的癌症组织提取总RNA以制备cDNA，然后使用实时PCR通过与实施例4-3相同的方法相对定量靶基因mRNA表达水平(附图13)。在一个个体中，表达抑制被延迟，但已确认除该个体外靶基因BMI-1的表达以平均70％的水平受到抑制，且靶基因的表达在一些个体中以最多80％的水平受到抑制(个体编号2、4和5)。因此，已确认由根据本发明的双链寡RNA分子制成的纳米颗粒在体内具有优异的靶基因表达抑制。实施例8-3：确认由双链寡RNA分子制成的纳米颗粒(SAMiRNA)对肝癌生长的抑制通过实施例3-1中的方法使用包含实施例2中合成的含有SEQIDNO.1、102和201的有义链的siRNA的双链寡RNA分子制备均质的纳米颗粒。用作为溶剂的DPBS和包含SEQIDNO.201的纳米颗粒(SAMiRNA-CONT)处理的组分别设为阴性对照组，将用包含含有SEQIDNO.1的有义链的siRNA的纳米颗粒(SAMiRNA-Gank)、包含SEQIDNO.102的siRNA的纳米颗粒(SAMiRNA-BMI)和通过以相同含量混合含有包含SEQIDNO.1的有义链的siRNA的双链寡RNA分子和包含SEQIDNO.102的有义链的siRNA的双链寡RNA分子制备的纳米颗粒(SAMiRNA-Gank+BMI)处理的组分别设为实验组，且将用激酶抑制剂索拉非尼(sorapenib)处理的组设为阳性对照组。制备纳米颗粒从而将其以5mg/kg体重注射，且将100μL的制备于DPBS中的纳米颗粒使用1ml注射器(0.25mmx8mm,31Gauge,BD328820,USA)14次注射入实施例8-1中制备的小鼠肝癌模型中持续2周。为增加可靠性，实施盲测。在阳性对照组中，索拉非尼以30mg/kg体重口服施用14次至实施例8-1中制备的小鼠肝癌模型持续2周。初始注射2、6、10和14天后，癌症的生长水平通过测量血液中的AFP水平确认(附图14)。在注射包含Gankyrin或BMI-1特异性siRNA的纳米颗粒的实验组中，血液中的AFP水平与对照组相比减少约20-30％，且在注射同时包含Gankyrin和BMI-1特异性siRNA的纳米颗粒的实验组中，初始注射10天后AFP水平稍低于阳性对照组且在14天后与阴性对照组相比减少约40％。因此，可确认的是由包含Gankyrin和/或BMI-1特异性siRNA的双链寡RNA分子制成的纳米颗粒具有优异的抗癌效果。当前第1页1 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