本发明属于检测分析领域，具体涉及实时荧光定量PCR检测大鼠印记miRNA-675表达水平的引物。
背景技术：
：印记microRNA(miRNA)是一类与印记基因相互调控的长度为21～23nt内源性单链RNA分子，是近年来在表遗传领域中研究较多的“明星分子”。多研究发现，印记miRNA广泛参与细胞活动的一系列生理及病理活动过程，包括细胞发育、细胞调亡、细胞代谢、肿瘤形成、病毒感染及免疫应答等，印记miRNA更与男性生殖关系密切，对印记miRNA的研究不仅可为揭示男性不育发生机制提供重要依据，而且还可提供有效的预测标记。miR-675是H19基因第一外显子能够产生的一个高度保守的miRNA，H19ncRNA是以miR-675的pri-miRNA发挥功能，并通过印记基因改变影响精子发生。大量研究显示，少、弱精子症男性精子细胞印记基因H19印记控制区域低甲基化，印记miRNA-675表达异常，故其被认为是一个候选的印记miRNA。目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微阵列芯片，聚合酶链式反应(PCR)等。1)Northern印迹分析当前miRNA分析的标准方法，但其操作繁琐耗时长，灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，容易污染，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。2)芯片技术可实现高通量，多组分同时检测，但其检测费用高，芯片上可利用的样品体积很小，灵敏度和选择性较低。3)实时荧光定量PCRSYBRGreen是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，变性DNA双链分开则无荧光，只有和双链DNA结合后才发荧光。SYBRGreen可以用于不同的模板，使用方便，价格相对便宜，灵敏度很高。缺点是可产生非特异性结合，因此在实验中必须做融解曲线，选择良好的引物并优化反应条件。开发简单直接，灵敏度高，特异性强，适用范围广，检测成本低，结果准确可靠的miRNAs分析技术仍然是一个挑战。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测大鼠印记miRNA-675表达水平的引物。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种检测大鼠印记miRNA-675表达水平的引物，序列为5′-GGAAAGGGCCCACAGTAAAAA-3′；进一步地，所述引物的PCR反应的程序为95℃预变性30s；95℃变性3s，60℃退火和延伸30s，进行40次循环。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明在p,p’-DDE暴露大鼠中筛查印记miRNA-675的表达，并针对该序列设计实时荧光定量PCR引物进行快速准确的定量检测。方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强、适用范围广、成本低等优点，可进行高通量检测，是一种简便实用的分析技术。附图说明图1为印记miR-675与其宿主基因H19关系图；图2为p,p’-DDE暴露后精子细胞印记基因H19甲基化水平下调图；图3为引物A的PCR反应的融解曲线图；图4为引物B的PCR反应的融解曲线图；图5为引物C的PCR反应的融解曲线图；图6为引物D的PCR反应的融解曲线图；图7p,p’-DDE对精子细胞microRNA-483表达的影响图；具体实施方式本发明提供了一种引物，用于检测大鼠印记miRNA-675表达水平。检测原理是通过碱基堆积杂交作用，将microRNA引物与miRNAcDNA扩增模板结合，在DNA聚合酶作用下延伸引物引发PCR反应，得到双链DNA，通过实时测定染料SYBRGreenI与双链DNA结合产生的荧光信号，检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，比较循环阈值法(2－△△Ct法)对起始模板进行相对定量分析。其中，所述引物的序列如SEQIDNO.1所示，所述RNA模板扩增序列如SEQIDNO.2所示：SEQIDNO.1：5′-GGAAAGGGCCCACAGTAAAAA-3′；SEQIDNO.2：15-uggugcggaaagggcccacagu-36。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。1、特异性位点分析印记基因H19位于人染色体11P15.5，鼠7号染色体，在进化上具有高度的保守性，第一外显子能够产生miR-675。2、大鼠精子细胞总RNA提取收集6只大鼠精子细胞(3只大鼠为p,p’-DDE暴露组，3只大鼠为对照组)，用RNeasyMiniKit(Qiagen,德国)提取每只大鼠精子细胞总RNA，操作按照试剂盒说明书进行。RNA样品稀释50倍，使用Eppendorf核酸蛋白测定仪测定RNA的纯度，各样本OD260/OD280的比值均在1.85-2.05之间，说明所制备的RNA纯度好，自动换算出RNA的浓度(单位：μg/μl)。3、miRNAcDNA合成以精子细胞总RNA为模板，按照TaKaRa公司miRNAcDNA合成试剂盒说明书(PrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime))，反转录成miRNAcDNA，转录条件为37℃，15分钟；85℃，5秒。试剂使用量5×PrimeScriptRTMasterMix(PerfectRealTime)2μlTotalRNA＊2-->RNaseFreedH2Oupto10μl4、印记microRNA-675引物设计和合成使用miRNAprimer软件设计如表1所示的引物，并由invitrogen公司合成。引物序列如表1所示。表15、PCR反应和溶解曲线验证以miRNAcDNA为模板，利用表1中的PCR引物进行扩增，PCR反应体系如下：试剂使用量终浓度SYBRPremixExTaqII10μl1*PCRPrimer0.8μl0.4μMROXReferenceDyeorDyeII0.4μlRT反应液(cDNA溶液)2μldH20(灭菌蒸馏水)6.8μl每次FQ-PCR结束后都要作融解曲线(95℃、15sec，60℃、15sec，95℃15sec)，如图3-6所示，其中，引物A(GGAAAGGGCCCACAGTAAAAA)融解曲线曲线峰形高且单一，表明扩增的目的片段特异性良好。6、p,p’-DDE暴露大鼠精子细胞miR-675转录水平的差异实时荧光定量PCR反应后，比较循环阈值法(2－△△Ct法)对起始模板进行相对定量分析，可见p,p’-DDE暴露大鼠精子细胞miR-483转录水平具有显著差异(P<0.05)。结果见图7。从图7可以看出，p,p’-DDE暴露大鼠精子细胞miRNA-675在mRNA表达水平明显高于对照。因此，本发明设计的引物可用于对p,p’-DDE暴露大鼠精子细胞miRNA-675表达水平进行定量检测。当前第1页1 2 3