本发明属于生物技术领域，具体涉及以棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记进行鉴定的方法与应用。
背景技术：
杂种优势的利用在提高棉花产量、改进品质、提高抗性等方面发挥着重要作用，并将继续对棉花生产起重要推动作用。目前，杂交棉种子的主要生产方式仍为人工去雄辅助授粉杂交制种法(占90％以上)。而随着国家城镇化发展的需求，棉花主产区及周边地区的劳动力成本正逐年提高，导致杂交种生产成本越来越高，许多从事杂交棉制种的相关种子企业难以为继，从而限制了杂交棉的进一步大规模推广利用。与人工去雄辅助授粉方式相比，“三系法”制种程序简便，成本仅为人工去雄杂交的30-40％，适合大面积制种。因而，三系杂交棉已经成为杂交棉发展的主要方向，因此，三系杂交棉花的大面积推广，对于提高植棉效益，增加棉农收益，稳定杂交棉种植面积等都具有重要意义。但是由于强恢复力的优良恢复系亲本资源的匮乏，三系杂交种(以哈克尼西棉细胞质雄性不育三系材料为主)的审定虽然取得了一定进展，但仍没有实现大面积推广。因此，育种家长期围绕强恢复力的优良恢复系选育和改良开展相关研究。常规育种技术虽然可以实现恢复系改良，但是该方法需要年限长，而且转育后每年都需要通过大量的田间测交和下一代的表型鉴定来确保恢复基因的存在，需要消耗大量的棉田、人力和财力。另一方面，恢复系的纯度对于三系杂交种制种至关重要，一旦混杂，三系杂交种中后代将出现不育株，从而严重影响棉花产量。因此，通过与恢复基因紧密连锁的分子标记筛选，并通过分子标记辅助选择对恢复系进行稳定可靠又快速的选育改良和纯度鉴定成为本专利的关键核心。
与常规育种过程中的表型鉴定相比，分子标记辅助选择育种可以直接从DNA水平反映出核苷酸序列的差异，不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，具有遗传稳定等特点。目前，RFLP、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、CAPS、STS、AFLP、SNP和InDel等各种类型的标记已经开始应用于分子标记的筛选。插入缺失(InDel，insertion-deletion)标记具备共显性、位点特异性、扩增产物稳定和易于检测等优点。与一些已报道的恢复基因相关的SSR和CAPS标记等相比，该技术只需通过简单的琼脂糖凝胶电泳检测，不需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和银染等繁琐且具有污染的技术进行检测，而且也不需要像CAPS标记进行限制性内切酶酶切，从而节约了检测成本。因此，该技术已经在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到广泛应用。
技术实现要素：
本发明的目的是针对常规育种过程中棉花恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长、消耗大、准确性差等问题，提供以棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记进行鉴定的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明通过恢复系和不育系重测序和序列比较，结合前期筛选到的与恢复基因紧密连锁的标记，在恢复系中恢复基因目标区域内鉴定到一段长度为102bp的特异插入片段，“AACTTGTGCCTCTGACAGTAAAAAAAGGCATCTTCAATAGTGCTTTCGAATGCACTCTTGAATGTCTGTTCAAACTTGTGCCTTTCACAGTAAAAAAAGGCT”(SEQIDNo.1)。在此基础上，本发明在插入序列两侧设计了一对InDel标记引物对：
正向引物5'-AAAATGTCATCTTCAATAGTGCTT-3'(SEQIDNo.2)
反向引物5'-ATTTTACGGTATCTTTTGAAACCA-3'(SEQIDNo.3)
利用SEQIDNo.2和3所示的引物，在不含恢复基因位点的材料中扩增出267bp的单一条带；在恢复基因位点纯合的材料中扩增出369bp的单一条带；在恢复基因位点杂合的材料中则同时扩增出267bp和369bp的两个条带。
本发明提供一种棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记，其为长度102bp的特异插入片段，核苷酸序列为：
AACTTGTGCCTCTGACAGTAAAAAAAGGCATCTTCAATAGTGCTTTCGAATGCACTCTTGAATGTCTGTTCAAACTTGTGCCTTTCACAGTAAAAAAAGGCT，如SEQIDNo.1所示。
所述InDel标记的插入位点在陆地棉染色体ChrD05：54091891(参考南京农业大学的陆地棉测序结果)。
本发明提供利用所述棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记的分子鉴定方法，具体步骤如下：
利用特异性引物对进行PCR反应，扩增待测棉花材料的DNA，根据扩增结果判断进行判断，标准如下：
扩增出267bp单一条带的棉花材料不含恢复基因位点；
扩增出369bp单一条带的棉花材料的恢复基因位点纯合；
同时扩增出267bp和369bp两个条带的棉花材料的恢复基因位点杂合；
所述特异性引物对的核苷酸序列为：
正向引物5'-AAAATGTCATCTTCAATAGTGCTT-3'，如SEQIDNo.2所示；
反向引物5'-ATTTTACGGTATCTTTTGAAACCA-3'，如SEQIDNo.3所示。
其中，所述PCR反应的反应体系如下：
其中，所述PCR反应的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，30个循环；4℃保存。
本发明还提供用于所述分子鉴定方法的特异性引物对，其为：
正向引物5'-AAAATGTCATCTTCAATAGTGCTT-3'，如SEQIDNo.2所示；
反向引物5'-ATTTTACGGTATCTTTTGAAACCA-3'，如SEQIDNo.3所示。
本发明的还一个目的在于提供所述棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记、利用该标记进行的分子鉴定方法或其所用特异性引物对在棉花细胞质雄性不育恢复系选育中的应用。其为在棉花细胞质雄性不育恢复系选育过程中，以所述棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记、利用该标记进行的分子鉴定方法或其所用特异性引物对判断棉花株系的恢复性，选择含恢复基因位点或恢复基因位点纯合的株系进行进一步选育。
本发明的另一个目的在于提供所述棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记、利用该标记进行的分子鉴定方法或其所用特异性引物对在棉花细胞质雄性不育恢复系纯度鉴定中的应用。其为以所述棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记、利用该标记进行的分子鉴定方法或其所用特异性引物对对恢复系的多个样本的恢复系基因位点进行判断，统计样本中的恢复系纯度。
本发明采用InDel标记对棉花细胞质雄性不育恢复系材料进行了分子水平多态性检测，从本研究的结果中可以看出，该标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠、易于检测，因此该方法适用于棉花细胞质雄性不育恢复系材料纯度室内鉴定和分子标记辅助选育改良。
本发明与现有技术相比，有益效果为：
1)速度快：常规育种程序恢复系的选育过程涉及大量的测交等试验，同时需要结合大量的表型性状调查，以此来判断恢复基因存在与否及位点是否纯合等，因此，需要投入大量的时间、人力和物力。而该发明只需提供棉花材料的种子或叶片，提取DNA后，用InDel标记很容易通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，很快地鉴定出恢复系种子的真实性，而且利用该发明可以在恢复系分子标记辅助选育改良过程中，对恢复基因进行有效的跟踪，并通过共显性带型能很快鉴定恢复基因位点是否纯合，从而极大加快恢复系选育改良过程。
2)准确率高：常规育种手段的表型鉴定过程易受环境因素等影响，因此，不能完全准确、真实地反映恢复系的遗传情况。InDel标记则具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，而且分子鉴定不受环境因素的影响，本发明利用一对InDel引物对恢复系进行鉴定，真正从DNA水平上鉴定恢复系的遗传情况，提高了准确性。
3)成本低：与SSR等需要通过PAGE胶和银染等技术检测的方法不同，该发明仅需要通过琼脂糖凝胶电泳检测；而且不需要限制性内切酶酶切等过程，因此大大降低了相应的成本。
4)操作简单：本发明涉及的DNA提取、PCR配制和琼脂糖凝胶电泳检测等是机械式的加样过程，易于操作，具有很好的商业化应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中棉花细胞质雄性不育恢复系和其它材料InDel标记分析电泳照片。其中，M：marker，1-5分别为恢复系中恢46，恢复系中恢80，三系杂交棉品种中棉所83、常规棉品种中棉所45和中棉所69。
图2为本发明实施例2中恢复系种子纯度鉴定电泳照片。
图3为本发明实施例3自交群体中48个单株纯度鉴定电泳照片。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法
1.DNA提取
参照成熟的棉花CTAB提取DNA技术，恢复系中恢46(CGMCC5166，已在申请号201210092777.6的专利中公开)和中恢80(CGMCC5167，已在申请号201210092777.6的专利中公开)、三系杂交种中棉所83和常规棉品种中棉所45和中棉所69共5个材料的种子剥去外壳，每粒种子单独磨碎后转入2ml离心管；加入1000μlDNA提取液(0.05MTris-Cl，0.01MEDTA，2％SDS，1％PVP，0.5％山梨醇，0.705MNaCl，PH＝8.0，高压灭菌；使用前加入1％β-巯基乙醇)，漩涡混匀后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇离心管；水浴结束后，加入800μl苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀至不分层(动作轻缓，时间充分)，12000rpm离心10min；吸取上清液(约800μl)转移到另一灭菌的2ml离心管中，加入2μlRNase酶(10mg/ml)，混匀后37℃水浴30min；取出后加入1000μl的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀至不分层，12000rpm离心10min；用剪口枪头吸取上清液(约700μl)转移到另一灭菌的2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出；用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70％乙醇的2ml硅化离心管中，浸泡两次，每次十分钟，无水乙醇浸泡过夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后(约30min)，加入200μlddH2O，室温溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。
2InDel标记
InDel：将上述DNA样品1μl与19μlPCR反应液(10×PCRBuffer(含MgCL2)2.0μl，5mMdNTPs0.2μl，10mMInDel引物对各1μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，ddH2O14.6μl)混合，进行PCR反应：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，30个循环；4℃保存。扩增结束后，吸取10μl扩增产物加样至2～3％琼脂糖凝胶(制胶时添加浓度为十万分之四的GelRedTM，Biotium公司)，在1×TAE的电泳缓冲液中电泳检测。电泳结束后凝胶成像系统中观察。结果如图1所示。其中两个恢复系材料仅在以marker为标准的369bp处能检测到InDel引物对的扩增的单一条带；恢复基因位点杂合的三系杂交种中棉所83在以marker为标准的369bp和267bp位置处均能检测到扩增的条带；不含恢复基因的两个常规棉品种仅在以marker为标准的267bp位置处能检测单一条带。
实施例2恢复系种子纯度鉴定
恢复系种子DNA提取程序参照实施例1。提取DNA后，利用InDel标记对恢复系中恢46的48粒种子纯度进行鉴定。参照实施例1的PCR扩增反应和程序，利用InDel引物对(SEQIDNo.2和3)在48份种子DNA中进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测发现所有恢复系的种子仅能在以marker为标准的369bp处检测到单一扩增片段(图2)，说明待测恢复系中恢46的纯度达到100％。
实施例3恢复系分子标记辅助选育改良
以恢复系中恢46为父本与具有综合农艺性状优良的亲本材料P5(中棉所52母本)杂交，然后以P5作为回交亲本通过多代回交，进行目标性状的改良(P5×中恢46)×P5，最终自交获得恢复基因位点纯合、综合性状改良的恢复系。在这一过程中，为确保恢复基因的存在，利用InDel标记(SEQIDNo.2和3)对中恢46转育群体材料回交一代开始进行分子标记跟踪。从回交群体中选择以InDel引物对扩增具有共显性条带特征(即在以marker为标准的369和267bp位置均能检测到扩增片段)的单株继续作为下一代回交亲本。参照这一标准，回交4代以上，然后选择目标单株进行自交，自交后代继续利用InDel标记进行检测。图3为自交群体中48个单株检测的结果，发现共得到3种不同带型的单株。其中恢复基因位点纯合单株仅能在以marker为标准的369bp处检测到单一扩增片段；恢复基因位点杂合单株在以marker为标准的369bp和267bp处均能检测到扩增片段；不含恢复基因的单株仅能在以marker为标准的267bp处检测到单一扩增片段。
为了验证分子标记辅助选择的可靠性，在自交群体中根据分子标记分别选取了10株恢复基因纯合单株、5个恢复基因杂合单株和5个不含恢复基因的单株与不育系进行了测交，其中恢复基因纯合单株测交后代285株中，仅有1株不育株(其产生原因可能是棉花为常异花授粉植物，因此，在测交过程中可能发生不含恢复基因的花粉窜粉等现象)；恢复基因杂合单株测交后代153株中，有81株可育株，72株不育株，符合预期的1:1分离比例；而在不含恢复基因单株测交后代152株中，全部为不育单株。上述结果表明，利用分子标记辅助选择改良的方法可以实现恢复系快速选育改良的目的，且结果准确可靠。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。