专利名称：一种抗人b细胞淋巴瘤的单链双特异性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的基因工程抗体，特别是涉及靶向杀伤B淋巴瘤细胞的单链双特异性抗体。
背景技术：
单链双特异性抗体(single chain bispecific antibody，ScBsAb)为一种非天然的基因工程抗体形式，其两个通过连接肽相连的抗原结合部位具有不同的特异性。因此，ScBsAb在化学结构上虽然是双价的，但就其结合抗原的功能而言却是单价的。将肿瘤相关抗原的特异抗体与肿瘤杀伤细胞的表面触发分子的特异抗体通过连接肽构成的ScBsAb，可高效地将体内的免疫效应细胞募集在肿瘤细胞周围，激活免疫效应细胞特异地杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
CD20是一种非糖基化的III型跨膜蛋白，具高度的保守性。CD20仅在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞及激活的B淋巴细胞中表达，而在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其它组织中均无表达。超过95％的B细胞淋巴瘤表达CD20，且没有明显的CD20内吞或脱落现象，这些特征使得CD20成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶抗原。美国FDA批准用于治疗B细胞淋巴瘤的Retuximab(1997年12月)和Ibritumomal(2002年2月)即分别为针对CD20的人-鼠嵌合IgG1型抗体和同位素标记的鼠源性IgG1型单克隆抗体。
效应细胞毒性T细胞是人体免疫防护系统中最有力的“杀手”。T细胞的主要功能是识别并迅速地破坏那些已经被病毒感染或遭受恶性转化的细胞或组织。T细胞的激活是其发挥细胞杀伤作用的根本前提。T细胞的激活不是简单的一步反应，而是受一系列的细胞表面蛋白的控制，以此来保证T细胞只作用于特定的靶标。这些表面蛋白包括一个能特异地识别靶细胞表面抗原与MHC I类分子复合物的T细胞受体、CD3信号复合物、共刺激分子和粘附分子。在它们的作用下，T细胞和靶细胞之间形成一个免疫连接，静态的T细胞被激活，从而发挥杀伤靶细胞的效应。此外，肿瘤细胞还可能通过“免疫逃避”策略来对付T细胞的杀伤作用，如降低肿瘤细胞表面MHC I类分子的表达，使之不能与表面抗原形成复合物，进而不能被T细胞受体所识别。T细胞激活过程的复杂调控和肿瘤细胞的免疫逃避机制大大限制了T细胞杀伤肿瘤细胞潜能的充分发挥。
BiTEs(bispecific T cell engagers)是以T细胞为效应细胞的单链双特异性抗体。BiTEs和其它双特异性抗体最大的不同点在于它的结构，它采用单链抗体技术将两个不同抗体的抗原结合部位通过连接肽连接在一起，其基本的形式为VL1-linker-VH1-linker-VH2-linker-VL2。这种结构赋予BiTEs的两个结合臂之间具有更好的柔韧性，可同时和T细胞及靶细胞表面的抗原分子结合，在T细胞和靶细胞之间形成有效激活T细胞的毒性连接，介导靶细胞的裂解。
BiTEs作为一种基因工程单链双特异性抗体，在充分挖掘了人体内丰富的细胞毒性T细胞的肿瘤杀伤效应的同时，克服了全抗体分子量大、穿透能力低的缺陷，在肿瘤的生物治疗中有良好的临床应用前景。
抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体即是一种BiTEs形式的单链双特异性抗体，它可以和T细胞、B淋巴瘤细胞表面的特异性抗原分子CD3、CD20发生特异性结合，为T细胞和B淋巴瘤细胞之间提供一个物理连接，有效地激活静止的T细胞杀伤肿瘤细胞，起到治疗B细胞淋巴瘤的作用。
目前，有关于BiTEs形式的单链双特异性抗体国内外均有报道。其中，德国Micromet公司研制的针对B细胞表面CD19抗原的BiTEs(MT103)已获准进入用于治疗非何杰金氏B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病的临床试验研究。针对CD20抗原的BiTEs，即抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体国内外均未见报道。
发明内容
本发明提供了一种以CD20为靶标的、具有靶向杀伤B细胞淋巴瘤功能的单链双特异性抗体(抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体)。
本发明包括以下主要内容本发明的抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体由抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体和抗人CD3单链抗体构成，具体地说是通过3个链间连接肽将抗人B细胞淋巴瘤CD20抗体的轻链可变区(VLCD20)和重链可变区(VHCD20)以及抗人CD3抗体的轻链可变区(VLCD3)和重链可变区(VHCD3)连接而成。它能有效激活静止的T淋巴细胞发挥特异杀伤人B细胞淋巴瘤的作用。
本发明的抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体采用(Gly4Ser)3为连接肽，其连接形式为VLCD3-(Gly4Ser)3-VHCD3-(Gly4Ser)3-VHCD20-(Gly4Ser)3-VLCD20。
本发明的抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体中，抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体具有如序列表SEQ ID No.1所示的重链可变区氨基酸序列。
本发明的抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体中，抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体具有如序列表SEQ ID No.2所示的轻链可变区氨基酸序列，本发明的抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体中，抗人CD3单链抗体具有如序列表SEQ ID No.3所示的重链可变区氨基酸序列，本发明的抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体中，抗人CD3单链抗体具有如序列表SEQ ID No.4所示的轻链可变区氨基酸序列，本发明与现有针对CD20抗原的其他形式的抗体相比有以下优点①抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体中的两个抗原结合臂之间具有更好的柔韧性，这种柔韧性有利于促进CD3复合体和肿瘤靶标的连接以及最后在T细胞和靶细胞之间形成毒性连接，从而有效地激活静止的T细胞杀伤肿瘤细胞。②抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体分子量较小、对肿瘤组织的穿透能力较强。③CD3/抗CD20单链双特异性抗体的结构较简单，便于采用生物工程技术手段所进行大量制备。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为表达质粒pcDNA5/FRT-amiCD3/antiCD20的物理图。
图2为采用活细胞间接免疫荧光检测法在荧光显微镜下观察到的Ramous细胞(2A)和Jurkat细胞(2B)。
图3为抗CD3/抗CD20单双特异性链抗体介导下，由Jurkat细胞和Ramous细胞形成的玫瑰花环。
图4为抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体介导下的人外周血淋巴细胞对人B淋巴瘤细胞的杀伤效应。
具体实施例方式
实施例1一.抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体核苷酸序列的设计和合成根据VLCD3、VHCD3、VLCD20、VHCD20的氨基酸序列和VLCD3-(Gly4Ser)3-VHCD3-(Gly4Ser)3-VHCD20-(Gly4Ser)3-VLCD20的连接形式，参照哺乳动物细胞常用密码子确定抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体的核苷酸序列。为了便于蛋白的纯化，在序列的3’端引入组氨酸标签、NotI酶切位点，并在组氨酸标签前加入凝血酶酶切位点，以便在最终除去组氨酸标签；在序列的5’端加上Nhe I酶切位点、KOZAK序列和前导序列。
设计合成多个约60bp的寡核苷酸片段，每相邻的两个片段有约20bp的碱基互补，通过重叠延伸PCR(SOE PCR)得到了全长为1640bp的抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体全基因序列。扩增全基因所用引物为上游引物5’-CTAGCTAGCG CCGCCAGCC-3’。下游引物5’-GTTTTCCTTT TGCGGCCGCC TA-3’。
抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体全基因序列示意图如下-----KOZAK序列-前导序列-VLCD3-(G4S)3-VHCD3-(G4S)3-VHCD20-(G4S)3-VLCD20-凝血酶切位点-(His)6-----。
二.抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体表达载体的构建将抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体的全基因用Nhe I和Not I双酶切后，用T4连接酶将其连接到经Nhe I和Not I酶切处理的真核定点表达载体pcDNA5/FRT(购自美国Invitrogen公司)中，获得抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体的表达载体pcDNA5/FRT-antiCD3/antiCD20(图1)。用pcDNA5/FRT-antiCD3/antiCD20转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆经菌落进行酶切鉴定和测序分析。
三.抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体在CHO细胞中的表达采用脂质体法将测序正确的pcDNA5/FRT-antiCD3/antiCD20表达质粒与表达重组酶Flp的pOG44质粒(购自美国Invitrogen公司)共转染Flp-InTMCHO转染细胞(购自美国Invitrogen公司)，并用浓度为500μg/ml的Hgromycm B(购自美国Invitrogen公司)筛选阳性克隆。采用直接竞争ELISA检测抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体的表达。
四.抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体的纯化在转瓶和搅拌瓶中用无血清培养基放大培养筛选到的阳性克隆细胞，收集细胞培养上清液，加入终浓度为5mM的咪唑及1mM的CaCl2，以1ml/min的流速通过Ni-NTA层析柱(GE Helthcare公司)，先用含0.5M NaCl的PBS洗脱杂蛋白，再用咪唑浓度分别为20mM至500mM的PBS对目的蛋白进行连续梯度洗脱。
实施例2.抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体的生物活性鉴定一.抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体的抗原结合活性将一定浓度的纯化抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体分别与1×106Ramous细胞或Jurkat细胞(均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)4℃共同孵育1h，3000r/min 4℃离心3min，PBS洗3次。加入50μl 1∶500稀释的Anti-His(C-term)-FITC抗体(购自美国Invitrogen公司)，4℃避光作用1h，3000r/min 4℃离心3min，PBS洗4次，荧光显微镜下观察并照相。在荧光显微镜下，Ramous细胞和Jurkat细胞均显现明显的绿色荧光(图2)，且主要分布在细胞膜周围，表明抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体具有特异结合CD3或CD20抗原的能力。
将一定浓度的纯化抗体与1×106Ramous细胞混合，4℃孵育4h后，500r/min离心3min，弃上清，PBS洗细胞3次。加入1×107Jurkat细胞，混匀，4℃孵育4h后，可在光学显微镜下观察到玫瑰花环的形成(图3)。表明抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体具有同时结合CD3和CD20抗原的双特异性，可有效介导Jurkat细胞和Ramous细胞的结合。
二.抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体对人淋巴细胞瘤细胞的杀伤活性将人B细胞淋巴瘤Ramous细胞(靶细胞)接种于96孔细胞培养板，每孔100μl(约1×104个细胞)，先按每孔1μg/ml的作用浓度加入纯化的抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体，再按不同的效靶比加入新鲜分离的人外周血淋巴细胞(效应细胞)，37℃、5％CO2培养24h，每孔加入25μl MTT，37℃、5％CO2培养4h后倒掉孔内液体，每孔加入100μl酸性SDS(0.1N HCl、1％SDS)，37℃、5％CO2孵育4h用酶标仪测OD570值。按如下公式计算肿瘤细胞杀伤率肿瘤细胞杀伤率(％)＝(ODE+T-ODE)/(1-ODT)×100％在抗体浓度为1μg/ml的作用条件下，抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体对人B细胞淋巴瘤Ramous细胞的杀伤活性随效靶比的升高而增加。当效靶比为10∶1时，抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体对人B细胞淋巴瘤Ramous细胞的杀伤率高达87.3％(图4)。实验结果表明抗CD3/抗CD20单链双特异性抗体能高效地介导人外周血淋巴细胞杀伤人B细胞淋巴瘤细胞。
本发明的特定实施例已经对本发明的内容做了详尽的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干部件的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>一种抗人B细胞淋巴瘤的单链双特异性抗体<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>121<212>PRT<213>人属，人种(Homo sapiens，human)<400>1Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala115 120<210>2<211>121<212>PRT<213>人属，人种(Homo sapiens，human)<400>2Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile20 25 30His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Tyr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210>3<211>120<212>PRT<213>人属，人种(Homo sapiens，human)<400>3Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>106<212>PRT<213>人属，人种(Homo sapiens，human)
<400>4Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 10权利要求
1.一种抗人B细胞淋巴瘤的单链双特异性抗体，其特征在于它是由抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体和抗人CD3单链抗体连接而成的。
2.根据权利要求1所述的单链双特异性抗体，其特征在于单链抗体可变区的连接肽为(Gly4Ser)3。
3.根据权利要求1所述的单链双特异性抗体，其特征在于单链抗体可变区的连接形式为VLCD3-(Gly4Ser)3-VHCD3-(Gly4Ser)3-VHCD20-(Gly4Ser)3-VLCD20。
4.根据权利要求1至3中任何一项所述的单链双特异性抗体，其特征在于抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体具有序列表SEQ ID No.1所示的重链可变区氨基酸序列。
5.根据权利要求1至3中任何一项所述的单链双特异性抗体，其特征在于抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体具有序列表SEQ ID No.2所示的轻链可变区氨基酸序列。
6.根据权利要求1至3中任何一项所述的单链双特异性抗体，其特征在于抗人CD3单链抗体具有序列表SEQ ID No.3所示的重链可变区氨基酸序列。
7.根据权利要求1至3中任何一项所述的单链双特异性抗体，抗人CD3单链抗体具有序列表SEQ ID No.4所示的轻链可变区氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种抗人B细胞淋巴瘤的单链双特异性抗体。用3个链间连接肽(Gly
文档编号C07K16/00GK1683409SQ20051005123
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月2日 优先权日2005年3月2日
发明者陈昭烈, 于蕊, 李世崇, 吴本传, 刘红, 叶玲玲, 刘兴茂, 王启伟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所