本发明涉及生物技术，具体涉及一种改进的细胞化学融合方法。
背景技术：
1975年，德国科学家Kohler和英国科学家Milstein将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成的杂交细胞即可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了具有划时代意义的PEG(聚乙二醇polyethyleneglycol)化学融合法杂交瘤技术。聚乙二醇分子可在质膜之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融合(王克明.细胞融合技术及其发展[J].浙江科技学院学报，2004，16(2)：113—116)，即传统的“一步法”(过程如说明书附图1所述)。目前，PEG化学融合法由于其融合成本低，无需特殊设备，简便、融合效率高，因此在1975年获得成功后很快取代了仙台病毒法。但是PEG对细胞有毒害作用，虽然，随着PEG分子量的增加，其融合效率提高，但是其对细胞的毒害作用也随之增加，如要应用，亟待改进细胞化学融合方法。但是考虑到融合前的细胞对PEG的毒性抵抗力较强，而后期刚刚形成的杂交瘤细胞对PEG的毒性抵抗力较弱，因此可采用前期使用高分子量的PEG以促使细胞相互粘连，后期改用低分子量PEG促使细胞之间继续完成融合，这样能有效提高细胞的融合率。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种简便、高效的细胞化学融合方法。
本发明基于考虑到融合前的细胞对PEG的毒性抵抗力较强，而后期刚刚形成的杂交瘤细胞对PEG的毒性抵抗力较弱，因此，前期使用高分子量的PEG以促使细胞相互粘连，后期改用低分子量PEG促使细胞之间继续完成融合，这样就能有效提高细胞的融合率。
本发明提供了一种改进的细胞化学融合方法，包括以下步骤：
(1)将A细胞与B细胞两株细胞混合置于细胞融合管，向融合管内的细胞团滴加0.5ml50％PEG3000～4000溶液，20秒内完成，边加边晃动细胞团，以使细胞团充分接触融合剂PEG溶液；
(2)接着滴加0.5ml50％PEG1500～2500溶液，40秒内完成，边加边晃动融合管，以使细胞团充分接触融合剂PEG溶液；
(3)细胞团于融合管内静置30s至1min终止融合。
本发明的细胞化学融合方法，所述细胞选自A与B两株细胞之间任意组合的融合。所述A细胞和B细胞以2:1-10:1的比列组合。
所述A细胞选自Balb/C小鼠B淋巴细胞或昆明小鼠T淋巴细胞；B细胞选自SP2/0骨髓瘤细胞、NS-1骨髓瘤细胞或X63Ag8.653骨髓瘤细胞。
本发明的细胞化学融合方法，所述步骤(1)PEG3000～4000溶液的pH8.0～8.2，含5％DMSO。所述步骤(2)PEG1500～2500溶液的pH8.0～8.2，含10％DMSO。
本发明的细胞化学融合方法，所述步骤(3)向融合管内加入20～30ml无血清DMEM培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)或RPMI1640培养基(RoswellParkMemorialInstitute)溶液来稀释PEG以达到终止细胞融合作用。
本发明的细胞化学融合方法，整个融合过程均在37℃水浴中进行。
本发明的细胞化学融合方法适用于本发明涉及的技术领域，同种属的或者具有相近亲缘关系的两株细胞。
本发明的细胞化学融合方法选自A细胞与B细胞两株细胞之间任意组合的融合。所述A细胞和B细胞以2:1至10:1的任意比列组合。
本发明所述细胞化学融合方法的A细胞选自Balb/C小鼠B淋巴细胞或昆明小鼠T淋巴细胞；B细胞选自SP2/0骨髓瘤细胞、NS-1骨髓瘤细胞、SP2/0骨髓瘤细胞、X63Ag8.653骨髓瘤细胞。
本发明的效果：
本发明与传统的“一步法”细胞融合方法相比较，能够显著地提高细胞融合率和阳性率。本发明的细胞融合方法融合率能达到60％以上(传统的“一步法”细胞融合率＜50％(李纹.细胞融合实验方法的改进[J].汕头大学医学院学报，2005，18(3)：183—184)，阳性率大于30％(传统的“一步法”细胞融合阳性率＜30％(赵咏梅，郭云婷，马蕊，郭碧莹，邵莎莎.PEG介导细胞融合的最适条件探究[J].西安文理学院学报：自然科学版,2007,10(3))。
本发明所述的细胞融合方法，可用于制备单克隆抗体或者细胞因子等生物大分子，有较大的应用价值。
附图说明
图1PEG介导A、B两细胞融合过程。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1SP2/0骨髓瘤细胞和Balb/C小鼠B淋巴细胞之间的融合
取复苏后生长至少一周的对数期状态良好(圆润、饱满、有光泽)的SP2/0骨髓瘤细胞(细胞活力大于90％，0.4％台盼蓝染液计数)2×107个与1×108个Balb/C小鼠B淋巴细胞于50ml细胞融合管内，然后1000rpm离心5min，弃去上清，用食指轻轻弹击离心管底部，使沉淀细胞团松散，然后用刻度吸管向融合管内的松散细胞团逐滴滴加0.5ml50％PEG4000(pH8.0，含5％DMSO)，20秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团，以使细胞团充分接触融合剂PEG。接着逐滴滴加0.5ml50％PEG1500(pH8.0，含10％DMSO)40秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团。最后细胞团于融合管内静置30s。接着终止融合：用20mlDMEM终止融合作用，整个融合过程均在37℃水浴中进行。融合后第三天，用5％Giemsa液染色5min.每张涂片随机选取3个视野分别置于40倍OlympsCKX31型显微镜物镜中，计数融合细胞数和细胞总数，求平均值，计算融合率(赵咏梅，郭云婷，马蕊，郭碧莹，邵莎莎.PEG介导细胞融合的最适条件探究[J].西安文理学院学报：自然科学版,2007,10(3))。第十天左右开始用间接ELISA法检测96孔板上清抗体阳性G.C.霍华德，M.R.凯瑟.抗体制备与使用实验指南[M].上海：科学出版社。结果细胞融合率达62％，阳性率为33％。
实施例2NS-1骨髓瘤细胞和Balb/C小鼠B淋巴细胞之间的融合
取复苏后生长至少一周的对数期状态良好(圆润、饱满、有光泽)的NS-1骨髓瘤细胞(细胞活力大于95％，0.4％台盼蓝染液计数)5×107个与1×108个Balb/C小鼠B淋巴细胞于50ml细胞融合管内，然后1000rpm离心5min，弃去上清，用食指轻轻弹击离心管底部，使沉淀细胞团松散，然后用刻度吸管向融合管内的松散细胞团逐滴滴加0.5ml50％PEG3000(pH8.2，含5％DMSO)，20秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团，以使细胞团充分接触融合剂PEG。接着逐滴滴加0.5ml50％PEG1500(pH8.2，含10％DMSO)40秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团。最后细胞团于融合管内静置40s。接着终止融合：用25mlRPMI1640终止融合作用，整个融合过程均在37℃水浴中进行。融合后第三天，用5％Giemsa液染色5min.每张涂片随机选取3个视野分别置于40倍OlympsCKX31型显微镜物镜中，计数融合细胞数和细胞总数，求平均值，计算融合率(赵咏梅，郭云婷，马蕊，郭碧莹，邵莎莎.PEG介导细胞融合的最适条件探究[J].西安文理学院学报：自然科学版,2007,10(3))。第十天左右开始用间接ELISA法检测96孔板上清抗体阳性G.C.霍华德，M.R.凯瑟.抗体制备与使用实验指南[M].上海：科学出版社。结果细胞融合率达65％，阳性率为35％。
实施例3NS-1骨髓瘤细胞和昆明小鼠T淋巴细胞之间的融合
取复苏后生长至少一周的对数期状态良好(圆润、饱满、有光泽)的NS-1骨髓瘤细胞(细胞活力大于95％，0.4％台盼蓝染液计数)6×107个与1×108个昆明小鼠T淋巴细胞于50ml细胞融合管内，然后1000rpm离心5min，弃去上清，用食指轻轻弹击离心管底部，使沉淀细胞团松散，然后用刻度吸管向融合管内的松散细胞团逐滴滴加0.5ml50％PEG4000(pH8.0，含5％DMSO)，20秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团，以使细胞团充分接触融合剂PEG。接着逐滴滴加0.5ml50％PEG1500(pH8.0，含10％DMSO)40秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团。最后细胞团于融合管内静置45s。接着终止融合：用30mlDMEM终止融合作用，整个融合过程均在37℃水浴中进行。融合后第三天，用5％Giemsa液染色5min.每张涂片随机选取3个视野分别置于40倍OlympsCKX31型显微镜物镜中，计数融合细胞数和细胞总数，求平均值，计算融合率(赵咏梅，郭云婷，马蕊，郭碧莹，邵莎莎.PEG介导细胞融合的最适条件探究[J].西安文理学院学报：自然科学版,2007,10(3))。第十天左右开始用间接ELISA法检测96孔板上清抗体阳性G.C.霍华德，M.R.凯瑟.抗体制备与使用实验指南[M].上海：科学出版社。结果细胞融合率达71％，阳性率为37％。
实施例4X63Ag8.653骨髓瘤细胞和昆明小鼠B淋巴细胞之间的融合
取复苏后生长至少一周的对数期状态良好(圆润、饱满、有光泽)的X63Ag8.653骨髓瘤细胞(细胞活力大于95％，0.4％台盼蓝染液计数)4×107个与1×108个昆明小鼠B淋巴细胞于50ml细胞融合管内，然后1000rpm离心5min，弃去上清，用食指轻轻弹击离心管底部，使沉淀细胞团松散，然后用刻度吸管向融合管内的松散细胞团逐滴滴加0.5ml50％PEG3000(pH8.2，含5％DMSO)，20秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团，以使细胞团充分接触融合剂PEG。接着逐滴滴加0.5ml50％PEG1500(pH8.2，含10％DMSO)40秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团。最后细胞团于融合管内静置35s。接着终止融合：用28mlRPMI1640终止融合作用，整个融合过程均在37℃水浴中进行。融合后第三天，用5％Giemsa液染色5min.每张涂片随机选取3个视野分别置于40倍OlympsCKX31型显微镜物镜中，计数融合细胞数和细胞总数，求平均值，计算融合率(赵咏梅，郭云婷，马蕊，郭碧莹，邵莎莎.PEG介导细胞融合的最适条件探究[J].西安文理学院学报：自然科学版,2007,10(3))。第十天左右开始用间接ELISA法检测96孔板上清抗体阳性G.C.霍华德，M.R.凯瑟.抗体制备与使用实验指南[M].上海：科学出版社。结果细胞融合率达80％，阳性率为41％。
实施例5X63Ag8.653骨髓瘤细胞和Balb/C小鼠B淋巴细胞之间的融合
取复苏后生长至少一周的对数期状态良好(圆润、饱满、有光泽)的X63Ag8.653骨髓瘤细胞(细胞活力大于95％，0.4％台盼蓝染液计数)3×107个与1×108个Balb/C小鼠B淋巴细胞于50ml细胞融合管内，然后1000rpm离心5min，弃去上清，用食指轻轻弹击离心管底部，使沉淀细胞团松散，然后用刻度吸管向融合管内的松散细胞团逐滴滴加0.5ml50％PEG4000(pH8.0，含5％DMSO)，20秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团，以使细胞团充分接触融合剂PEG。接着逐滴滴加0.5ml50％PEG1500(pH8.0，含10％DMSO)40秒内完成，边滴加边晃动融合管或者用吸管轻轻搅动细胞团。最后细胞团于融合管内静置50s。接着终止融合：用30mlDMEM终止融合作用，整个融合过程均在37℃水浴中进行。融合后第三天，用5％Giemsa液染色5min.每张涂片随机选取3个视野分别置于40倍OlympsCKX31型显微镜物镜中，计数融合细胞数和细胞总数，求平均值，计算融合率(赵咏梅，郭云婷，马蕊，郭碧莹，邵莎莎.PEG介导细胞融合的最适条件探究[J].西安文理学院学报：自然科学版,2007,10(3))。第十天左右开始用间接ELISA法检测96孔板上清抗体阳性G.C.霍华德，M.R.凯瑟.抗体制备与使用实验指南[M].上海：科学出版社。结果细胞融合率达74％，阳性率为36％。