一种作物种子不表达启动子SAFES5及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种作物种子不表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在种子以外部位特异表达，避免异源蛋白在种子中的表达和积累，降低转基因作物的生物安全风险。

背景技术：

基因工程可以从本质上改变生物体的构造，这是科学史上的重大进步，同样也可能会给人类社会带来某种程度的隐患。从微观的角度来看，启动子的导入也可能给转基因植物带来安全隐患。比如，启动子插入到原来整合到植物基因组中的隐性病毒基因旁，可能会重新活化病毒；启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成；当转基因植物被动物或人类食用时，启动子可能会通过基因的水平插入到某一致癌基因上游，活化并导致癌症的发生。在宏观的食品安全问题上，人们关注的焦点是转基因及其产物在食用时是否有毒性或者会引起过敏反应；其次，当转基因产品所携带的选择标记基因是编码某些应用于临床或肠道抗生素的抗性物时，它们是否可能被转移到微生物中，从而增强病原微生物的抗药性，引起抗生素失效(Ebinuma等，2001；Hohn等，2001)。

尽管转基因作物的确存在潜在的食品安全和环境安全等问题，但绝不能成为阻碍其发展的理由，而应该发现问题和努力解决问题。因此，利用启动子策略，使外源基因只在非食用部分表达，保证食用部分不含有外源基因表达的产物，即开发和研究非胚乳表达启动子，如shi等发现的在韧皮部特异性表达的启动子RSs1；美国农业部研究局Roger Thilmony领导的作物改良与利用研究小组近日发现一种组织特异性启动子LP2，其属于光合作用组织中的受体基因，在转基因水稻的叶中高度活跃，在种子和花中未被检测到；Varvara等发现的发根农杆菌的rolD启动子，仅在根中表达并转入到目的植物番茄中。非胚乳表达启动子可以降低转基因作物对人类健康带来的潜在风险，从而引导转基因作物在我国健康、有序地发展。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在作物种子以外部位表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“作物”是指单子叶作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种作物种子不表达启动子，所述作物种子不表达启动子SAFES5能够仅在种子部位不表达。

优选地，所述作物种子不表达启动子SAFES5由SEQ ID No:1所示的DNA序列构成。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的作物种子不表达启动子SAFES5。

另一方面，本发明提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的作物种子不表达启动子，在所述重组表达载体中，所述作物种子不表达启动子SAFES5连接于载体中待表达的基因序列的上游。

优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-SAFES5，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体；或者所述待表达基因是具有改善非胚乳性状功能的基因。该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即SAFES5或启动子SAFES5构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-SAFES5。

另一方面，本发明提供一种根据权利要求1所述的作物种子不表达启动子SAFES5在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的作物种子不表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。

优选地，所述应用还包括：利用序列表SEQ ID No.2和3中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要求1所述的水稻非胚乳表达启动子SAFES5；

回收目的片段，将其连接到PGEM-T-Easy载体上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和SmaI进行双酶切验证，验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFES5；

从上面获得的阳性克隆中提取质粒，进行双酶切，回收启动子SAFES5片段；

并利用SEQ ID No.2和3中所示引物对含有目标基因的载体进行线性化处理、回收载体，将上述的SAFES5片段和载体片段用T4连接酶进行连接，得到启动子SAFES5与目标基因融合的作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；

利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用上面所获得的转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。

优选地，所述目标基因为具有改善水稻植株中非胚乳部位性能的基因。

序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中称为SAFES5或启动子SAFES5。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段长度为1934bp的具有转录调控活性的DNA序列具有驱动目标基因在作物种子以外部位特异表达的作用。并且分离克隆得到了序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。

或者待表达基因可以为任何对作物的非种子性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在非种子组织中特异性地集中表达，从而实现改善作物相应性状的功能。

再一方面，本发明提供上述作物种子不表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述作物种子不表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良作物生长特性，所述作物为单子叶作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：

AAGAAACGAACTCAGCCTACGTCAGTTGTGAAATGTGAATTCAGCCCATGTAGACATAGGCCTAGGTCCATCAGGCCGAGGGCGGAAGGTGAAAGGAATAAGTTCACTTAGGGTCCCTCTATTTGTGGCCTAGTCTGATTTTCGTCCCTTGAACGCAAAACCGGGTACAACCCGTCCCTCAACTTATGAAAACCGGGCAAACGAGGTCCCTCGACAGTTTTGAGGGCGCTTTTGGCTGACATGGCGCCTACGTGGCTTGTTTGACTAGTTCTCCGTCCTACGTGGCATTGACGTGGCGCTTACGTGGCATTATATCTTGAAAAATTAATAAAAAAACATGGGACCACCTGTCAGATGCACACAAAAAATAATTTTAAAATAGCGGGGCCCACATGGGCCCACAAGTCAGATAATAAATATAGTGGGGCCCACATGGGCCCCACACGTATCTCCCTCTCTTCAACTCTCTCTCTCCCCTCTCCTCTCTCGCGGTGGAGAGGCAGCGGCGCTCGGCGTGCGGCGGCCGGCGGGAGAGGAAGGGGCGGCGGGAGGTGGCTCTAGCTGCCGCAGCCGTTGAGCCCACAGAGCGTCGGCGAGCGCGCAGAGGAGCGTCGACCCGGCGGCGGGGGGAGCGGCCGCGGCGTCGTTGTCCGCGGTAGCGCTGCCAAGGCAAGCGGAGCCGCTGGTGCGGTGGCTACTGCAGCCGGCCGACTTCCTCCACCGATGGGGCGTCGACATCCGCCGGGCTCCGTGGCCACAGGACGTCCCCATCCGCCGGGGGATGGGCCCCTCGCCGCCGCCCGTCTCTCCACTTGCCGACCCCCGAGCTCCTCCGCCTACGCCGTTGCCGGTCGCTGGATCTCCTCTATCCTCTACTCCAAGCCGTTGCCGGGTGGCCGGATCCCCTCCGAGCCTGGTCGATGGGGCCTCGCCTCATGCTGTTCGCTGGGGCACCGAGGACGGCGCTCGTCACCGGCCTTTGCTCCGCTCCACAGCTGGTCGCCACCGTCGACCTACGCCCGGCCGGGCGTGGTCCACTCTTGCGTCGTCACGGCGGGAGCGGGAGTGGCGGAGGACGGCGGGAGCAGCAACAAGGGAACCGTCTTACCCCGAGCGGCCACGGCGGGTTAGGGAGGTGGGTGGTGCCGCCGGTCGCCGGGCTGCGGCAGCGGCTGGGGTCATGTCGTCGCCTCGTCGGTGAGTGCCGGCGGGCGCGGGCTGCGAGGATGCGGTGGAACAGGGCGGTGGAGGAAAGGGGGGGGGGAGAGAATGACATGTGGGGCTCACGTGGGCCCCACCTTTTTTATAATTTCTATGTGAAACTGACATGTGGGTCCCGCGAGGTTTATTTATTTTTCGGGTTGAAAATTGCCACGTAAGCGCTACGTTAATTCCACGTGGGACGGAGACCTAGTCAAACAAGCCACGTAGATGCCACGTCATCCAAAACCGCCTTCAAAACCGCTGAGGGACCTCGTTTGCCCGGTTTTCGTAAGTTGGGGGACGGGTCGTACCCGGTTTTGCGGTCGAGGGACGAAAATCGGACTGAGTGACAAATAGAGGGACCCAAAGTGAACTTATTCCAAGGTGAAAATTTTAGCCCATTGGACTTGCCATCCTTTGGGCCTCCACACAAAAAATCGTGGGCGCCACGAGCCAATCGAATCGCCACAAACATCATCACCATCACCATATAATCCACCAAATTATTGTGGCCGTCGTGCACCCAGTGCCAAGCATCCACGGCGATGGCCCCCCGCTCGCCGCCACCGTGTCACGCCGGCAGCCTCAGGTTCGCCTGACGACGCAACGCCAATGCCAAGAACCACCACCACCGCCCATGAAACCTGGAGACGCGCCAAGAGTACGCAGAGGCTGAGCTGAGCCAGG

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段长度为1934bp的具有转录调控活性的DNA序列，并将其命名为SAFES5(序列表中的SEQ ID No:1)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在种子不表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株仅在种子中无蓝色出现，在其他器官组织中均有着色，从而证明该1934bp的序列具有驱动基因在种子以外部位表达的活性。

本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组作物表达载体，经转化后，可在非种子组织中特异的驱动靶标基因的表达。本发明的启动子可以与具有改善作物，尤其是水稻的根、茎、叶或其他非种子部位的基因结合使用，进而达到改善作物非种子部位性状，而不对种子部位带来任何影响。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子SAFES5能够调控基因在植株中非种子部位集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子调控目标基因在种子以外的非食用组织中表达，保证食用部分不含有外源基因表达的产物，降低其对人类健康带来的潜在风险，同时达到改良作物性状的目的。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将本发明的SAFES5启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-SAFES5示意图，其中示出了利用SAFES5启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为利用SAFES5启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位GUS染色结果，其中示出了SAFES5：：gus转基因水稻植株，其中a表示根，b表示叶鞘，c表示叶，d表示茎，e表示种子纵切面；从图中可以看出，GUS染色出现的蓝色在图a、b、c、d中出现，而e中没有出现。图中标尺＝1cm。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的SAFES5启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻SAFES5基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带SmaI，酶切位点(CCCGGG)，引物序列如下：

正向引物：AAGCTTGAGAGGTGAGTTGGGGAAGTAA HindIII

反向引物：CCCGGGAGTCGTCGTCGTCGTACGTCGT SmaI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子SAFES5的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子SAFES5，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1934bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和SmaI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFES5，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

作物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子SAFES5的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和SmaI双酶切，回收启动子SAFES5片段。同时利用HindIII和SmaI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的SAFES5片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子SAFES5与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-SAFES5(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子SAFES5驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“作物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得16株SAFES5-pCAMBIA1391植株(SAFES5：：gus转基因水稻植株)。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色，结果见图3，GUS染色的蓝色在根、鞘、叶、茎等种子以外组织器官中出现，而在种子中没有出现，说明本发明的启动子能够诱导目标基因在胚和胚乳之外的其他部位表达，而不会在胚和胚乳部位表达，对转基因水稻的推广具有深远意义。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。