缢江蓠原生质体的制备方法与流程

本发明涉及一种藻类细胞工程学方法，具体地说是缢江蓠原生质体的制备方法。

背景技术：

缢江蓠(Gracilaria salicornia)为红藻门藻类江蓠科江蓠属的一种，在中国主要分布在广东省和海南省沿海，属热带大型海藻藻类，具有生长快、耐高温的特点，是南方沿海潜在的经济养殖品种之一。自然界和当前生产中，江蓠主要通过放散孢子的方式进行繁殖，但是传统的采苗方法耗时长，苗种培育受杂藻的污染影响较大，很难在室内保存，而且容易发生病害。原生质体的分离和培养技术可以有效地避免这些问题。此外，原生质体没有细胞壁，可用于诱导植株再生、种间细胞杂交、遗传工程研究等领域。

技术实现要素：

本发明的目的是提供缢江蓠原生质体的制备方法。同时，根据海藻体细胞发育的全能性，利用工具酶分解缢江蓠组织，游离出体细胞原生质体，也可为遗传工程研究提供理想受体系统。

具体步骤如下：

（1）利用鲍的消化腺提取纯化制备工具酶；并配制消化用酶液；

（2）将缢江蓠藻体研磨或切成细小的组织块，放入酶液中进行酶解，获得缢江蓠的原生质体。

在本发明的一个实施方案中，步骤（1）中工具酶的制备方法为：取鲍鱼消化腺，捣碎后加入与其体积比1﹕1消毒海水，4℃静置过夜。吸取上清液，12000 rpm 4℃冷冻离心，取上清液反复离心得工具酶液。

在本发明进一步地实施方案中，步骤（1）中纤维素酶的制备方法为：称取1g纤维素酶溶于10ml高渗海水（盐度为30‰的消毒海水中添加1M葡萄糖），用醋酸缓冲液调整PH值至4.8-5。

在本发明进一步地实施方案中，步骤（1）中的酶液配方为：每20ml酶液=4ml工具酶+2.4ml纤维素酶+13.6ml高渗海水。

在本发明另一个实施方案中，在步骤（2）中，酶解过程中需要避光，温度35℃，酶解时间为3个小时。酶解完成后，用200目筛绢过滤细胞混合液，低速离心收集原生质体。

附图说明

图1：原生质体的荧光检测图（×20倍）

图2：原生质体Evans Blue染色，其中，1.死细胞；2.活细胞。

具体实施方式

下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1

本实施例实验材料为缢江蓠(Gracilaria salicornia)。

1）原生质体分离方法

工具酶的制备方法为：取鲍鱼消化腺，捣碎后加入与其体积比1﹕1消毒海水，4℃静置过夜。吸取上清液，12000 rpm 4℃冷冻离心，取上清液反复离心得工具酶液。

纤维素酶的制备方法为：称取1g纤维素酶溶于10ml高渗海水（盐度为30‰的消毒海水中添加1M葡萄糖），用醋酸缓冲液调整PH值至4.8-5。

本实施例中的酶液配方为：每20ml酶液=4ml工具酶+2.4ml纤维素酶+13.6ml高渗海水。

取2克左右缢江蓠，将其剪切成细小的组织块，在35℃下，将细小的组织块浸没在上述酶液中3个小时，避光，恒温摇床中进行搅拌。用200目筛绢过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、细胞团、碎片；取上清液离心，800 rpm离心10 min，使单细胞（原生质体）下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用消毒海水配制1 M葡萄糖反复冲洗、离心、弃上清液等过程2-3次，即获得较为纯净的缢江蓠体细胞原生质体悬液。

2）原生质体鉴定方法

采用0.1%的荧光增白剂染色法对所得细胞进行了鉴定，对所得样品进行染色5 min，于荧光显微镜下观察，激发光波长为370 nm紫外光。有壁细胞会有蓝绿色荧光显示纤维素存在，原生质体无蓝绿色荧光，其由于叶绿体的存在而发红色荧光，显示无纤维素的存在，如图1所示。

3）用血球计数板统计原生质体数量，统计其产量，见表1。

采用0.5% Evans Blue染色法对原生质体活力进行染色测定，在载玻片上滴一滴所得样品，再滴一滴染液，于显微镜下观察计数，成活的原生质体呈现亮黄色，死细胞呈深蓝色，如图2所示。

表1 不同酶液原生质体产量

实施例2

采用不同组方的酶液，按照实施例1的方法进行缢江蓠原生质体的制备，具体酶液组方如下：

对比例1：每20ml酶液=6.4ml纤维素酶+13.6ml高渗海水，纤维素酶配置方法同实施例1；

对比例2：每20ml酶液=6.4ml工具酶+13.6ml高渗海水，工具酶制备方法同实施例1。

对比例3：每20ml酶液=2ml工具酶+4.4ml纤维素酶+13.6ml高渗海水；纤维素酶和工具酶的制备方法同实施例1；

对比例4：每20ml酶液=5ml工具酶+1.4ml纤维素酶+13.6ml高渗海水；纤维素酶和工具酶的制备方法同实施例1；

对比例5：将1g纤维素酶、1g果胶酶和0.5g的离析酶溶于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；添加终浓度为40mmol/L的氯化钙作为稳定剂。

具体结果如下：

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。