一种白骨壤单加氧酶CMO及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种来源于白骨壤的单加氧酶CMO及其编码基因，以及其在培育耐盐性及耐旱性提高的转基因植物中的应用。

背景技术：

干旱使得超过40％的地球陆地面积种植农作物受到限制，对全球农业生产和粮食供应也构成了严重的威胁，干旱是对农作物产量的主要环境限制条件之一。

世界上盐碱土的面积很大，约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。在气候干燥的半干旱、干旱地区由于降雨量少、蒸发剧烈，盐分不断积累；海滨地区由于海水倒灌造成土壤含盐量增加。我国盐碱土主要分布于西北、华北、东北和滨海地区，随着大棚面积的逐年增长和栽培年代的推移，土壤盐渍化日趋严重。对绝大多数农作物来说，土壤中过量的Na⁺会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为我国农业生产中十分重要的问题。

采用传统的方法选育耐盐、抗旱的植物品种固然简便可行，但进展缓慢，局限性大。随着分子生物学技术的发展，一大批与植物耐盐、抗旱有关的基因相继得到克隆，植物转基因技术有了重大突破，这为有效利用旱地及盐碱地提高作物产量，治理盐渍化及荒漠化土地提供了新的思路和方法。

植物的抗逆性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为3类：(1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及其表达产物；(2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；(3)与水和离子的摄入和转运相关的基因及蛋白质。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得突破性的进展(Park S.2005.Up-regulation of a H⁺-pyrophosphatase(H⁺-PPase)as a strategy to engineer drought-resistant crop plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102:18830-18835；ABE H.2003.A rabid op sis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB)function as transcrip tional activato rs in abscisic acid signaling.Plant Cell,15:63-78；Zhang ZL.2011.Arabidopsis Floral Initiator SKB1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation.Plant Cell,23:396–411)。通过生物技术手段，对具有胁迫耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解。

但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究占多数，但抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的机理还有待进一步研究。虽然许多研究机构通过现代生物技术，获得了各类具有一定耐盐、抗旱等抗逆能力的转基因植物，但还未达到产业化的标准。因此在提高植物抗逆性方面，还有许多工作需要做。

技术实现要素：

本发明人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了一种白骨壤单加氧酶(本文命名为CMO)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现通过转基因技术将其导入植株并使其表达后，可显著改善转基因植株的耐盐性及耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供一种白骨壤单加氧酶CMO的编码基因(本文命名为AmCMO)，其序列为SEQ ID NO：2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体是pCAMBIA2300；优选地，所述重组表达载体为图2所示的35S-AmCMO-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性和/或耐旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性和/或耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。.

附图说明

图1是AmCMO基因的植物表达载体(35S-AmCMO-2300)构建流程(图1a-1b)。

图2是AmCMO基因的植物表达载体(35S-AmCMO-2300)的质粒图。

图3是转AmCMO基因的T1代拟南芥植株的耐盐实验结果，T1l3表现出显著的耐盐性，T1l17、T1l19的结果与其类似，在此未示出。

图4为利用反转录PCR对T1代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中AmCMO基因的转录水平进行分子水平检测的结果。M为DNA Ladder Marker(DL2000)，1-8为耐盐T1代转基因拟南芥植株(分别属于T1l3、T1l17、T1l19三个株系)，9-12为非转基因对照拟南芥植株。

图5是转AmCMO基因的T1代拟南芥植株的耐旱实验结果，T1l3表现出显著的耐旱性，T1l17、T1l19的结果与其类似，在此未示出。

具体实施方式

提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。

以下实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自New England Biolabs公司。

在本发明中，如果没有注明并且在上下文中没有歧义，比例和百分比是基于重量计算的。

实施例1.盐胁迫下白骨壤SSH文库构建：

具体方法为：

按照Clontech公司的PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建SSH文库(抑制差减文库)。在实验过程中以盐处理的白骨壤根中提取的mRNA作为样本(Tester)，以未处理的白骨壤根中提取的mRNA作为对照(Driver)。具体步骤如下：

(1)供试材料：

白骨壤采自广东省深圳市福田国家级自然保护区(N22°53′，E114°01′)。采集无虫害、发育良好、成熟程度接近的白骨壤(Aricennia marina)胚轴，选取大小、长度、重量接近的胚轴用于实验。在塑料桶(盆口径18cm，高15cm)中沙培，每个桶底部垫塑料托盘，细沙为河沙，平均粒径约为1mm，自来水洗净，每个小桶种植胚轴4个。在28℃，自然光照12小时每天的条件下萌发生长苗木培养期间，每天浇适量的自来水补充水分，并且每一周浇一次Hoagland营养液(D.R.Hoagland and D.I.Arnon.The water-culture method of growing plants without soil.Calif.Agr.Expt.Sta.Circ.347.1950)。

(2)材料处理：

选择生长发育外观一致(幼苗高度一致、每株幼苗长至6片叶子)的白骨壤幼苗，分成两组，一组浇2L500mM NaCl，一组浇2L蒸馏水，处理时间为6小时。收集处理组和对照组的根。用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。

(3)总RNA提取：

分别取对照组和盐处理组的白骨壤叶子各3.0g，用植物RNA提取试剂盒(购自Invitrogen)提取总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定所得总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒(从总RNA中纯化polyA+RNA)分离mRNA。

(4)抑制差减杂交：

按Clontech公司的PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将Driver mRNA和Tester mRNA分别反转录(反转录引物为试剂盒所提供引物)，得到双链cDNA，再以2μg Tester cDNA和2μg Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在37℃水浴下分别将Tester cDNA和Driver cDNA用Rsa I酶切1.5小时，然后将酶切后的Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的Tester cDNA分别与过量的Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，通过两次抑制性PCR扩增富集差异表达基因的片段(PCR进行前，将第二次正向差减杂交产物进行末端补平)。

(5)差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照pGEM-T Easy试剂盒(购自Promega)的说明书，将所述第二次正向差减杂交cDNA片段的第二次抑制性PCR扩增产物(使用QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自Qiagen)与pGEM-T Easy载体连接，其具体步骤如下：在200μl PCR管中依次加入下列成分：纯化的合并后的正向差减杂交cDNA片段的第二次抑制性PCR产物3μl、2×T4 DNA连接酶缓冲液5μl、pGEM-T Easy载体1μl、T4 DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。然后取10μl连接反应产物，加入到100μl大肠杆菌JM109感受态细胞(购自TAKARA)中，冰浴30分钟、热休克60秒、冰浴2分钟，然后加入250μl LB液体培养基(含有1％胰蛋白胨(Tryptone，购自OXOID)、0.5％酵母提取物(Yeast Extract，购自OXOID)和1％NaCl(购自国药))后置于37℃摇床中，以225 rpm振荡培养30分钟，然后从中取200μl菌液接种于含50μg/ml氨苄青霉素、40μg/mL X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、24μg/mL IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的LB(同上)固体(1.5％琼脂，下同)培养板上(X-gal和IPTG均购自TAKARA)，37℃培育18小时。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落，随机挑取300个白色菌落(编号：Am-SL-001至Am-SL-300)。将所挑取白色菌落分别接种于96孔细胞培养板(CORNING)中的含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(同上)中，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，然后于–80℃保存备用。使用巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R(来自Clontech公司的PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒)对所培养的菌液分别进行PCR扩增验证，得到224个阳性克隆，然后将所有阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

(6)差异克隆的cDNA测序分析：

将DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的cDNA后，共得到189个有效表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)(Unigene)。

实施例2 白骨壤单加氧酶编码基因AmCMO的克隆

将所述鉴定的白骨壤SSH文库中编号为Am-SL-125的克隆子去掉冗余DNA后，序列为SEQ ID No：3，序列分析表明该序列编码的蛋白属于单加氧酶。本文将SEQ ID No：3序列对应的全长编码基因命名为AmCMO，其对应的蛋白命名为CMO。

SEQ ID No：3：

AmCMO全长编码基因的克隆

根据已经获得的SEQ ID No：3序列，设计如下两条特异性引物，作为3’RACE的5’端特异性引物。

AmCMO GSP1：SEQ ID No：4：

TGTGACAACT ATTTAGATGG TGG

AmCMO GSP2：SEQ ID No：5：

GGTCTCCAGC TTGATTCGTA TTC

实验步骤按试剂盒说明书操作(3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自Invitrogen公司)。

用SEQ ID NO：4与通用引物AUAP(试剂盒自带)，以盐处理组提取的mRNA反转录得到的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。具体步骤如下：

50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl cDNA、1.0μl Ex Taq(购自TAKARA)、10μM的引物SEQ ID NO：4和AUAP各2.0μl以及35μl双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。

将所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：5与通用引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：

50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl稀释的第一轮PCR产物、1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：5和AUAP各2.0μl以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。

回收第二轮PCR产物中片段约为600bp的条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)，并将其连接于pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中(具体方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL X-gal、24μg/mL IPTG的LB固体培养基上进行筛选。随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，-80℃保存备用。用SEQ ID NO：5与通用引物AUAP进行菌液PCR扩增验证，得10个阳性克隆，将3个阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，获得该基因的cDNA的3’端。

根据已经获得的AmCMO基因片段，设计如下三条特异性引物，作为5’RACE的3’端特异性引物。

AmCMO GSP3：SEQ ID No：6：

ACCTAGCCAT TCATTGGCCA CGAC

AmCMO GSP4：SEQ ID No：7：

ATTCCATATG TCCAACCATG ATA

AmCMO GSP5：SEQ ID No：8：

GCAAGAAGAG ATCCATGATG GCG

实验步骤按试剂盒说明书操作(5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自Invitrogen公司)。

用SEQ ID NO：7与通用引物AAP(试剂盒自带)，以盐处理组白骨壤提取的mRNA反转录得到的cDNA(反转录引物SEQ ID NO：6，dCTP加尾)为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：

50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl cDNA、1.0μl Ex Taq(购自TAKARA)、10μM的引物SEQ ID NO：7和AAP各2.0μl以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。

将所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：8与引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：

50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl稀释的第一轮PCR产物、1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：8和AUAP各2.0μl以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。

回收第二轮PCR产物中片段约为600bp的条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)，并将其连接于pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中(具体方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL X-gal、24μg/mL IPTG的LB固体培养基上进行筛选。随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，-80℃保存备用。用SEQ ID NO：8与引物AUAP进行菌液PCR扩增验证(反应体系及反应条件同上)，得到8个阳性克隆，选取其中3个克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，获得该基因的cDNA的5’端。所得的5’RACE产物克隆测序后，将其与上述3’RACE产物测序结果以及SEQ ID No：3序列进行拼接，获得AmCMO全长cDNA序列SEQ ID No：9。

SEQ ID No：9：

根据SEQ ID NO：9序列设计一对引物如下：

SEQ ID No：10：

ATGGCAGGGA CCACAGTGCT GCA

SEQ ID No：11：

TCAACGAAAT CCTTTACAGG TGC

通过SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11来克隆AmCMO全长编码基因。

采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以盐处理组白骨壤根提取的mRNA反转录的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl cDNA、1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11各2.0μl以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟)，72℃延伸10分钟。

PCR扩增产物加A尾：PCR产物中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，然后用21μl双蒸水溶解所得沉淀。然后向其中加入2.5μl 10×Ex Buffer、0.5μl 5mM的dATP、1.0μl Ex Taq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到的约1300bp的DNA片段回收(Omega回收试剂盒)，并将其连接至pGEM T-easy载体上得到AmCMO-pGEM质粒，然后将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中(方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL X-gal、24μg/mL IPTG的LB固体培养基上进行筛选。随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，-80℃保存备用。用SEQ ID NO：10与SEQ ID NO：11进行菌液PCR扩增验证(反应体系及反应条件同上)，得到9个阳性克隆，选取其中3个阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，所得序列为SEQ ID NO：2，其编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

CMO蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO：1

AmCMO基因的核苷酸序列SEQ ID NO：2

实施例3 AmCMO基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择35S启动子及Tnos终止子分别作为AmCMO基因的启动子和终止子，构建流程图如图1所示。

使用引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，以植物表达载体pBI121质粒(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、1.0μl pBI121质粒、1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13各2.0μl以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒)，72℃延伸10分钟。通过EcoRI、BglII酶切将所得的PCR产物按试剂盒说明(Promega，T4连接酶试剂盒)连接到pCAMBIA2300获得pCAMBIA2300-1。

SEQ ID NO：12

GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga

SEQ ID NO：13

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15以pBI121质粒为模板扩增Tnos，采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PSBuffer、3μl 2.5mM的dNTP、1.0μl pBI121质粒、1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15各2.0μl以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒)，72℃延伸10分钟。通过KpnI、EcoRI酶切将所得的PCR产物连接(Promega T4连接酶试剂盒)到pCAMBIA2300-1获得pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO：14：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO：15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

用引物SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17以pCAMBIA2300质粒为模板扩增35S启动子。采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl5×PS Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、1.0μl pCAMBIA2300质粒、1.0μlPrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17各2.0μl以及31μl双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒)，72℃延伸10分钟。通过HindIII、SalI酶切将所得的PCR产物连接(连接方法同上)到pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3。

SEQ ID NO：16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG

SEQ ID NO：17：

TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT

用引物SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19扩增AmCMO编码基因的全长序列(模板是实施例2所获得阳性AmCMO-pGEM质粒)，采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、1.0μl AmCMO-pGEM质粒、1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19各2.0μl以及31μl双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟)，72℃延伸10分钟。通过SalI、KpnI酶切将所得的PCR产物连接(连接方法同上)到pCAMBIA2300-3，经验证后获得植物表达载体35S-AmCMO-2300(图2)。

SEQ ID NO：18

ACTGTCGAC ATGGCAGGGA CCACAGTGCT GCA

SEQ ID NO：19

GCTGGTACC TCAACGAAAT CCTTTACAGG TGC

实施例4 35S-AmCMO-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌GV3101(购自上海迈其生物科技有限公司)感受态细胞的制备：将农杆菌GV3101在含50μg/ml利福平和50μg/m庆大霉素LB固体培养基上划单斑接种，28℃培养1至2天。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大酶素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16小时)至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml培养活化后的菌液(1:20的比例)接种于100ml含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5小时至OD600＝0.8。冰浴菌液10分钟，每隔3分钟摇匀一次，使所述细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10分钟，弃上清液；加入1ml冰预冷的10％(体积比)甘油重悬浮菌体，4℃下4000g离心10分钟，收集沉淀；用冰预冷的10％(体积比)甘油重复洗3-4次；然后加入适量冰预冷的10％(体积比)甘油重新悬浮细菌沉淀，即制得GV3101感受态细胞，以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化所述的GV3101感受态细胞，向40μl的所述感受态细胞中加入1μl实施例3获得的质粒35S-AmCMO-2300，混匀后冰浴约10分钟。将冰浴后的感受态细胞和35S-AmCMO-2300质粒的混合物用微量移液器转移到冰预冷的0.1cm规格的电击杯(购自Bio-Rad)中，轻敲使悬浮液到达电击杯底部(注意不要有气泡)。将所述电击杯放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。将MicroPulser(购自Bio-Rad)的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入28℃预热的200μlLB培养基。快速而轻柔的用微量移液器将感受态细胞打匀。将悬浮液转入1.5ml的离心管，在28℃下225rpm摇动培养1小时。取100-200μl的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上(LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml庆大霉素、50μg/ml卡那霉素)，28℃培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于-70℃保存备用。

实施例5 受体材料拟南芥培养

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土(1:1)作为拟南芥种植土壤。使用直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗拟南芥种子(哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心)。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温22℃，光照强度3500-4000lx，光照周期为12小时黑暗/12小时光照培养，每7天浇灌一次1/2MS液体培养基(9.39mM KNO3，0.625mM KH2PO4，10.3mM NH4NO3，0.75mM MgSO4，1.5mM CaCl2，50μM KI，100μM H3BO3，100μM MnSO4，30μM ZnSO4，1μM Na2MoO4，0.1μM CoCl2，100μM Na2EDTA，100μM FeSO4)。培养30天后，每盆保留4-5棵植株，光照周期调整为8小时黑暗/16小时光照培养，待大部分植株都抽苔之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约1周后在腋芽部位长出4-6个新生侧苔，待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成1-2个角果时，便可用于转化。

实施例6 拟南芥花浸转化

将实施例4获得的已转化35S-AmCMO-2300表达载体的GV3101农杆菌菌液接种至含有50μg/ml卡那霉素(kan)的LB液体培养基中培养过夜，第二天早上按1:50接种至含有50μg/ml卡那霉素的新的LB培养基(1L)中，培养约8个小时，至农杆菌液OD600在1.0到1.2之间。室温5000rpm离心5分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于浸染培养基(1/2MS液体培养基，并含有5％蔗糖；用KOH调至pH5.7；0.02％Silwet L-77)中，使OD600在0.8左右。将实施例5制备的用于转化的拟南芥的上部缓缓、螺旋式浸入所述含农杆菌的浸染培养基内，轻轻顺时针晃动，约2分钟，用透明塑料罩盖严以保持湿度，放入温室过夜。24小时后移去塑料透明罩，用水浇透。之后2-3周，保证植株水分充足。当植株停止开花，第一个果荚成熟变黄时，用纸袋套住，当纸袋内的所有果荚变黄后，停止浇水，1-2周干燥后收取种子，进行转化子筛选，同时取未经转化处理的拟南芥果荚作为对照。

实施例7 拟南芥转基因阳性转化子的筛选

种子消毒：先用70％乙醇浸泡10分钟，并不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，并不时地使种子悬浮。然后，将处理后的种子均匀涂布在含50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基表面上(一块150mm直径的平皿最多播种1500粒种子)，4℃春化2天，然后在恒温22℃、光照强度3500-4000lx、光照周期为12小时黑暗/12小时光照条件下培养7-10天。转基因种子在所述筛选培养基上萌发2周以后，将能够萌发并正常生长的植株转入土壤继续培养。剪取所述能够在筛选培养基上正常生长的每株植物的1-2个叶片，提取其DNA作为模板，用SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19作为引物进行PCR检测(反应体系及条件同上)，去除PCR阴性植株，收集PCR阳性植株的种子分别编号(T0l1-T0l23)并保存。

实施例8 过表达AmCMO的转基因拟南芥T1代植株的种植

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土(1:1)作为拟南芥种植土壤。将编号T0l1-T0l23的每种转化子及非转基因对照拟南芥种子各播种2盆(每盆播种20-30颗种子)。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温22℃，光照强度3500-4000 lx，光照周期为12小时黑暗/12小时光照培养，每7天浇灌一次1/2MS液体培养基。培养25天后，每株剪取1-2个叶片并提取其DNA作为模板，用SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19作为引物进行PCR检测(反应体系及条件同上)。去除PCR阴性植株，每盆保留7-8棵PCR阳性苗，继续培养10天后，每盆保留大小较一致的5-7棵转基因拟南芥或非转基因对照拟南芥苗进行耐盐实验。

实施例9 过表达AmCMO的转基因拟南芥T1代植株的耐盐实验

将实施例8中转基因拟南芥、对照拟南芥各保留一盆植株不作处理，正常浇灌1/2MS液体培养基，同时各取一盆植株浇灌含有150mM NaCl的1/2MS液体培养基，恒温22℃、光照强度3500-4000lx、12小时光培养/12小时暗培养循环，14天后观察实验结果。T1代转基因植株(T0代转基因植株的种子长成的植株)的耐盐性鉴定表明，T1代转基因植株T1l3、T1l17、T1l19三个株系表现出显著的耐盐性(见图3，以T1l3例，T1l17、T1l19的结果与类似，在此未示出)。

实施例10 在转录水平上验证AmCMO基因的表达

将实施例9中耐盐性好的T1代转基因植株中随机选取8棵(分别属于上述T1l3、T1l17、T1l19三个耐盐株系)，实施例9中对照植株随机选取4棵，各剪取盐(150mM NaCl)处理14天的叶片0.05g，用植物RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取总RNA。紫外分光光度测定所得总RNA在260nm和280nm的吸光度值，计算各个RNA浓度。依照Invitrogen反转录试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录，取1μg总RNA作为模板反转录。使用引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：20(SEQ ID NO：20：GGCACATGAT AACCACCATC TAA)扩增AmCMO片段，检测其转录情况。使用引物SEQ ID NO：21(SEQ ID NO：21：5-GCCATCCAAGCTGTTCTCTC-3)和SEQ ID NO：22(SEQ ID NO：22：TTCTCGATGGAAGAGCTGGT)扩增AtACT2片段(拟南芥看家基因：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AK317453.1)，作为对照。

采用TAKARA的Ex DNA聚合酶，以上述反转录所得的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：5μl10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，0.3μl Ex DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：20各2.0μl，以及35.7μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，30个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。

PCR产物电泳结果如图4所示：M为DNA Ladder Marker(DL2000，购自深圳瑞真生物技术有限公司)，1-8为耐盐T1代转基因拟南芥植株(分别属于T1l3、T1l17、T1l19三个株系)，9-12为非转基因的对照拟南芥植株。结果表明，耐盐T1代转基因拟南芥植株中AmCMO均有显著转录，非转基因对照拟南芥植株中没有AmCMO的转录。

实施例11 T1l3、T1l17、T1l19转基因拟南芥的耐旱实验

T1l3、T1l17、T1l19转基因拟南芥种植与实施例8相同，转基因拟南芥、对照拟南芥各一盆不作处理，正常浇灌1/2MS，转基因拟南芥、对照拟南芥的另一盆，不浇灌1/2MS，恒温22℃，光照强度3500-4000lx，12小时光培养/12小时暗培养循环。10天后观察实验结果：T1j2表现出明显的耐旱性(见图6，以T1l3例，T1l7、T1l19的结果与其类似，在此未示出)。