本发明涉及生物学领域，具体涉及基因工程技术领域。
背景技术：
现有技术的报告基因分析技术，如蓝白斑筛选和抗生素筛选，在分子生物学领域有广泛应用。
蓝白斑筛选(β-半乳糖苷酶系统)是分子生物学实验中较常用的筛选标记，具有高效和简单的优势，主要用于基础研究，包括提高克隆效率。近年来，蓝白斑筛选用于体细胞突变的体外基础研究，后者如big-blue小鼠和大鼠(ref)；以及用于人类遗传性突变的基因分析。但蓝白斑筛选技术用于人类KRAS基因突变，还是一种有待研发的新技术。
在离体研究中，此类载体携带lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端(α-肽)，并且处于诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解)诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15基因型(含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因)。未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG的诱导下，质粒与宿主菌分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽(即α-互补)，形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，菌落呈现蓝色。但当外源DNA插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，使其编码的α-肽失去活性，则重组子所在的细菌不能完成α互补，不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，致使重组菌形成白色菌落。因此，可以借助蓝白斑筛选出重组子。本发明由此而来。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种可以在大肠杆菌上检测基因工程核酸酶有无活性及活性高低的方法。本发明通过构建含有双重复片段的待测靶序列载体，与基因工程酶进行共转化，利用双转化后所产生的菌落变化，对核酸酶活性进行评估。
本发明的技术核心为待测靶序列两端含有双拷贝的完全相同重复序列的载体。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测基因工程核酸酶活力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取含有携带lacZ基因的载体，
(2)构建含有双重复片段的载体：将两个重复片段插入到所述的载体中，且将待测核酸酶的靶序列插入两个重复片段之间，所述的两个重复片段的序列完全一致，且所述的两个重复片段为移动报告基因的阅读框架；
(3)将步骤(2)构建的含有基因工程核酸酶与双重复片段的载体进行在含有X-Gal-IPTG的培养基中进行转化，
(4)根据共转化的菌落形成结果对酶活力进行评价。
本发明优选的一技术方案中，所述载体包含但不限为PMD19-T、PMD18-T、CRISPR/Cas9。
本发明优选的一技术方案中，所述重复片段的长度为10到50个碱基。
本发明优选的一技术方案中，所述重复片段包括EGFR重复片段，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；HBV重复片段，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示；LoxP重复片段，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示。
本发明优选的一技术方案中，所述步骤(4)中菌落形成结果包括：菌落颜色的蓝色与白色的差异、菌落有无的差异、菌落多少的差异。
本发明优选的一技术方案中，待测核酸酶的靶序列选自：血管紧张素原(AGT)基因，优选具有如SeqIDNo.4或5所示的核苷酸序列。
在活细胞内核酸酶对核酸靶序列剪切后，主要发生两种方式的修复：非同源末端连接和同源修复。在原核细胞中，非同源末端连接很少发生或完全不发生；而同源修复则因序列不同导致不同的效率。
为了标准化和高效化大肠杆菌体内的基因同源重组，我们构建和比较了多种含有双重复片段的载体在核酸酶活性检测中的应用价值。三种载体均能具有检测基因工程酶活性的能力，而其中以含有人类HBV病毒重复片段和含有噬菌体LoxP重复片段的载体效率较高。
当这种双重复片段载体与蓝白斑筛选相结合时，待测靶序列和重复片段均位于alpha-多肽基因编码序列之内，并且使编码框架发生移码效果，这样的载体自身转化得到的大肠杆菌表现为白色。同时，载体构建时设计了重复片段之间发生重组反应后使基因阅读框架回复。这样，当共转化时基因工程酶使靶序列发生剪切后，可形成蓝色的菌落斑。蓝色菌落斑的形成，表明核酸酶的剪切已经发生。蓝色菌落斑的多少，与核酸酶的剪切活力的大小相关。
当这种双重复片段载体还可以应用于其他选择性靶基因结合。无论应用于何种选择性基因，本方法中的双重复基因片段可以来源于多种基因，需要满足的条件是：1)重复片段的序列要完全一致；2)待测核酸酶的靶序列必须位于两个重复片段之间；3)设计载体时保证含有双重复片段时为移动报告基因的阅读框架和重组后只含有一个重复片段时恢复报告基因的阅读框架。
本发明对核酸酶活性的剪切具有直接明了，敏感性高，快速，廉价等优点。
通过使用含有双重复片段的载体，在与基因工程酶共转化时，基因工程酶可以剪切重复片段中间的靶序列，导致在大肠杆菌内发生重复片段的重新组合，表现出细菌菌落数量或颜色的改变，由此确定待测核酸酶是否对靶序列发生了剪切以及剪切的多少。本发明可用于筛选核酸酶的合适与非合适靶序列，以及用于筛选确定靶序列的高效的基因工程酶。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为实施例1中含有25bp靶点的EGFR重复序列载体测序结果。
图2为实施例1中含有25bp靶点的EGFR重复序列载体在Amp-X-Gal-IPTG培养皿上菌落生长。
图3为实施例2中含有24bp靶点的HBV重复序列载体测序结果。
图4为实施例2中含有24bp靶点的HBV重复序列载体在Amp-X-Gal-IPTG培养皿上培养菌落。
图5为实施例3中含有24bp靶点的LoxP重复序列载体测序结果。
图6为实施例3中含有24bp靶点的LoxP重复序列载体在Amp-X-Gal-IPTG培养皿培养上菌落。
图7为实施例4中CRISPR/Cas9载体在Cl-X-Gal-IPTG培养皿上培养菌落。
图8为实施例4中含有对应gRNA的CRISPR/Cas9质粒测序结果。
图9为实施例1中构建的载体与CRISPR/Cas9载体共同转化菌落在Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿生长。
图10为图9中蓝色菌落测序结果。
图11为实施例5中将实施例2中的载体与实施例4中的CRISPR/Cas9载体共同转化Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿菌落生长图。
图12为图11中蓝色菌落测序结果。
图13为将实施例3中的载体与实施例4中的CRISPR/Cas9载体共同转化Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿生长情况。
图14为图13中蓝色菌落测序结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用要求的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
一、材料及设备
1.实验动物或材料来源及处理
PMD-19T(A1360)购自美国promega公司；pCas9购自北京溯源精微科技有限公司；普通引物或寡核苷酸由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
2.主要仪器：普通PCR仪(杭州博日公司)、隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器公司)、Milli-Q超纯水仪(上海瑞枫生物科技有限公司)、DK-600B电热恒温水槽(上海精宏公司)、MICROCL17离心机(Thermo公司)、Air-tech超净工作台(苏净集团)、-80℃低温冰箱(SANYO公司)、电子分析天平(美国Sartorius公司)、凝胶成像分析系统(复日科技)、高压灭菌锅(上海博讯)、4℃冰箱(青岛海尔)、5810R低温高速离心机(Eppendorf公司)、微量移液器(Eppendorf公司)、常温高速离心机(Eppendorf公司)、DDY-5型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)。
3.主要试剂：EColi.DH5a菌株、离心柱型普通DNA产物回收试剂盒、离心柱型质粒小提中量试剂盒主要购自北京天根公司；1000bpDNALadder、HindIII、KpnI、Eco31I主要购自美国Fermentas公司；T4PNK、T4ligase主要购自美国NEB公司；氨苄青霉素、氯霉素、电泳级琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂、EB、无水乙醇、氯化钠、Tris-bas、EDTA、DMSO、IPTG、X-Gal等主要购自阿尔法生物试剂公司。测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供。
实施例一、构建含人类EGFR基因片段的双重复片段载体
首先用KpnI和HindIII对PMD19-T载体进行双酶切，然后插入EGFR重复序列，并对原先的KpnI和HindIII酶切位点进行突变，构建含有EGFR重复序列的载体。再次用KpnI和HindIII对已含有EGFR重复序列的载体进行双酶切，插入25bp的靶点序列，使载体处于移码状态，构建含有靶点的EGFR重复序列载体，该载体在X-Gal和IPTG诱导下生长为白色菌落。
构建载体所用的引物如下：
Re-EGFR-F:AGCTCCAAGGAACTGGTAGCAAGCTTGACGATATCTGGTACCCAAGGAACTGGTAGCAGTAC，如SeqIDNo.6所示。
Re-EGFR-R:TGCTACCAGTTCCTTGGGTACCAGATATCGTCAAGCTTGCTACCAGTTCCTTGG，如SeqIDNo.7所示。
Target-25-F:AGCTTGCCCAGCTGCTGCTGTCCACGGTGGGGTAC，如SeqIDNo.8所示。
Target-25-R:CCCACCGTGGACAGCAGCAGCTGGGCA，如SeqIDNo.9所示。
含有25bp靶点的EGFR重复序列载体测序结果如图1所示，(两端标记为EGFR重复序列，中间标记为靶点)。
EGFR重复序列为CAAGGAACTGGTAGC，如SeqIDNo.1所示。
靶点序列为GCCCAGCTGCTGCTGTCCACGGTGG，如SeqIDNo.4所示。
含有25bp靶点的EGFR重复序列载体在Amp-X-Gal-IPTG培养皿上菌落生长如图2所示。
实施例二、构建含人类HBV病毒片段的双重复片段载体
首先用KpnI和HindIII对PMD19-T载体进行双酶切，然后插入HBV重复序列，并对原先的KpnI和HindIII酶切位点进行突变，构建含有HBV重复序列的载体。再次用KpnI和HindIII对已含有HBV重复序列的载体进行双酶切，插入24bp的靶点序列，使载体处于移码状态，构建含有靶点的HBV重复序列载体，该载体在X-Gal和IPTG诱导下生长为白色菌落。
构建载体所用的引物如下：
Re-HBV-F:AGCTCACTCTGGCTAACTAGGGAACCCTTCACCTCTGCAAGCTTCACGATATCTGGTACCTCACTCTGGCTAACTAGGGAACCCTTCACCTCTGCAGTAC，如SeqIDNo.10所示。
Re-HBV-R:TGCAGAGGTGAAGGGTTCCCTAGTTAGCCAGAGTGAGGTACCAGATATCGTGAAGCTTGCAGAGGTGAAGGGTTCCCTAGTTAGCCAGAGTG，如SeqIDNo.11所示。
Target-24-F:AGCTTCCCAGCTGCTGCTGTCCACGGTGGGGTAC，如SeqIDNo.12所示。
Target-24-R:CCCACCGTGGACAGCAGCAGCTGGGA，如SeqIDNo.13所示。含有24bp靶点的HBV重复序列载体测序结果如图3所示(两端标记为HBV重复序列，中间标记为靶点)。
HBV重复序列为ACTCTGGCTAACTAGGGAACCCTTCACCTCTGC,如SeqIDNo.2所示。
靶点序列为CCCAGCTGCTGCTGTCCACGGTGG,如SeqIDNo.5所示。含有24bp靶点的HBV重复序列载体在Amp-X-Gal-IPTG培养皿上培养菌落为白色，如图4所示。
实施例三、构建含噬菌体LoxP片段的双重复片段载体
首先用KpnI和HindIII对PMD19-T载体进行双酶切，然后插入LoxP重复序列，并对原先的KpnI和HindIII酶切位点进行突变，构建含有LoxP重复序列的载体。再次用KpnI和HindIII对已含有LoxP重复序列的载体进行双酶切，插入24bp的靶点序列，使载体处于移码状态，构建含有靶点的LoxP重复序列载体,该载体在X-Gal和IPTG诱导下生长为白色菌落。
构建载体所用的引物如下：
Re-LOXP-F:AGCTCGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCAAGCTTCACGATATCTGGTACCTCGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCAGTAC，如SeqIDNo.14所示。
Re-LOXP-R:TGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCGAGGTACCAGATATCGTGAAGCTTGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCG，如SeqIDNo.15所示。
Target-24-F:AGCTTCCCAGCTGCTGCTGTCCACGGTGGGGTAC，如SeqIDNo.16所示。
Target-24-R:CCCACCGTGGACAGCAGCAGCTGGGA，如SeqIDNo.17所示。构建含有24bp靶点的LoxP重复序列载体测序结果如图5所示(两边标记为LoxP重复序列，中间标记为靶点)。
LoxP重复序列为GATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATC,SeqIDNo.3所示。
靶点序列为CCCAGCTGCTGCTGTCCACGGTGG,如SeqIDNo.5所示。
构建含有24bp靶点的LoxP重复序列载体在Amp-X-Gal-IPTG培养皿培养上菌落为白色，如图6所示。
实施例四、利用含EGFR基因片段的双重复片段载体进行大肠杆菌白变蓝实验
首先用BsaI对CRISPR/Cas9质粒进行酶切，插入gRNA序列，构建含有对应gRNA的CRISPR/Cas9载体。
构建含有gRNACRISPR/Cas9载体所用的引物如下：
gRNA-F:AAACCAGCTGCTGCTGTCCACGGG，如SeqIDNo.18所示。
gRNA-R:AAAACCCGTGGACAGCAGCAGCTG，如SeqIDNo.19所示。
CRISPR/Cas9载体在Cl-X-Gal-IPTG培养皿上培养菌落为白色，如图7所示。含有对应gRNA的CRISPR/Cas9质粒测序结果如图8所示。
将实施例一中已构建的载体与CRISPR/Cas9载体共同转化，在Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿上过夜培养，出现蓝色菌落，并挑选蓝色菌落进行测序。测序结果表明，CRISPR/Cas9发生剪切作用从而使实施例一中载体两边的EGFR重复序列发生重组，使载体恢复阅读框，故而在X-Gal和IPTG诱导下生长为蓝色菌落。
实施例一中已构建的载体与CRISPR/Cas9载体共同转化菌落在Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿生长如图9所示。蓝色菌落测序结果如图10所示。实施例五、利用含人类HBV病毒片段的双重复片段载体进行大肠杆菌白变蓝实验
将实施例二中已构建的载体与实施例四中构建的CRISPR/Cas9载体共同转化，在Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿上过夜培养，出现蓝色菌落，并挑选蓝色菌落进行测序。测序结果表明，CRISPR/Cas9发生剪切作用从而使实施例二中载体两边的HBV重复序列发生重组，使载体恢复阅读框，故而在X-Gal和IPTG诱导下生长为蓝色菌落。
菌落在Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿生长如图11所示。蓝色菌落测序结果如图12所示。
实施例六、利用含噬菌体LoxP片段的双重复片段载体进行大肠杆菌白变蓝实验
将实施例三中已构建的载体与实施例四中构建的CRISPR/Cas9载体共同转化，在Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿上过夜培养，出现蓝色菌落，并挑选蓝色菌落进行测序。测序结果表明，CRISPR/Cas9发生剪切作用从而使实施例三中载体两边的LoxP重复序列发生重组，使载体恢复阅读框，故而在X-Gal和IPTG诱导下生长为蓝色菌落。
菌落在Amp-Cl-X-Gal-IPTG培养皿生长如图13所示。蓝色菌落测序结果如图14所示。