本发明涉及医药领域，具体涉及一种Rakicidins类化合物Rakicidin B1，药效学试验证明本发明的Rakicidin B1具有治疗存在肿瘤缺氧状态的实体瘤如胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、肠癌以及厌氧菌引起的腹泻、消化道炎症、口腔炎症及皮肤痤疮等疾病的用途。
背景技术：
抗肿瘤药物市场近年来高速增长，2014年抗癌药市场全球销售额1000亿美元；到2018年，抗癌药市场将达到1470亿美元，复合增长率11.6％，研发抗癌药将获利巨大。缺氧是恶性实体肿瘤的特征之一，缺氧与肿瘤的血管新生、侵袭转移、放化疗抵抗和预后不良等密切相关。低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是缺氧效应调控中最为关键的核转录调控因子。HIF-1在实体肿瘤组织内选择性持续高表达,下游关键调控基因与肿瘤的发生发展密切相关,如促进血管生成、细胞存活、抑制肿瘤细胞凋亡、代谢重塑以及pH稳态的调节。正是由于不同时空下癌症细胞所处的环境中氧含量的不同，由此激活的促进肿瘤生长的信号通路通常不会在正常组织中被诱导，所以乏氧信号通路成为潜在的治疗靶点。以HIF-1为靶点的特异性小分子抑制剂也成为肿瘤缺氧效应调控药物研发的重点。
Rakicidin A和B因为其15元环脂肽结构中含1个稀有罕见的4-氨基-2,4-戊二烯酸辛酯并有抗肿瘤细胞活性而受到关注[McBrien K D,Berry R L,Lowe S E et al.Rakicidins,New Cytotoxic Lipopeptides from Micromonospora sp.Fermentation,Isolation and Characterization[J].J Antibiot,1995,48:1446]。Yamazaki(2007)研究发现Rakicidin A具有卓越的乏氧选择性抗肿瘤细胞活性，在乏氧条件下抗结肠癌HCT-8细胞活性是常氧条件下的17.5倍[Yamazaki Y,Kunimoto S,Ikeda D.Rakicidin A:a hypoxia-selective cytotoxin[J].Biol Pharm Bull.2007,30(2):261-5.]。Takeuchi(2011)首次报道Rakicidin A乏氧条件下能诱导髓性慢性白血病干细胞的凋亡[Takeuchi M,Ashihara E,Yamazaki Y,et al.Rakicidin A effectively induces apoptosis in hypoxia adapted Bcr-Abl positive leukemic cells[J].Cancer Sci.2011,102(3):591-6.]。该化合物抗乏氧肿瘤细胞及抗肿瘤干细胞(CSC)的作用机制虽不清楚，但Rakicidin A已被许多同行认为是一个极富开发前景的抗乏氧肿瘤细胞及抗CSC药物。
发明人课题组于2006年在国内首先报道从微生物代谢产物中分离到Rakicidin A和B，并对Rakicidin B(FW523-3)的有关生物学活性进行了初步研究(文献1；江红，林如，程元 荣.海洋小单孢菌来源的轻快菌素B FW523-3的体外抗肿瘤活性.中国抗生素杂志,2008,33(9):531；文献2；Xie JJ,Zhou F,Li EM,Jiang H,Du ZP,Lin R,Fang DS,Xu LY.FW523-3,a novel lipopeptide compound,induces apoptosis in cancer cells.Mol Med Rep.2011，4(4):759-63)。
国内外有关RakicidinA、B的活性的报道仅见上述的抗肿瘤细胞及抗肿瘤干细胞活性，其他生物学活性未见报道。我们首次发现Rakicidins类化合物具有抗临床致病厌氧菌艰难梭菌等、抗耐万古霉素肠球菌等活性，值得进一步研发。
厌氧的艰难梭菌感染是医院内抗生素相关性腹泻的首要病因，甲硝唑、万古霉素、菲达霉素是目前用于艰难梭菌感染治疗的推荐药物，但艰难梭菌感染在甲硝唑或万古霉素治疗后的复发率均很高，迫切需要新的治疗药物。菲达霉素是一种可口服给药的新型大环内酯类抗生素，2012年在美国和欧洲获准用于治疗艰难梭菌感染。耐万古霉素肠球菌以及铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌已成为手术和伤口感染、肺炎、心内膜炎、脑膜炎、血源感染和截肢的主要致病菌，严重威胁着人类的健康和生命。肠球菌(屎肠球菌和粪肠球菌)广泛分布在自然界，常栖居人、动物的肠道和女性泌尿生殖系统，是人类的正常菌群之一。近年来，由于抗菌药物的广泛应用，使原本就对β内酰胺类、氨基糖苷类抗菌药物具有内在抗药性的肠球菌耐药性进一步扩大，逐渐形成了多重耐药菌。在我国，耐万古霉素肠球菌(VRE)感染的发生率呈逐年上升趋势，VRE已成为医院感染的重要病原菌之一。在需氧革兰阳性球菌中，肠球菌是仅次于葡萄球菌的重要院内感染致病菌，可引起泌尿道感染、腹腔感染、盆腔炎和心内膜炎，严重时可导致脓毒症，病死率达21.0％～27.5％。因此开发抗VRE的临床药物具有一定前景。
技术实现要素：
本发明公开了一个Rakicidins类化合物，命名为Rakicidin B1，结构式如下：
本发明的化合物RakicidinB1通过微生物发酵获得，其具有抗乏氧肿瘤细胞活性、抗临床致病厌氧菌和抗耐万古霉素肠球菌活性。
本发明公开了一个小单孢菌菌株，简称：FIM02-523，分类命名：Micromonospora sp.FIM02-523.其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.12132。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日：2016年2月18日。从福建省莆田海滩土中获得。
小单孢菌株FIM02-523通过微生物发酵可以制备得到RakicidinB1。制备方法如下：
将保藏编号为CGMCC No.12132的小单孢菌菌株FIM02-523进行发酵，发酵液离心，获得菌丝渣，菌丝渣用乙醇浸泡得到乙醇浸泡液，乙醇浸泡液进行HP20大孔树脂吸附柱层析，60％-80％乙醇水梯度洗脱，得到洗脱液1，洗脱液1进行NM200树脂吸附柱层析，55％-80％乙醇水梯度洗脱得到洗脱液2，洗脱液用水稀释后，用乙酸乙酯萃取，浓缩获得粗品用甲醇溶解，进行中压反相C18柱层析，60-90％乙腈水梯度洗脱，分部收集，用HPLC检测收集液，即得。
药效学实验证明，本发明的化合物RakicidinB1具有抗乏氧肿瘤疾病、抗厌氧菌相关疾病、抗耐万古霉素肠球菌等活性。
本发明的化合物其药学上可接受的盐与化合物具有同样的药理功效。
本发明还提供了一种药物组合物，其中含有本发明化合物和药学上可接受的载体。所述药物组合物可以是普通片剂或胶囊、缓释片剂或胶囊、控释片剂或胶囊、口服液、注射剂等制剂学上常规的制剂形式。
一般地，本发明化合物用于治疗时，人用剂量范围为1mg～5000mg/天。也可根据剂型的不同和疾病严重程度，使用剂量超出该范围。
下面是本发明化合物RakicidinB1的生物活性试验及结果：
一、抗肿瘤活性测试
分别将Rakicidin B1样品溶解在DMSO中使得溶度达到1mg/ml，再分别稀释使得终浓度为0.75ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.1ug/ml、0.05ug/ml、0.005ug/ml、0.0025ug/ml。
普通培养：取处于指数增长期的人肠癌细胞HCT-8、人食管癌细胞ECA109分别种在96孔板里(细胞浓度为105个/ml，100ul/孔)，培养24hr使其贴壁，加100ul/孔带药新鲜培养基,每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对照，同样设3个复孔。继续培养至72hr，终止培养。
乏氧培养：取处于指数增长期的人肠癌细胞HCT-8种在96孔板里(细胞浓度为105个/ml，100ul/孔)，乏氧通气30分钟，关闭通气阀门，放入培养箱37℃，培养24hr使其贴壁，加 100ul/孔带药新鲜培养基,每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对照，同样设3个复孔。乏氧通气30分钟，关闭通气阀门，放入培养箱37℃，继续培养至72hr，终止培养。
SRB检测：将终止培养的细胞，每孔加10％TCA 50ul，4℃条件固定1hr。用蒸馏水冲洗5遍，自然晾干后每孔加入4mg/ml SRB溶液50ul，室温下染色30min，弃上清，用1％乙酸冲洗5遍以去除非特异性结合的染料。每孔加入150ul 10mM Tris溶液，震荡5分钟，在540波长下酶标仪测OD值，并计算抑制率。通过对抑制率的换算,使用SPSS软件计算出IC50值。结果见表1.
表1 RakicidinB1的乏氧肿瘤细胞毒性
上述结果表明本发明化合物Rakicidin B1具有强效抗肿瘤活性特别是抗乏氧肿瘤细胞活性，且对乏氧培养的肿瘤细胞HCT-8活性较常氧的强15倍。
二、抗致病厌氧菌活性测试
化合物RakicidinB1在DMSO中溶解成0.64mg/ml。其测试浓度为：128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125μg/ml。测试所剩溶液将放置于-20℃。抗生素非达霉素和甲硝唑作为参照化合物。2×溶液的配制：最高浓度为256μg/ml，紧接着在96深孔板中经过10次的两倍稀释，得到所需的2×溶液。用工作站分装100μl到96孔圆底板。第12列是阴性对照，仅含相同体积的培养基。
细菌接种物的准备：提前1天(好氧菌)或2-3天(厌氧菌)在相应生长平板上[培养基:好氧菌,CAMHB(cation adjusted Mueller-Hinton medium，离子调节的米勒辛顿培养基；厌氧菌,Brucella broth supplemented with hemin(5g/mL),Vitamin K1(1g/mL),and lysed horse blood(5％v/v)]接种。实验当天将细菌浓度调到约1-2×106CFU/ml，然后转移100μl到96-孔圆底板中([0056]中准备的加有化合物的96孔板)。
MIC测定：对于好氧菌，将以上得到的96-孔圆底板放置于37℃，85％湿度，大气条件下培养20小时；对于厌氧菌，将以上得到的96-孔圆底板放置于37℃，85％湿度条件下，厌氧条件下培养46-48小时。细菌生长被完全或明显抑制的浓度点将被定义为该化合物的MIC。结果 见表2
表2.RakicidinB1抗菌活性
*质控菌
抗菌测试结果表明RakicidinB1具有抗艰难梭菌、艰难梭菌耐药菌、消化链球菌、痤疮丙酸杆菌等临床致病厌氧菌活性，活性与菲达霉素相当；RakicidinB1还具有抗耐万古霉素肠球菌的活性，活性强于菲达霉素，是其8倍。
具体实施方式
实施例1
RakicidinB1的制备
步骤一：小单孢菌菌株FIM02-523的发酵培养条件参照文献(江红，林如，郑卫，等.海洋青铜小单孢菌FIM02-523产生的脂肽类化合物FW523的分离鉴别和生物学活性[J].中国抗生素杂志,2006,31(5):267-270)。
步骤二：将步骤一所得的FIM02-523发酵液通过4500rpm离心15min后，获得菌丝渣，把获得的菌丝渣用2倍体积的无水甲醇或乙醇过夜浸泡2次，将含有酒精的菌丝渣再次以4500rpm离心15min后将上清液合并，得到发酵提取液。
步骤三：HP20大孔树脂吸附柱层析(径高比为1:5～1:10，装柱体积1.5-2.5L)：采用的发酵提取液(40-60L)以50％-55％的酒精浓度，流速为40ml/min进行上柱吸附；吸附完全后，以浓度60％-80％的酒精进行梯度洗脱，用HPLC检测洗脱液1，合并含有Rakicidin B1的相同组分(30L)。
步骤四：步骤三洗脱液进行NM200树脂吸附柱层析(径高比为1:2～1:10，装柱体积1-2L)：将步骤三洗脱液以50％-55％的酒精浓度，流速为40ml/min，进行上柱吸附；吸附完全后，以浓度55％-80％的酒精进行梯度洗脱，用HPLC检测洗脱液2，合并含有Rakicidin B1的相同组分(25L)。
步骤五：步骤四洗脱液2经过一倍体积水稀释后，用等体积乙酸乙酯萃取2次，减压浓缩，得粗品。
步骤六：将步骤五获得的粗品，用甲醇溶解，进行中压反相C18柱层析(径高比1:3～1:10)，流速30ml/min，以浓度为60％-90％乙腈-水梯度洗脱，分部收集，用HPLC检测收集液，合并相同组分。
所述的小单孢菌FIM02-523于2016年1月藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12132。
化合物Rakicidin B1:白色无定型粉末。溶于氯仿、甲醇、DMSO，不溶于水。高分辨质谱(HR-ESI-MS)显示其分子离子峰[M+H]+为621.1175，推断其分子式为C33H56N4O7，不饱和度为8。13CNMR和DEPT135显示该分子含有33个碳信号，包括5个季碳(δC 172.6,172.4,169.2,167.6,165.9)，4个双键碳[包含一个sp2亚甲基碳，两个sp2次甲基碳(δC 138.4,118.8)]，6个sp3次甲基碳[包含两个连氧碳原子(δC 78.0,72.4)]，13个sp3亚甲基碳和5个甲基碳原子(δC 36.5,19.1,15.4,13.2,11.2)。1HNMR显示该化合物有4个双键质子[δH 6.87(1H,d,J＝15.0Hz),6.16(1H,d,J＝15.0Hz),5.44(1H,s),5.32(1H,s)],5个可交换质子[δH8.88(1H,s),8.05(1H,d,J＝9.9Hz),7.31(1H,s),7.28(1H,s),5.66(1H,d,J＝6.0Hz)],5个甲基质子[δH 2.95(3H,s),1.05(3H,d,J＝7.0Hz),0.93(3H,d,J＝6.9Hz),0.83(3H,t,J＝7.0Hz),0.81(3H,d,J＝6.7Hz)]。所有的氢质子通过HSQC谱1H–13C相关进行指认。1H–1H COSY相关谱和质子的耦合常数显示该化合物含有4个独立的自旋耦合体系：NH-2–C-2–C-3–OH-3,C-9–C-10,C-31–C-14–C-15–C-16(C-32)–C-17–C-18和C-26–C-27–C-28(C-33)–C-29–C-30。结合1H–1H COSY和HMBC可知，H-2与C-1/C-5相关，H-3与C-4相关，OH-3与C-2/C-3相关，Ha-6 与C-5/C-7相关，H3-7与C-6/C-8相关，H-9与C-8/C-11相关，H-10与C-8/C-11相关，Hb-12与C-10/C-11相关，H-15与C-1相关，H3-30与C-28/C-29相关，H3-31与C-13/C-14/C-15相关，H3-32与C-15/C-16/C-17相关，以及H3-33与C-27/C-28/C-29相关，氢和碳的化学位移列于下表：