一种膜蛋白ENTs跨膜转运ODNs的试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种膜蛋白ENTs的跨膜转运ODNs的试剂盒及方法。

背景技术：

过去的数十年，基因治疗领域取得了长足的进展。ODNs(寡聚脱氧核糖核酸)，一种单链DNA分子，在基因治疗领域有广泛的应用。它既能够通过反义的方式结合mRNA使其降解导致基因沉默，也可结合microRNA来调节某些基因的表达。

在基因治疗中，如何将携带基因信息的核苷酸链转运进入细胞发挥功能是重中之重。首先一般细胞本身具有一种温度依赖、结构特异、饱和的方式-吞噬来主动摄取核酸大分子，但是由于核酸的大分子和多聚阴离子特性使其自身的转运效率较低，导致其在临床上的运用受到限制。其次人们常使用病毒载体来转运核苷酸链，慢病毒和腺相关病毒是常用的高效转运方法。其基本原理是将病毒本身的致病基因去除，保留部分功能基因并联接目的基因片段，重新组装到病毒衣壳中，使其感染细胞，目的基因随后进入细胞，或者整合到宿主基因组中，或者停留在胞浆中利用宿主的蛋白表达系统翻译出目的蛋白行使其功能。在非病毒转运系统中，如电转染，核转具有很高的效率，其原理主要是通过短暂的高压电流使细胞膜暂时出现物理的空隙，带负电的核酸分子在电场中快速移动穿过细胞膜进入胞浆和细胞核，目的基因利用宿主的蛋白表达系统翻译出目的蛋白行使正常功能。

目前基因治疗的方法日新月异，但至今仍没有一种简单易行的方法适合于临床。细胞本身具有吞噬核酸大分子的功能，但其缺点是不同种类的细胞吞噬能力有强弱之分，而且核酸分子进入吞噬途径后由于溶酶体酶的降解作用导致核酸浓度戏剧性降低，很难有治疗浓度的核酸能够进入胞浆或胞核发挥作用，因此很难用于临床。病毒载体转染效率高，但缺点是临床安全性问题。慢病毒载体可能由于基因整合到原癌基因旁导致白血病发生；腺相关病毒很少整合到宿主基因组中，但仍有可能插入整合导致肿瘤发生以及病毒颗粒诱导T细胞免疫反应，因此病毒载体用于临床也受严格限制。在非病毒转染体系中，电转和核转具有很高的效率，但细胞在高电压环境中活性损伤很大，而且临床应用受到限制。因此找到一种非载体介导的不同于吞噬的基因转运方式并研发其配套试剂盒极具挑战和临床应用前景。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种涉及膜蛋白ENTs的跨膜转运试剂盒及方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述膜蛋白ENTs跨膜转运试剂盒中包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A为质量百分比浓度为1％—2％的甲醛；所述试剂B为质量百分比浓度为3％—7％的EG或质量百分比浓度为3％—7％的DEG或质量百分比浓度为3％—7％的PEG200；所述试剂C为浓度为FAM标记的ODNs(本文以400nmol/L—600nmol/L的胸腺嘧啶脱氧核糖核酸T50为例)。

优选地，所述试剂A为质量百分比浓度为1.5％的甲醛；所述试剂B为质量百分比浓度为5％的EG或质量百分比浓度为5％的DEG或质量百分比浓度为5％的PEG200；所述试剂C为浓度为500nmol/L的被FAM标记的单链胸腺嘧啶脱氧核糖核酸T50。

基于上述试剂盒的膜蛋白ENTs跨膜转运ODNs的方法，标记100μL细胞时所述方法包括如下步骤：

(1)向100μL细胞浓度为0.5×10⁶/ml—1.5×10⁶/ml的细胞悬浮液中加入0.5—1.5mL试剂A，孵育5—10min，用PBS洗涤后去掉上清，得沉淀A；

(2)向沉淀A中加入0.5—1.5mL试剂B，孵育5—10min，用PBS洗涤后去掉上清，得沉淀B；

(3)向沉淀B中加入80—120μL试剂C，孵育5—10min，用PBS洗涤后去掉上清，得沉淀C；

(4)向沉淀C中加入400—600μL PBS，将沉淀C重悬后经流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞的荧光信号。

下面结合可能的原理对本发明作进一步说明：

本发明通过小分子量的试剂对细胞进行处理，试剂B(EG\DEG\PEG200)是一类具有两亲性的小分子量化合物，它既能溶与水，也能与有机溶剂互溶，而蛋白质也是由极性氨基酸和非极性氨基酸组成，因此它易与蛋白质的不同结构互相作用，其结果是造成蛋白质构象变化。随着分子量不同，它与蛋白质作用的结果是不同的，低分子量时，它倾向于将蛋白质解构，高分子量时倾向于使蛋白质结构更稳定。试剂B结构简单，空间位阻小，该试剂改变了膜蛋白ENTs的结构和功能，使其具有跨膜转运单链ODNs的能力，且反应迅速，耗时短。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)使用的试剂分子量小，空间位阻小，反应迅速，等待时间短；

2)试剂B的应用戏剧性的提高了这种跨膜转运效率，但试剂B不参与转运，他像一把钥匙打开了一扇门，让荧光标记试剂C通过膜蛋白ENTs进入细胞浆或细胞核。

3)常规的病毒转染方法需要构建病毒载体，耗时，方法繁琐，本发明使用的试剂分子量小，配置简单，处理时间短，无外源载体和病毒基因的导入，跨膜转运反应迅速，效率高。

4)常规的电转和核转需要使用特殊设备，而本发明通过改变细胞膜蛋白ENTs的状态，达到转运单链ODNs的效果，无特殊设备的投入，简单方便易行。

总之，本发明所述的试剂盒及方法，耗时短(10-20分钟)，转运效率高(>90％)，没有外源病毒基因的导入，无需特殊设备的投入，简单方便，高效易行，极具临床应用前景。

附图说明

图1是FSC-SSC散点图，其对象是有核细胞，通过R1设门，去除碎片杂质等干扰，以获得较为纯净的细胞群进行分析，图2-5均为通过R1设门后获得纯净细胞群来分析的；

图2为直方图，横坐标为无荧光标记的荧光通道1，纵坐标为细胞计数，该图显示的是未进行荧光标记的细胞，其目的是给后续图中的荧光标记的细胞进行对照；

图3为直方图，横坐标为试剂C，纵坐标为细胞计数，该图显示的是未通过试剂A和试剂B处理的细胞，其目的是显示未处理细胞与试剂C的非特异性结合，给后续图中的荧光标记的细胞进行对照；

图4为直方图，横坐标为试剂C，纵坐标为细胞计数，该图显示的是通过A试剂和B试剂处理的细胞，其目的是显示处理后的细胞与试剂C的特异性结合；

图5为共聚焦结果图，其中图A为空白对照，图B为T50-FAM；

图6为阻断实验流式结果图；

图7为阻断实验共聚焦结果图；其中，图A为空白对照，图B为双嘧达莫，图C为T50+双嘧达莫(在T50-PE后加)，图D为T50+双嘧达莫(在T50-PE前加)。

具体实施方式

实施例1

所述膜蛋白ENTs跨膜转运ODNs的试剂盒中包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A为质量百分比浓度为1.5％的甲醛；所述试剂B为质量百分比浓度为5％的EG或质量百分比浓度为5％的DEG或质量百分比浓度为5％的PEG200；所述试剂C为浓度为500nmol/L的被FAM标记的单链胸腺嘧啶脱氧核糖核酸T50。

实施例2

基于实施例1所述试剂盒的膜蛋白ENTs跨膜转运ODNs的方法，标记100μL细胞时所述方法包括如下步骤：

(1)取离体的白血病细胞，淋巴细胞分离液分离30分钟，吸取白细胞层，PBS洗涤2次；

(2)调整白细胞悬浮液中白细胞浓度为1×10⁶/ml；取3管流式管，各加入100ul细胞，第1管不做处理作为空白对照，第2管不做处理但加入100ul试剂C，孵育5-10分钟，用PBS洗涤2次，去上清；第3管中加入1mL试剂A，孵育5—10min，用PBS洗涤2次后去掉上清，得沉淀A；向沉淀A中加入1mL试剂B，孵育5—10min，用PBS洗涤2次后去掉上清，得沉淀B；向沉淀B中加入100μL试剂C，孵育5—10min，用PBS洗涤2次后去掉上清，得沉淀C；

(3)向第1管、第2管和第3管中均加入500μL PBS，将管内沉淀重悬后经流式细胞仪或荧光显微镜检测细胞的荧光信号。

流式结果见图1至图4，共聚焦结果见图5。上述实验只说明了T50-FAM的确通过细胞膜进入细胞，但为了证实T50-FAM是经过ENTs跨膜转运进入的，我们另外用ENTs的阻断剂双嘧达莫(dipyridamole)进行了阻断实验，流式结果如图6，共聚焦结果见图7。