一株高发酵活性和产香特性突出的冰酒酵母及其应用的制作方法

本发明涉及一株酵母及其应用，具体的，涉及一株高发酵活性和产香特性突出冰酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。

背景技术：

冰酒是用自然冰冻的葡萄酿造的浓甜葡萄酒，冰葡萄汁一般含有35～42°Brix的可溶性固形物(糖、酸、含氮化合物)。酵母菌在冰酒酿造中起着关键性的作用，负责在这种高糖和高渗环境中将糖转化成酒精，最终获得一款香气浓郁，口感独特的浓甜葡萄酒。

决定葡萄酒品质特征的优劣很大程度上取决于其香气和口感。其中葡萄酒香气的产生是多种化合物相互作用的结果，其主要来源有三个：葡萄果实本身的品种香气，发酵期间由微生物代谢而产生的发酵香气以及在陈酿期间经过橡木桶等处理所产生的陈酿香气。其中发酵香气的产生是一个极其复杂也极为重要的过程，在这个过程中，有多种酵母菌株参与，包括酿酒酵母和非酿酒酵母。其中酿酒酵母起着重要的作用。酿酒酵母菌在发酵过程中不仅仅将葡萄果实中的葡萄糖转化为酒精，同时还产生了许多对葡萄酒最终的口感和香气有重大贡献的复杂代谢产物。因此，往往是参与发酵的酵母菌的种类决定了葡萄酒的最终品质。香气是决定冰酒质量重要的因素之一，其中发酵香气中的酯类物质赋予了葡萄酒独特而又复杂的果香味，是其香气构成的关键成分。酯类物质主要分为醋酸酯类化合物和乙酯类化合物。醋酸酯类主要有乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、2-苯乙酸乙酯等，其中乙酸乙酯赋予葡萄酒水果香味，乙酸异戊酯赋予葡萄酒类似香蕉味，它们因相对含量较高，对葡萄酒香气影响最大。乙酯类碳链长度一般在C4～C10之间，它们使葡萄酒具有迷人的果香味，如丁酸乙酯赋予葡萄酒类似草莓味，己酸乙酯赋予葡萄酒类似青苹果味。葡萄酒中存在的各种酯类化合物，构成比例协调，对香气的形成有协同增效作用，单一的酯含量过高或者过低对葡萄酒品质均有不利影响。

冰酒与普通干红葡萄酒相比，其发酵具有原料高糖，高酸环境、且发酵过程要求低温等特殊环境，高糖环境给酵母菌发酵带来了种种困难：酵母需要更长的时间来适应环境使得发酵变得迟缓(通常达到目标酒度可能需要一个多月的时间)；高渗透压使酵母细胞失水收缩；酵母生物量减少、生长缓慢、糖的代谢率下降；酵母为了应对高渗透压会代谢糖产生过多乙酸，影响冰酒的品质，研究发现，影响冰酒挥发酸含量升高的最主要因素是酵母菌株。因此，在这种特殊环境下为保证生产出品质优良的冰酒，对酵母菌株的选择提出的要求也更加严格。除了满足一般性质外，冰酒酵母还应具有以下重要特性：(1)酵母的耐渗透压能力较高：只有耐渗透压的酵母才能在含糖量高于30％以上的葡萄汁中较快的开始发酵，并产生10％～13％(v/v)的酒度；(2)对低温的耐受性能：葡萄酒的风味化合物在室温条件下比较容易挥发。在这些化合物中，酯类物质赋予了葡萄酒花香和水果香味。在正常的发酵温度范围内，发酵温度越低，风味物质的损失越少(李记明等，2010)。

目前，虽然欧洲葡萄酒生产国的一些酒庄仍采用自然发酵法酿造葡萄酒，但是这种发酵方式具有起酵慢，产品质量不易控制以及不适宜大规模工业生产等缺点。因此，近些年，许多葡萄酒生产国家，如澳大利亚、南非、美国都改变了传统的自然发酵方法，开始利用筛选的酵母进行纯种发酵，这样不但可以提高生产效率并且使酒的酿造便于控制，保证安全高效生产，更为重要的是这些本土酵母菌株能够产生一些凸显产地葡萄酒独特感官特征的风味物质，从而赋予当地葡萄酒独特的质量和风格。我国在葡萄酒酵母的研究利用方面还处于起步阶段，我国葡萄酒厂广泛采用活性干酵母进行接种发酵，酿造冰酒的酵母大多从国外引进，而且多是一些广适性的商业酿酒酵母，缺乏适应品种与产地特色的冰酒专用酵母。这不仅是对本土酵母资源的漠视，更为重要的是长期使用活性干酵母进行酒精发酵，会对本土酵母生物多样性产生负面影响，最终导致产品同质化，缺乏地域特征。随着我国葡萄酒产业的快速发展，加强我国酿酒酵母资源的开发与利用已迫在眉睫。着眼于当地野生菌种资源，筛选出具有独特发酵特性的酵母，以期开发出更多的体现区域特色的酵母菌株已成为了当今葡萄酒产业的趋势。

技术实现要素：

本发明的目的，旨在填补我国冰酒专用酵母资源研究的空白，提供一株产香能力强，特别是高产酯类的野生型冰酒酵母及其在冰酒生产中的应用。

本发明提供的高产酯类的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具体为YSL16010，已于2016年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12349。

所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSL16010经过48h固体YEPD培养基上生长的菌落为圆形、乳白色、有光泽，其边缘整齐，菌体粘稠，易挑起(如图1所示)；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油状(如图2所示)；

本发明选用产自辽宁省桓仁县葡萄原产区的威代尔(Vidal)冰葡萄汁在低温下(16℃)自然发酵过程中，在发酵不同阶段取样，稀释分离后涂布平板，获得大量葡萄酒酵母单菌落。从中选取数株酵母进一步筛选、鉴定并进行小型发酵试验对比得到一株发酵性能良好，产香能力强的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编号为YSL16010。

利用本发明提供的酿酒酵母生产出的冰葡萄酒优点在于，与商业的活性干酵母DV10(DV10，法国拉曼公司生产，常用于冰酒酿造)相比，其启动发酵所用的时间短，发酵速度较快，在高糖的环境下仍能保证产乙酸量在1.6g/L以下，大大改善了高糖环境下产生高挥发酸的冰酒生产现状，与此同时，其具有更强的产香能力，特别是酯类物质，由该酵母产生的酯类物质的总含量达到152.6mg/L，比对照商业酵母高出近50mg/L，其中乳酸乙酯，辛酸乙酯，乙酸乙酯，癸酸乙酯和十二酸乙酯明显高于商业对照，赋予了冰酒更加丰富的果香和奶香味。

附图说明

图1为酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YSL16010号在WL营养琼脂上的菌落形态。

图2为酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YSL16010号在WL营养琼脂上的菌落形态。

图3自筛酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YSL16010与商业酵母DV10细胞生长曲线(a)及糖消耗曲线(b)。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中YEPD固体培养基配方如下：

葡萄糖，20g/1000mL；蛋白胨，20g/1000mL；酵母提取物，10g/1000mL；琼脂，20g/1000mL；自然pH值，121℃，灭菌15min。

下述实施例中WL营养琼脂培养基配方如下：

酵母抽提物，4g/1000mL；胰蛋白胨，1g/1000mL；葡萄糖，50g/1000mL；KH2PO4，0.550g/1000mL；KCl，0.425g/1000mL；CaCl2，0.125g/1000mL；MgSO4，0.125g/1000mL；FeCl3，0.0025g/1000mL；MnSO4，0.0025g/1000mL；溴甲酚绿，0.022g/1000mL；pH＝6.5。

实施例1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSL16010号分离、纯化及其鉴定

将来自桓仁产区的威代尔冰葡萄汁在酒厂小型发酵罐，未巴士杀菌的威代尔冰葡萄汁加入到至80％的体积，通过冷却水循环系统控制发酵罐内的发酵温度为16℃，每隔3d进行内部循环，共发酵40d，在发酵不同阶段取样，发酵大致被分为前中后三个时期，大致划分为前10天，中间20天，后10天，在这三个阶段内隔2d取一次样，，进行梯度稀释(10^-4,10^-5,10^-6)后涂布WLN培养平板，获得大量葡萄酒酵母单菌落，从中挑选出在平板内长势比较好，生长较快，具有明显的形态特征，形成了较完整的单一菌落的116株。对获得的菌株进行菌落形态以及分子生物学鉴定(5.8S-rDNA ITS方法)，共鉴定出21株酿酒酵母和26株非酿酒酵母。对其中10株酿酒酵母各种酿造特性进行研究，在500ml三角瓶中进行发酵初筛，将10株酿酒酵母分别在冰葡萄汁中以1×10⁶CFU/mL的接种量接种，16℃发酵静置培养40d，主要对其发酵能力的指标进行了监测，通过监测糖耗曲线，观察每次取样之间的糖消耗量，来判断发酵的进程，看斜率的大小来评判能力的强弱，发酵的快慢，筛选出发酵能力较强的一株酿酒酵母，编号为YSL16010。

该菌株经过形态学观察、5.8S-ITS rDNA基因扩增及PCR产物的RFLP分析和26s rDNA D1/D2区进行扩增测序，后对所有鉴定结果综合分析后。具体鉴定结果如下：

形态学观察方法和结果：经过48h培养，YSL16010号菌株在YEDP固体培养基上生长的菌落为乳白色，圆形，有光泽，边缘整齐，粘稠，易挑起(如图1所示)；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油状(如图2所示)。

5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析鉴定方法和结果：

酵母的核糖体5.8S rDNA及两侧的转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)具有显著的种间差异性，可作为鉴别酵母菌种的分类依据，采用5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析两种分子生物学方法对菌株进行鉴定。具体方法如下：

①酵母菌基因组DNA的提取：首先采用酵母菌基因组DNA提取试剂盒提取酵母菌的基因组DNA。

②酵母菌株5.8S-ITS rDNA的PCR扩增：PCR扩增所用引物为ITS1(SEQ ID NO.1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(SEQ ID NO.25'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，由上海生物工程技术服务有限公司合成；PCR扩增条件为95℃×5min；94℃×1min,55.5℃×2min，72℃×2min，35个循环；72℃×10min；PCR扩增体系(50μL)的组成为：模板DNA 3-5μL，10×PCR反应缓冲液5.0μL，10μM引物0.5μL，10mM dNTPs 1μL，Taq DNA聚合酶1U，ddH2O补充体系至50μl，混匀。随后对PCR扩增产物进行检测：取10μL PCR扩增产物点样于1％琼脂糖凝胶上，电泳缓冲液为1×TAE，120V电压下，电泳40min，溴化乙锭(EB)染色后，由凝胶成像系统对电泳图谱拍照并进行分析，采用D200DNA Marker判断PCR扩增产物的大小。

③酵母菌株5.8S-ITS rDNA的RFLP分析：5.8S-ITS rDNA的PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后，分别用CfoI、HaeⅢ和HinfⅠ(Fermentas,American)三种限制性内切酶37℃酶切1.5h；12μL的酶切体系内含10μL PCR纯化产物，1μL 10×Buffer和1μL内切酶；加1.2μL 10×loading Buffer终止酶切，之后取10μL酶切产物于2％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液中，100V电压下电泳45min，EB染色后，凝胶照相，最后与标准酶切图谱对照，在种的水平上鉴定待测酵母菌株。

引物：ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)

ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)

使用以上引物对分离的代表性菌株的5.8S-ITS rDNA区扩增，所得的产物大多为450-880bp之间。使用CfoI、HaeIII和HinfI进行酶切，所得酶切图谱共有20个类型，将酶切图谱与Guillamon和Esteve-Zarzoao等人建立的标准酶切图谱进行对照鉴定。酵母菌株YSL16010号的5.8S-ITS rDNA-RFLP方法鉴定的酵母菌株的酶切数据如表1所示。与对照菌DV10菌株的5.8S-ITS rDNA-RFLP酶切图谱进行比较，证明YSL16010号为酿酒酵母。

表1 酵母菌株5.8S-ITS rDNA PCR扩增产物大小及限制性内切酶酶切图谱

26s rDNA D1/D2区扩增测序分析鉴定方法和结果：

①酵母菌基因组DNA的提取：同上。

②酵母菌株26s rDNA D1/D2的PCR扩增：26s rDNA D1/D2扩增引物使用引物为NL1(SEQ ID NO.3 5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3)和NL4(SEQ ID NO.4 5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3)，PCR循环为95℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min20s；循环36次；72℃保温8min。PCR反应体系(50μL体系)；10×PCR bufeer 5μL，25mM MgCl2 6μL；10mM dNTPs 1μL；10μM引物各2.5μL；Taq酶2.0U，模板DNA 1μL；加ddH2O至50μL。随后对PCR扩增产物进行电泳检测：取5μL PCR扩增原液点样于1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯照射下初步确定是否扩出所要片段。扩增成功后，进行测序。

由上海生物工程技术服务有限公司进行测序，测序引物同PCR引物NL1和NL4；测序结果与国家生物技术信息中心上的数据库进行序列对比，对酵母菌是否为酿酒酵母菌株进行鉴定。

公司测定得到的序列如下：SEQ ID NO.5

5-CCAACGGGATTGCCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAA-3

采用三种分类鉴定方法对YSL16010号菌株进行鉴定，其鉴定结果与标准对照菌株相似度达99％以上，故可将YSL16010号鉴定为酿酒酵母新株。

实施例2、酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YSL16010号与商业酵母DV10酿酒效果对比实验

筛选得到的酿酒酵母YSL16010号和商业活性干酵母DV10在威代尔冰葡萄汁中的酿造特性的比较，具体方法如下所述：

将保存于-80℃的自筛野生型酿酒酵母YSL16010号和商业酿酒酵母DV10分别在YEPD固体和液体培养基上传代，按10⁵CFU/mL接种于3L威代尔冰葡萄汁中，16℃条件下静置培养40d。

首先，从YEPD平板上挑取培养过夜的自筛野生型酿酒酵母以及商业酿酒酵母DV10对照菌株分别接入装有100mL已灭菌液体YEPD培养基的三角瓶中，摇床(180rpm，28℃)培养24h，作为待接种的活化种子液。然后分别按照10⁵CFU/mL的接种量接种于装有3L威代尔冰葡萄汁的小型发酵罐(5L)中，初糖浓度420g/L，二氧化硫浓度60mg/L，以8层纱布封口覆盖，16℃条件下静置培养40d，至每日糖耗＜2g/d终止发酵，酿造得到冰酒。

按照下述方法检测威代尔冰葡萄汁中酿造特性：

发酵速率：DNS测定还原糖，监测糖消耗

乙醇：试剂盒法，乙醇测定试剂盒(Megazyme公司，爱尔兰)

果糖：试剂盒法，果糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)

乙酸、甘油：液相色谱法(GB/T 15038-2006)

酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量：用Agilent 6890气相色谱(GC)和Agilent5975质谱(MS)联用仪(Agilent，美国)检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件为：毛细管柱HP-INNOWAX Polyethylene Glycol60m×0.25mm×0.25μm(J&W scientific，美国)载气为高纯氦气，流速1mL/min；顶空固相微萃取手动进样，采用不分流模式，插入气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2min。质谱借口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式EI，离子能量70ev，质量扫描范围20-450amu(张明霞.葡萄酒香气变化规律研究——着重于关键酿造工艺对葡萄酒香气的影响[D].中国农业大学博士学位论文.2007)；

酿酒酵母YSL16010与商业酵母DV10在威代尔冰葡萄汁中酿造特性比较结果见图3、表1及表2。

(1)两株菌细胞生长和糖消耗曲线如图3所示。

如图3所示，相同发酵条件下，菌株YSL16010能够更快地达到生长旺盛期，特别是在启动发酵的5d后,菌株YSL16010菌体数急速增长，数量超过商业对照菌株DV10，并在很长一段时间内细胞总数稳定在较高的水平，体现出了很强的环境适应能力和较高的发酵活力。同时糖耗数据也进一步证明了菌株YSL16010的高发酵活性，虽然最终残糖量与对照DV10差别并不大，均维持在110～120g/L左右，但在酒精发酵初期和中期体现出的还原糖消耗速率明显高于商业对照DV10，表明YSL16010具有启酵快，发酵活性高的特性。

(2)菌株酒精发酵后葡萄酒样的理化指标见表1所示

表1 实验菌株酒精发酵后葡萄酒样的理化指标

(3)菌株主要挥发性香气成分种类和含量的比较，见表2所示

表2 酿酒酵母YSL16010号和对照商业菌株DV10酒精发酵后香气物质

经过摇瓶发酵和小型发酵罐实验(5L)，对得到的酒样进行了一系列理化成分的检测以及香气成分种类和含量的测定，从表1和表2的数据可以看出，YSL16010的酿造特性良好，主要发酵参数与对照相比没有很大差异。发酵在40d内结束，酒精度≥12％v/v，挥发酸1.54g/L≦2.1g/L，符合GB/T 25504-2010对冰葡萄酒酿酒微生物相关的各项指标要求，具有优良的酿造特性；综合指标比较，在发酵的10-25d YSL16010数目较商业酵母明显占优势，糖耗速率曲线可以显示，在5-25d，其糖的下降速率明显快于商业多对照，截至到25d比商业对照多消耗40g/L糖，体现了较强的发酵能力和速率；且由YSL16010所酿造得到的酒样其香气成分酯类的总含量明显高于商业对照DV10，总酯的产量≥152mg/L，属于高产酯类即产香特性突出的菌株，特别是其中乳酸乙酯、癸酸乙酯以及辛酸乙酯均显著高于商业对照，乳酸乙酯具有清甜的、带有酸味的水果香气，稀释后具有乳脂及菠萝味道，癸酸乙酯具有水果味，辛酸乙酯具有甜味，果香，奶香并伴有酵母气息，除此之外绝大多数的酯类都具有令人愉快的花香和果香。丰富的酯类物质与适量的高级醇产量与其它挥发性组分相配合使得冰酒的整体香气得到了更好的体现，同时也构成了冰酒香气的特殊性。由此可见，经过一系列实验优选得到的冰酒酿酒酵母YSL16010不仅能快速地完成整个冰酒的酿造过程使其符合国家标准，同时能够有效的改善冰酒香气，增加冰酒的香气的浓郁性和复杂性。

(3)小型发酵罐(5L)酿造的葡萄酒感官评定

针对小型发酵酿造酒样进行了专业的专家感官品评，十三名专家有来自国家级葡萄酒品酒师(一位)，来自国内高校多年从事葡萄酒研究的教授、副教授(各两位)，葡萄酒专业硕士、博士研究生(八人)，具有较高的权威性和合理性。各位品评人员对所试酒样给出的评分(取平均值)结果见表3所示。

表3 小型发酵葡萄酒感官评定评分结果(专家盲评)

从感官评定评分结果看出，综合葡萄酒的香气和口感等各项指标的综合指标，十位专家给予了由YSL16010菌株所酿造的冰葡萄酒更高的评价，认为其在整体品质上优于由商业对照DV10。认为其充分地体现了威代尔的典型品质，适口的同时香气更显浓郁怡人，给人带来愉悦的感觉，表现出了良好的酿酒品质。