一种HPV16E7单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及单克隆抗体制备领域，尤其涉及一种HPV16E7单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，是目前为已确认的致癌病毒。在我国妇女宫颈癌组织中HPV感染率大于95％，其中HPV 16是乳头瘤病毒中致病性最强、与宫颈癌发病关系最密切的型别。据国际癌症研究中心(IARC)统计，宫颈癌标本中，HPV16型感染占51.0％。HPV16感染相关的临床诊断主要依靠PCR为主的分子生物学方法，该方法具有设备、人员以及空间条件要求高、监测结果假阳性率高等缺点，在小型医院实施困难。研究表明HPV16E7在宫颈癌诊断中具有较高价值，HPV16E7是目前已经确立的与细胞转化密切相关的病毒癌基因，HPV16E7抗原的检测因其方法简单易行对于宫颈癌筛查及预防具有重要意义，因此制备一种特异性高的抗HPV16E7抗体对于HPV检测及宫颈癌预防意义重大。

技术实现要素：

本发明为解决现有技术中的上述问题，提供一种制备高特异性HPV16E7单克隆抗体的方法及其相关应用。

本发明第一个方面提供了一种HPV16E7单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，

包括以下步骤，

步骤一，HPV16E7基因扩增

利用HPV16阳性分泌物为模板进行PCR扩增，上游引物序列如SEQ NO.1所示，下游引物序列如SEQ NO.2所示；

步骤二，获得HPV16E7重组蛋白

利用回收步骤一获得的PCR产物进行HPV16E7表达载体构建及诱导表达，并进行HPV16E7重组蛋白的纯化；

步骤三，免疫

采用的抗原为所述步骤二中得到的纯化后的HPV16E7重组蛋白；

步骤四，细胞融合，得到杂交瘤细胞；

步骤五，对所述步骤四得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，得到特异性HPV16E7单克隆抗体杂交瘤细胞；

步骤六，利用步骤五所得的特异性HPV16E7单克隆抗体杂交瘤细胞制得HPV16E7单克隆抗体。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，述步骤一中PCR扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2μl，浓度为25mmol/L的MgCL2 1.5ul，dNTP 0.4μl，上下游引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.2μl，去离子水13.9μl；PCR扩增的反应条件为：94℃预变5min，94℃，45s→56℃，45s→72℃，45s，30个循环，72℃延伸7min。

优选地，上述步骤二中具体操作为：将回收得到的步骤一的PCR产物，连接至载体pMD18-T中，转化至感受态大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，测序正确后将质粒pMD18-T/18E6、pET28a(+)载体用BamH I、Xho I双酶切，16℃连接过夜，并将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)；0.1g/L卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，用终浓度为1mM IPTG 30℃200rpm振荡培养8h诱导重组蛋白表达；然后使用SDS-PAGE分析重组菌可表达HPV16E7蛋白，选取高效表达重组肽段的工程菌株扩大培养，加IPTG诱导目的蛋白的表达，收集菌体，超声破碎后4℃12 000g，离心20min收集上清；纯化超声裂解上清中的重组蛋白，用含有150mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，4℃平衡缓冲液透析除去咪唑，最终获得纯化的HPV16E7重组蛋白。

优选地，上述步骤三中的免疫为用纯化后的HPV16E7抗原免疫8周龄BALB/C小鼠，免疫方式为皮下多点注射，免疫剂量0.05mg/只，免疫间隔时间为2周，首次免疫加完全福氏完全佐剂，其后三次加福氏不完全佐剂进行免疫，最后用抗原水剂作冲击免疫。

优选地，细胞融合及杂交瘤细胞筛选冲击免疫3d后,取小鼠脾细胞与SP 2/0细胞融合，用HAT选择培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养。10d后，以HPV16E7为抗原包被的酶标板(10ng/孔)，间接ELISA法检测培养上清筛选阳性克隆，筛选到的阳性克隆继续进行有限稀释，直至所有孔均HPV16E7抗体阳性。

进一步地，本发明中小鼠腹水的制备操作为：取12周龄BALB/C小鼠5只。腹腔注射石蜡油。一周后将扩大培养后的阳性克隆以1×10⁶/只注入小鼠腹腔，经过一周，观察小鼠腹水产生情况，当小鼠腹腔产腹水后无菌抽取腹水，10 000g离心5min取上清。

进一步地，本发明单克隆抗体纯化过程为：取小鼠腹水2ml，逐滴加入2倍体积PBS，并用上样缓冲液(20mM PB缓冲液)透析过夜。透析后腹水10 000g离心10min取上清，经0.45μm滤膜过滤后以1.0ml/min的速度经过平衡再生后的Protien G亲和层析柱纯化，抗体用PH2.7的甘氨酸-HCL缓冲液洗脱，每1ml抗体加入100ul 1M，PH 9.0，甘氨酸-HCL缓冲液进行中和。

本发明第二个方面提供了一种根据上述的制备方法制备得到的HPV16E7单克隆抗体。

优选地，HPV16E7单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ NO.3所示；所述HPV16E7单克隆抗体的重链CDR2序列如SEQ NO.4所示；所述HPV16E7单克隆抗体的重链CDR3序列如SEQ NO.5所示；所述HPV16E7单克隆抗体的轻链CDR1序列如SEQ NO.6所示；所述HPV16E7单克隆抗体的轻链CDR2序列如SEQ NO.7所示；所述HPV16E7单克隆抗体的轻链CDR3序列如SEQ NO.8所示。

优选地，上述HPV16E7单克隆抗体的重链序列如SEQ NO.9所示；所述HPV16E7单克隆抗体的轻链序列如SEQ NO.10所示。

第三个方面，本发明还提供上述的HPV16E7单克隆抗体在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

最后一方面，本发明还提供一种检测HPV16E7的试剂盒，包括上述的HPV16E7单克隆抗体。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明从临床标本中克隆得到正确的HPV16E7基因序列，该基因经正确插入pET28a(+)原核表达质粒后，在IPTG诱导下在BL21(DE3)大肠杆菌中以可溶性蛋白形式有效地表达了HPV16E7融合蛋白，该蛋白带有His标签，经His金属亲和层析柱纯化后得到高纯度HPV16E7蛋白。并用该蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备抗HPV16E7抗体，该抗体经Western blot证实能够与HPV16E7特异性结合，对于HPV16E7抗原检测具有相当高的应用价值；本发明成功表达了HPV16E7抗原同时，制备了抗HPV16E7的单克隆抗体，可以特异性识别HPV16E7抗原，为研究该蛋白相关疾病的研究以及HPV16抗原检测方法的建立提供了重要的基础。

附图说明

图1HPV16E7基因扩增结果鉴定图；

图2重组菌表达HPV16E7蛋白鉴定分析图；

图3纯化HPV16E7抗体鉴定图；

图4抗HPV16E7抗体阳性细胞株重链、轻链PCR扩增鉴定结果图；

图5抗HPV16E7抗体与真核、原核表达HPV16E7的反应性实验结果图；

图6免疫组化鉴定抗HPV16E7抗体与各型HPV感染患者宫颈脱落细胞反应性的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种HPV16E7单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，

步骤一，HPV16E7基因扩增

利用HPV16阳性分泌物为模板进行PCR扩增，上游引物序列如SEQ NO.1所示，下游引物序列如SEQ NO.2所示；

步骤二，获得HPV16E7重组蛋白

利用回收步骤一获得的PCR产物进行HPV16E7表达载体构建及诱导表达，并进行HPV16E7重组蛋白的纯化；

步骤三，免疫

采用的抗原为所述步骤二中得到的纯化后的HPV16E7重组蛋白；

步骤四，细胞融合，得到杂交瘤细胞；

步骤五，对所述步骤四得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，得到特异性HPV16E7单克隆抗体杂交瘤细胞；

步骤六，利用步骤五所得的特异性HPV16E7单克隆抗体杂交瘤细胞制得HPV16E7单克隆抗体。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一HPV16E7抗原的制备

首先，进行HPV16E7引物设计与合成，根据NCBI发布的HPV16E7基因序列，设计一对特异性引物。上游引物(SEQ NO.1)：5’-CGCGGATCCATGCATGGAGATACACCTACATTG’(划线部分为BamH I酶切位点)；下游引物(SEQ NO.2)：5’-CCGCTCGAGCTATTATGGTTTCTGAGAACAGATG-3’(划线部分为Xho I酶切位点)。

然后，进行HPV16E7基因扩增，以HPV16阳性分泌物为模板进行PCR扩增。反应体系如下：10×PCR buffer 2μl，MgCL2(25mmol/L)1.5ul，dNTP 0.4μl，上下游引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.2μl，去离子水13.9μl；反应条件：94℃预变5min，94℃，45s→56℃，45s→72℃，45s，30个循环，72℃延伸7min，结果如附图1所示(注：M：marker；1：阴性标本；2：HPV16阳性标本)。

接着进行HPV16E7表达载体构建及诱导表达，PCR产物用琼脂糖凝胶(10g/L)电泳进行鉴定。回收PCR产物，连接至载体pMD18-T中，转化至感受态大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，测序正确后将质粒pMD18-T/18E6、pET28a(+)载体用BamH I、Xho I双酶切，16℃连接过夜，并将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)。0.1g/L卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，用终浓度为1mM IPTG 30℃200rpm振荡培养8h诱导重组蛋白表达。最后SDS-PAGE(浓缩胶50g/L，分离胶120g/L)分析重组菌可表达HPV16E7蛋白，如图2所示(注：M：marker；1：BL21/pET8a；2-3：BL21/pET8a/HPV16E7)。

最后进行重组蛋白的纯化，选取高效表达重组肽段的工程菌株扩大培养，加IPTG诱导目的蛋白的表达，收集菌体，超声破碎后4℃12 000g，离心20min收集上清。按照TALON金属亲和层析柱说明书纯化超声裂解上清中的重组蛋白，用含有150mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，4℃平衡缓冲液透析除去咪唑，并按照BCA蛋白定量检测试剂盒说明书进行蛋白质定量。

实施例二 抗HPV16E7单克隆抗体的制备

1)小鼠免疫利用实施例一中纯化后的HPV16E7抗原免疫8周龄Balb/C小鼠。免疫方式为皮下多点注射，免疫剂量0.05mg/只，免疫间隔时间为2周。首次免疫加完全福氏完全佐剂，其后三次加福氏不完全佐剂进行免疫，最后用抗原水剂作冲击免疫。

2)细胞融合及杂交瘤细胞筛选冲击免疫3d后,取小鼠脾细胞与SP 2/0细胞融合，用HAT选择培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养。10d后，以HPV16E7为抗原包被的酶标板(10ng/孔)，间接ELISA法检测培养上清筛选阳性克隆，筛选到的阳性克隆继续进行有限稀释，直至所有孔均HPV16E7抗体阳性。

3)腹水制备取12周龄Balb/C小鼠5只，腹腔注射石蜡油。一周后将扩大培养后的阳性克隆以1×10⁶/只注入小鼠腹腔，观察小鼠腹水产生情况，当小鼠腹腔产腹水后无菌抽取腹水，10000g离心5min取上清。

4)单克隆抗体纯化取腹水2ml，逐滴加入2倍体积PBS，并用上样缓冲液(20mM PB缓冲液)透析过夜。透析后腹水10000g离心10min取上清，经0.45μm滤膜过滤后以1.0ml/min的速度经过平衡再生后的Protien G亲和层析柱纯化，抗体用PH2.7的甘氨酸-HCL缓冲液洗脱，每1ml抗体加入100ul 1M，Ph9.0，甘氨酸-HCL缓冲液进行中和，得到纯化的HPV16E7单克隆抗体。

实施例三 抗HPV16E7单克隆抗体结构检测

SDS-PAGE检测

取实施例二中小鼠腹水5ul(加入4倍体积PBS稀释)以及纯化后抗体20ul，加入5×上样缓冲液5ul，沸水浴5min后进行SDS-PAGE电泳分离，最后加入考马斯亮蓝。纯化后抗体可见两条条带，分别位于55KDa(为抗体重链)、27KDa(为抗体轻链)，如图3所示(注：M：marker；1：腹水；2-3：抗HPV16E7抗体纯化后)。

PCR扩增检测

使用实施例二中阳性细胞株进行扩大培养后Trizol法提取RNA，逆转录后得到全基因组CDNA。设计引物对抗体重链、轻链分别进行PCR扩增。引物序列如表1。反应体系如下：10×PCR buffer 2μl，MgCL2(25mmol/L)1.5ul，dNTP 0.4μl，上下游引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.2μl，去离子水13.9μl；反应条件：94℃预变5min，94℃，60s→58℃，60s→72℃，60s，30个循环，72℃延伸7min。PCR产物用琼脂糖凝胶(10g/L)电泳进行鉴定，结果如附图4所示(注：M：marker；1-4：抗体重链；5-8：抗体轻链)。回收PCR产物，连接至载体pMD18-T中，转化至感受态大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，交由公司测序。经比对，PCR产物分别为抗体重链、轻链。

表1单克隆抗体基因测序引物表

实施例四 抗HPV16E7单克隆抗体功能鉴定

Weastern-blot检测

将Siha、Hela细胞以及诱导后BL21/pET28a/HPV16E7菌体进行SDS-PAGE电泳，用湿转印法将蛋白质转印至硝酸纤维膜上，50g/L脱脂奶粉封闭37℃1h，加入杂交瘤细胞株培养上清，4℃湿盒孵育过夜，用TBST(含有0.5％吐温-20的TBS)洗膜3次，每次5min，然后加入1∶2 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h，洗膜3次，ECL显色。结果显示该单克隆抗体可与Siha细胞以及诱导后BL21/pET28a/HPV16E7菌体特异性结合，如附图5所示(1：BL21/pET8a/HPV16E7；2：BL21/pET8a；3：Siha细胞；4：Hela细胞)。

免疫组化

将Siha、Hela细胞爬片、各型HPV感染患者宫颈脱落细胞进行细胞涂片后，用4％多聚甲醛进行固定，50g/L脱脂奶粉37℃封闭1h，杂交瘤细胞株培养上清，37℃孵育1h，PBS洗三次，每次5min，然后加入1∶1 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵1h，最后PBS清洗三次后DAB显色，苏木素染核。结果表明HPV16E7蛋白在HPV16阳性患者宫颈细胞以及Siha细胞中表达，在其他细胞中不表达，如附图6所示(注：A：HPV16阳性患者；B：HPV55、58阳性患者C：HPV58阳性患者D：HPV18阳性患者；E：HPV51阳性患者F：18、52、81阳性患者)。证明本发明制备的单抗可与HPV16特异性反应，可用于HPV16感染诊断。

通过上述实施例可知，本发明从临床标本中克隆得到正确的HPV16E7基因序列，该基因经正确插入pET28a(+)原核表达质粒后，在IPTG诱导下在BL21(DE3)大肠杆菌中以可溶性蛋白形式有效地表达了HPV16E7融合蛋白，该蛋白带有His标签，经His金属亲和层析柱纯化后得到高纯度HPV16E7蛋白。并用该蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备抗HPV16E7抗体，该抗体经Western blot证实能够与HPV16E7特异性结合，对于HPV16E7抗原检测具有相当高的应用价值；本发明成功表达了HPV16E7抗原同时，制备了抗HPV16E7的单克隆抗体，可以特异性识别HPV16E7抗原，为研究该蛋白相关疾病的研究以及HPV16抗原检测方法的建立提供了重要的基础。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。