本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及PCR扩增长序列的方法，尤其适用于难以设计较好引物或引物特异性较差的长片段目的序列的扩增。
背景技术：
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。其原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于PCR原理三步骤设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准的PCR反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。在实际实验过程中，由于许多待扩增DNA片段从已知上下游序列中设计(找到)的引物略差，常常存在发卡结构，二聚体或与其他位点产生错配(特别是所用DNA模板为总DNA时更易产生错配)。而且所需扩增的片段越长，影响越严重。所以难以得到目的产物或产物不纯(电泳检测无目的条带、有杂带或弥散带等)。较短片段的扩增普通的PCR较易实现，但片段越长，扩增的难度越大，失败率越高，效率越低。鉴于以上因素，在实验研究中迫切需要一种方法，能够降低长片段引物设计的难度，提高长片段扩增的成功率。提高实验效率。
技术实现要素：
(1)要解决的技术问题：
传统PCR反应三温度点法扩增长片段的成功率低，特异性低。难以得到目的产物或产物不单一(电泳检测中难以得到单一清晰的目的条带)。
(2)技术方案：本发明的退火温度及时间较传统的PCR反应程序有很大改变。传统的PCR扩增长片段的难度主要在于引物的非特异性结合(发卡结构，引物间的结合，引物与模板的错配等)。为提高特异性可以升高退火温度，而较高的退火温度使得引物与模板的结合难度升高，因此通过延长退火时间的方法使得引物得以结合到模板上。本发明根据大量实践证明当退火温度升高到Tm+4左右即接近引物与模板结合的极限(Tm+5℃)，且时间延长到5分钟以上时开始得到目的产物，但浓度极低。延长退火时间可使产物浓度升高，但延长时间超过7分30秒以后没有明显变化。证明7分30秒以足以支持引物在此温度下与模板的结合。
(3)本发明的有益效果：
1.本发明可有效的扩增传统PCR反应较难得到的长片段目的序列，且特异性高，浓度高。
2.本发明使得传统PCR无效的较差的引物也能得到扩增得到目的序列，使得PCR引物设计的需求标准大大降低，引物设计更加简单。
3.本发明使得A、T含量高或重复序列较多的序列得以通过较差的引物进行PCR扩增。
4.本发明可与其他有特殊要求或特殊用途的实验结合，可以得到广泛的应用方式。适用广泛的PCR实验技术。
5.本发明使得PCR扩增长片段序列的成功率大大提高，节省大量人力物力财力。
具体实施方式
退火温度可根据实验效果在此温度下小范围调整。反应循环数可根据结果适当调整。
本发明案例如下：
实施例1
针对柑橘木虱线粒体12S-CO1序列扩增，因线粒体序列A、T含量远高于G、C含量，且含有大量poly-A、poly-T和微卫星结构，特别是12S基因处难以设计引物，故实验过程开始时设计的多对引物，使用传统的PCR程序扩增时，均不能扩增出目的序列或杂带及弥散严重，不能分离出目的序列。多次设计、合成引物浪费大量的时间和资金。而改用本发明的方法后测试上述引物，均能扩增得到预计长度的序列，且产物单一，浓度极高。送至上海生工测序，测序结果良好，将所得结果比对近缘种证明是目的序列。
此处仅以一对引物详细说明具体步骤
F:5'ACAAGAGCGACGGGCAATG3'
R:5'GGTACAATAGGTGAAGAGAGGGGAT3'
该由上海生工合成Tm值分别为59.7和62.0。通过NCBI比对得知此对引物间约4000bp。故PCR扩增反应程序如下：
实施例2
针对黎氏青凤蝶线粒体COⅠ-COⅢ、COⅢ-ND5、ND5-CYTB、CYTB-12S、12S-COⅠ，5段2000～4000bp不等的长片段序列设计的引物，在传统PCR反应程序中结果无目的序列或只能得到非目的序列和目的序列严重混杂且不能测序的产物(电泳检测结果极差)，而改用本发明的方法进行PCR扩增上述5个长片段序列，使用这些引物均能得到预计长度的序列，且产物单一，浓度极高。送至上海生工测序，测序结果良好，将所得结果比对近缘种证明是目的序列。
该5个长片段的具体扩增步骤均与实施例1中相似，仅退火温度根据各引物的Tm值调整，延伸时间根据片段长度调整。
实施例3
针对青球萝纹蛾线粒体COⅠ-COⅢ、COⅢ-ND5、ND5-CYTB、CYTB-12S、12S-COⅠ，5段2000～4000bp不等的长片段序列设计的引物，在传统PCR反应程序中结果无目的序列或只能得到非目的序列和目的序列严重混杂且不能测序的产物(电泳检测结果极差)，而改用本发明的方法进行PCR扩增上述5个长片段序列，使用这些引物均能得到预计长度的序列，且产物单一，浓度极高。送至上海生工测序，测序结果良好，将所得结果比对近缘种证明是目的序列。
该5个长片段的具体扩增步骤均与实施例1中相似，仅退火温度根据各引物的Tm值调整，延伸时间根据片段长度调整。