本发明涉及利用微生物进行环境修复或食品污染物减除的领域，具体涉及一株可降解己烯雌酚的米曲霉。
背景技术：
：己烯雌酚（diethylstibestrol，简称DES）是一种人工合成的雌性激素类药物，是人造雌激素中作用最强的一种，由于其具有促进动物生长、增加蛋白质沉积和减少脂肪的作用，作为促生长剂被用作动物饲料添加剂，广泛应用于畜牧养殖业。20世纪70年代大量的动物试验证明在孕期服用DES会增加其后代患生殖道癌症的风险，如阴道和子宫颈透明细胞腺癌、阴道癌、子宫内膜癌、睾丸异常等。自从人们发现己烯雌酚具有致畸和致癌的毒性，世界上绝大多数国家禁止使用DES。中华人民共和国农业部发布的《2003年度动物性产品中兽药残留监控计划》中要求己烯雌酚不得在动物性食品中检出。由于DES是脂溶性物质，很难降解，易在人和动物脂肪及组织内残留，造成肝脏损伤。而且其排除体外后，会在水源和土壤等环境中富集，造成环境污染恶性循环，人体通过食用含有DES残留的动物产品也会增加患癌症的风险。近年来，降解或消除己烯雌酚备受关注。微生物降解法消除环境中有害化合物的研究很受重视。利用具有降解己烯雌酚特性的功能微生物来降解DES，有望实现环境中DES的有效去除，然而迄今关于降解DES的功能菌株报道不多。徐冉芳等从污泥中驯化、分离到1株能够有效降解DES的沙雷氏菌菌株。目前关于具有己烯雌酚降解能力的真菌或者食品来源的菌株，报道较少，本实验室先前从砖茶中筛选到一株具有具有较强降解作用的黑曲霉。本发明提供了一株来源于食品厂酱油曲的具有己烯雌酚降解能力的米曲霉。米曲霉是1989年美国食品药物管理局（FDA）和美国饲料工业协会（AAFCO）公布的44种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物（GRAS）”的菌种之一；同时其也在2013年我国农业部公告（第2045号）公布的饲料添加剂的菌种名单中。因此，本发明提供的黑曲霉菌株可为环境或农畜产品等食品中残留己烯雌酚的降解或去除提供良好的菌种资源。技术实现要素：本发明的目的是提供一株可有效降解己烯雌酚的菌株—米曲霉（Aspergillusoryzae）M-4。本发明所提供的降解菌株为米曲霉（Aspergillusoryzae）M-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.11645，保藏日期为2015年11月11日。所述米曲霉降解己烯雌酚的步骤如下。菌株M-4活化：挑取米曲霉M-4于PDA培养基上划线，28°C培养72h。菌株M-4降解己烯雌酚：用无菌生理盐水将PDA培养基上的孢子洗脱并混匀制备孢子悬液。移取1mL孢子悬液接种于装有29mLMM培养基（含0.2%吐温80）的250mL三角瓶中，加入己烯雌酚至一定浓度，以1mL生理盐水代替菌悬液为空白对照。培养温度28°C、转速180r/min下振荡培养，定时取样，提取己烯雌酚，采用HPLC测定己烯雌酚残留浓度，并计算降解率。所述微生物降解己烯雌酚体系中己烯雌酚的提取方法为：采用全量（整瓶培养液）取样方式，加入30mL的甲醇，于超声波清洗器（AS10200A）中超声提取30min；取2.0mL超声提取液于刻度试管中，用甲醇定容至10mL，混匀，取1.5mL样品12000r/min离心15min，上清液用0.45μm有机相滤膜过滤，弃去约0.5mL初滤液，收集续滤液为样品溶液，供HPLC分析用，仪器为LC-10A2010CHT型液相色谱仪。所述微生物降解体系中己烯雌酚的HPLC检测方法为：LC-10A2010CHT型液相色谱系统，色谱柱为SepaxGP-C18柱（150mm×4.60mm，5.0μm），流动相为甲醇:水（7:3，v/v），流速0.7mL/min，进样量10μL，检测波长242nm。本发明所用培养基为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：新鲜土豆去皮切块，称取200g，加入500mL蒸馏水煮沸20min，过滤，加葡萄糖20g，琼脂20g，再加蒸馏水至1000mL，121°C灭菌15min；基础盐培养基（MM）：硫酸铵1.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0，121°C灭菌15min。与现有技术相比，本发明的积极效果是：该米曲霉降解环境和食品中的己烯雌酚，具有菌源安全，降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为彻底清除环境和食品中残留的己烯雌酚提供了较好的资源。附图说明图1为降解菌株M-4处理前后己烯雌酚的HPLC谱图，图中0h为接种M-4含100mg/L己烯雌酚的MM培养基中0h取样处理的HPLC检测色谱图，5d为培养5d后取样进行HPLC检测得到的的色谱图。图2为降解菌株M-4对100mg/L己烯雌酚的降解曲线。图中，横坐标为培养时间（d），纵坐标为己烯雌酚降解率（%）。具体实施方式实例1：不同培养时间菌株M-4降解己烯雌酚的情况。种子液制备：挑取M-4菌种于PDA平板上划线，于28°C恒温培养箱中培养72h后挑取单菌落在PDA斜面培养基上划线，28°C恒温培养箱中培养72h；用无菌生理盐水将斜面培养基上的M-4菌苔洗脱并混匀制成种子液（孢子浓度约为108CFU/mL）。取1mL种子液接种于29mL（250mL三角瓶）己烯雌酚浓度为100mg/L的含0.2%吐温80的MM培养基中，以1mL生理盐水代替种子液为空白对照，恒温培养温度28°C、转速180r/min下振荡培养9d，每隔24h取样1次，甲醇超声提取，HPLC检测己烯雌酚残留浓度。降解菌株M-4处理前后己烯雌酚的HPLC谱图见图1；降解菌株M-4作用于100mg/L己烯雌酚的降解曲线见图2。菌株M-4对100mg/L己烯雌酚具有明显的降解作用，7d时己烯雌酚降解率达84.27%。所述己烯雌酚提取方法为：采用整瓶培养液的取样方式，加入30mL甲醇，于超声波AS10200A清洗器中超声提取30min；取2.0mL超声提取液于刻度试管中，用甲醇定容至10mL，混匀，取1.5mL样品12000r/min离心15min，上清液用0.45μm有机相滤膜过滤，弃去约0.5mL初滤液，收集续滤液为样品溶液，供HPLC分析用，仪器为LC-10A2010CHT型液相色谱仪。所述HPLC检测方法为：LC-10A2010CHT型液相色谱系统，SepaxGP-C18柱（150mm×4.60mm，5.0μm）为色谱柱，流动相为甲醇:水（7:3，v/v），流速0.7mL/min，进样量10μL，检测波长242nm。己烯雌酚降解率的计算公式为：式中：C0为空白对照中己烯雌酚浓度（mg/L）；C为培养液中己烯雌酚残留浓度（mg/L）。所述培养基为：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：新鲜土豆去皮切块，称取200g，加入500mL蒸馏水煮沸20min，过滤，加葡萄糖20g，琼脂20g，再加蒸馏水至1000mL，121°C灭菌15min；基础盐培养基（MM）：硫酸铵1.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0，121°C灭菌15min。以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。当前第1页1 2 3