专利名称：己烯雌酚阳离子化完全抗原制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种己烯雌酚阳离子化完全抗原制备方法，属于生物化工技术领域，用于制备特异识别化学兽药己烯雌酚的高效抗体与研制可以快速检测己烯雌酚残留的免疫速测试剂盒。
背景技术：
己烯雌酹(Diethystilbestrol, DES),又名乙烯雌酹、乙蔵酹,化学名为1,2-双(4-羟苯基)-1，2_ 二乙基乙烯，1938年由Dodds在英国伦敦合成，DES是一种具有酚羟基结构的人工合成的非留体雌性激素，为无色结晶或白色结晶性粉末，几乎无臭无味，几乎不溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚、脂肪油、稀氢氧化钠等，熔点169 172°C。己烯雌酚在兽医临床上主要用于发情不明显动物的催情，还可用于治疗子宫炎、胎衣不下、排出死胎等。DES曾作为促生长剂而广泛应用于畜禽生产中，这是由于其在促进动物蛋白质的合成代谢、减少脂肪和提高动物日增重等方面效果明显。国际癌症研究机构(IARC)研究发现，DES是一种致癌物质，会对人体健康产生严重危害，甚至可诱发人体产生癌变。与致癌性关系最密切的是女性阴道和子宫颈透明细胞腺癌(CCA)，这种病过去只发生在中老年妇女中，但到20世纪70年代以后CCA的发病率在年轻女性中有所增加。Herbst等的调查结果中发现年龄和出生年份是影响患透明细胞腺癌风险的主要因素，而Kinch等的研究中也发现大多数病患都与其母亲在妊娠早期服用过DES有关。此外，DES还会导致乳腺癌和子宫内膜癌等，现在大多数女孩月经初潮明显提前也与DES有关。己烯雌酚作为一种饲料添加剂，能够在动物源性食品(肝脏、肌肉、蛋、奶)中残留，并通过食物链危害人体健康，因此世界各国开始关注DES残留控制。早在1981年，欧盟理事会在81/602号指令中制订的第一批欧盟禁用兽药清单中就包括了己烯雌酚。美国也颁布禁令，将己烯雌酚列为禁止在食品动物中使用的兽药。我国在1999年制定的《中华人民共和国动物及动物源食品残留监控计划》中规定在动物性食品中不得检出己烯雌酚，2002年又发布了《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，禁止己烯雌酚及其盐、酯制剂以任何用途用于所有食品动物。然而，由于巨大经济利益的驱使，养殖商违禁添加己烯雌酚的情况依然存在，严重影响我国水产品、畜产品在国际上的声誉，造成重大经济损失的同时也给人们的健康带来隐患。因此，为了确保我国畜牧水产品出口贸易的畅通和动物食品的安全，建立针对己烯雌酚的快速、灵敏的检测技术成为当务之急。
发明内容
本发明的第一个目的提供一种己烯雌酚阳离子化完全抗原。本发明的第二个目的提供一种己烯雌酚阳离子化完全抗原的制备方法。本发明的技术方案概述如下:一种己烯雌酚阳离子化完全抗原，具有式I结构:
权利要求
1.一种己烯雌酚阳离子完全抗原，具有式I结构:
2.式I结构的一种己烯雌酚阳离子化完全抗原的制备方法，由如下步骤组成: (1)阳离子化载体蛋白的合成及鉴定在冰浴条件下，将670yL乙二胺(EDA)滴加到670 μ L乙烷磺酸偶联缓冲液(MES)，用4MHC1调pH值至4.75左右，此为A液；先后将载体蛋白的MES溶液(50mg溶解于500mL)、EDC的MES溶液(30mg溶解于500 μ L)滴加至冰浴中的A液中；室温磁力搅拌反应2h，加入醋酸(约400 μ L)终止；去离子水透析72h，冻干备用； (2)己烯雌酚阳离子完全抗原的合成采用EDC法，具体操作步骤如下:称取己烯雌酚半琥珀酸酯10.0mg、EDC 7.8mg、NHS 3.7mg，溶于2mLN, N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，室温震荡搅拌反应8h，此为A液；按阳离子蛋白:小分子=I: 40投料比准确称取阳离子化蛋白溶于2mL PBS中，此为B液，将A液用2mL PBS稀释后，在震荡器上将A液逐滴加至B液，4°C缓慢搅拌过夜，将反应液在PBS (0.0lmol/L、pH 7.4)中透析3天。
全文摘要
本发明公开了一种己烯雌酚阳离子化完全抗原的制备方法及其用途，属于生物化工技术领域，本发明合成了阳离子化的载体蛋白，利用EDC法与羧基化的己烯雌酚偶联，经质谱鉴定及SDS-PAGE分析成功合成了阳离子化的己烯雌酚人工完全抗原，制备方法简单有效，成本低廉，相对于天然载体蛋白，阳离子化的完全抗原作为免疫原时，被免疫的小鼠机体能产生更高水平的免疫应答，合成的人工完全抗原可以应用于制备特异识别己烯雌酚的高效抗体与研制快速检测己烯雌酚的免疫速测试剂盒。
文档编号C07K14/765GK103172728SQ201110440578
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者宁保安, 柳明, 彭媛, 连璐, 高志贤, 孙思明, 白家磊, 张亦红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所