一种液质联用法检测液态乳中己烯雌酚类激素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种乳中激素的检测方法，尤其适用于使用液质联用法检测液态乳中 己烯雌酚类激素。
【背景技术】
[0002] 己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮都属于己烯雌酚类激素，是人工合成的非类 固醇同化性激素，曾被用在畜牧业养殖过程中，用来提高饲料转化率及促进牲畜生长。为了 防止这些激素随畜产品进入人体，危害人类健康；因此该类化合物的检验方法成为解决这 一问题的前提条件。
[0003] 目前，检测己烯雌酚类激素的方法有分光光度法、酶联免疫法、气相色谱-串联质 谱法、高效液相色谱法以及液相色谱-串联质谱法。近年来，由于液相色谱-串联质谱法 具有高灵敏度、高选择性，在食品中农药残留和兽药残留的检测应用越来越多。例如《GB/T 22992-2008牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量 的测定液相色谱-串联质谱法》即使用了液质联用的方法，但其样品前处理方法耗时较长， 不利于企业日常快速检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种快速且准确地检测液态乳中己烯雌酚类激素的方法。
[0005] 本发明提供了一种液质联用法检测液态乳中己烯雌酚类激素的方法，样品前处理 方法包括：称取待测液态乳2g，加入3mL乙腈，涡旋混合20至40秒，然后在4000至5000r/ min下离心3至8min,移取上清液,得到上清液A ;向剩余沉淀中加入2mL乙腈,润旋混合20 至40秒，然后在4000至5000r/min下离心3至8min，移取上清液，得到上清液B ;合并上清 液A和上清液B，再加入5mL水混合均匀，最后用0. 1至0. 2mol/L的NaOH调pH值至10. 9 至11. 1，得到提取液；以及将提取液经固相萃取柱净化，得到待测液。
[0006] 本发明中的液态乳可以是生乳，例如生牛乳，还可以是奶粉加水溶解后制得的复 原乳，还可以是各种液态乳制品，例如调制乳。
[0007] 在液质联用法检测液态乳中己烯雌酚类激素的方法的一种示意性实施方式中，固 相萃取柱净化的方法为：取MAX固相萃取柱，依次用3至5mL甲醇和3至5mL水活化和平 衡；取提取液使其经过MAX固相萃取柱，控制流速0. 5至lmL/min ;用3至5mL淋洗液洗涤 MX固相萃取柱，弃去全部流出液；用3至5mL洗脱液洗脱MX固相萃取柱，并收集洗脱液； 以及将收集到的洗脱液在40°C水浴下氮气吹干，加入定容液涡旋溶解，最后过0. 22 μ m有 机系滤膜，得到待测液。
[0008] 在液质联用法检测液态乳中己烯雌酚类激素的方法的一种示意性实施方式中，淋 洗液为取5mL甲醇并用水定容至IOOmL制得；洗脱液为取5mL甲酸并用甲醇定容至IOOmL 制得；定容液为取50mL乙腈并用水定容至IOOmL制得。
[0009] 在液质联用法检测液态乳中己烯雌酚类激素的方法的一种示意性实施方式中， 液质联用法检测时的色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱，规格为2. IX 100mm、 1. 8 μ m ;柱温:4(TC ;进样体积：10 μ L ;流动相A为乙腈，流动相B为水；流速:0· 35mL/min ; 梯度洗脱：〇至3. 0 min, 50%流动相A至80%流动相A ;3. 0至4. 0 min, 80%流动相A至100% 流动相A ;4. 0至5. 0 min, 100%流动相A至50%流动相A。
[0010] 在液质联用法检测液态乳中己烯雌酚类激素的方法的一种示意性实施方式中，液 质联用法检测时的质谱条件为：离子化模式：电喷雾负离子模式；质谱扫描方式：多反应监 测；电离电压：3. 00 kv ;离子源温度：110°C ;去溶剂气温度：350°C ;去溶剂气-氮气流量： 600 L/h ;碰撞气-高纯Ar流量：50 L/h。
[0011] 本发明提供的一种液质联用法检测液态乳中己烯雌酚类激素的方法，其操作简单 快速，且检测准确性和回收率均能满足检测要求。与《GB/T 22992-2008牛奶和奶粉中玉米 赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法》 中的方法相比，本发明方法在乙腈提取后无需将合并后的上清液氮气吹干，减少操作步骤， 缩短样品前处理时间，且与《GB/T 22992-2008》具有相当的检测准确性和回收率。
【具体实施方式】
[0012] 为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明 本发明的【具体实施方式】。
[0013] 实施例1
[0014] 1、实验仪器 超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI) (TQD美国Waters)和 固相萃取装置(美国Supelco)。
[0015] 2、实验试剂与材料 己烯雌酸、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮标准品(德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）； 甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯； 实验室用水为一级超纯水； MAX固相萃取柱（60mg/3ml，美国waters公司）。
[0016] 3、溶液的配制。
[0017] (1)标准溶液 准确称取适量的己烯雌酚、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮标准品，用甲醇配制成l〇〇mg/L的 标准储备液，-18°C冰箱储存。使用时，根据需要用50%乙腈水溶液稀释成0. 002 μ g/mL、 0· 005 μ g/mL、0. 01 μ g/mL、0. 02 μ g/mL、0. 05 μ g/mL、0. 10 μ g/mL 的六个浓度梯度的标准工 作液。
[0018] (2)样品提取液 淋洗液：取5ml甲醇，用水定容至100mL ; 洗脱液：取5ml甲酸，用甲醇定容至100mL ; 定容液：取50ml乙腈，用水定容至100ml。
[0019] 4、色谱条件 色谱柱4〔〇1]几￥皿^：批3 13柱（2.1\10〇111111，1.8以111);柱温：4〇1：;进样体积 ：1(^1^ 流动相A为乙腈，流动相B为水；梯度洗脱：0~3. 0 min, 50%A~80%A ;3. 0~4. 0 min, 80%A ~100%Α ;4· O ~5· O min，100%A ~50%A。流速：0· 35ml/min。
[0020] 5、质谱条件 离子化模式：电喷雾负离子模式（ES-); 质谱扫描方式：多反应监测（MRM); 电离电压（kv) :3. 00 ; 离子源温度（°C) :110 ; 去溶剂气温度（°C) :350 ; 去溶剂气（N2)流量（L/h) :600 ; 碰撞气（高纯Ar)流量（L/h) :50 ; 锥孔电压、碰撞能量及定性和定量离子等质谱参数见表1。
[0021] 表1己烯雌酚类激素的质谱参数
注：*为定量离子。
[0022] 6、样品前处理 a、 称取待测液态乳2g，加入3mL乙腈，润旋混合20秒，然后在4000 r/min下离心3 min, 移取上清液，得到上清液A ; b、 向剩余沉淀中加入2mL乙腈，润旋混合20秒，然后在4000 r/min下离心3 min,移取 上清液，得到上清液B ; c、 合并上清液A和上清液B，再加入5mL水混合均匀，最后用0. 15mol/L的NaOH调pH 值至10. 9,得到提取液； d、 净化：取MX固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3mL水活化和平衡；取步骤c中得到的 提取液，使其经过MAX固相萃取柱，控制流速〇. 5-lmL/min ;用3mL淋洗液洗涤MAX固相萃 取柱，弃去全部流出液；用3mL洗脱液洗脱MAX固相萃取柱，并收集洗脱液；将收集到的洗 脱液在40°C水浴下氮气吹干，加入I mL定容液涡旋溶解，最后过0. 22 μ m有机系滤膜，得到 待测液。
[0023] 7、检测 用超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪对制备得到的标准工作液和待测液进行检测， 绘制标准曲线，并计算出待测液态乳中己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的浓度。
[0024] 实施例2
[0025] 在实施例1的基础上，仅将样品前处理方法替换如下，其余方法设计同实施例1。
[0026] 样品前处理方法： a、 称取待测液态乳2g，加入3mL乙腈，润旋混合30秒，然后在5000r/min下离心5min， 移取上清液，得到上清液A ; b、 向剩余沉淀中加入2mL乙腈，润旋混合30秒，然后在5000r/min下离心5min，移取上 清液，得到上清液B ; c、 合并上清液A和上清液B，再加入5mL水混合均匀，最后用0.1 mol/L的NaOH调pH 值至11，得到提取液； d、净化：取MX固相萃取柱，依次用4mL甲醇和4mL水活化和平衡；取步骤c中得到的