背景技术：
：X盒-结合蛋白1（Xbox-bindingprotein1,XBP1）mRNA为转录因子ATF6的诱导产物，XBP1mRNA编码具有碱性亮氨酸拉链（basicleucinezipper，Bzip）结构的转录因子。XBPl作为未折叠蛋白反应的一个重要转录因子，具有两种类型：剪接型的XBPls和非剪接型的XBPlt。磷酸化激活肌醇依赖酶1（inositolrequiringenzyme1,IRE1）的核酸内切酶活性，可以与底物XBP1t前体mRNA分子结合，并剪切其26个碱基的内含子，产生新的mRNA转录本，翻译生成有活性的转录因子X盒-结合蛋白1s（Xboxbindingprotein1splicing，XBP1s）。XBP1s进入细胞核后与内质网应激反应元件的基因启动子结合，诱导CHOP、GRP78等分子伴侣和折叠酶基因的表达，上调内质网相关蛋白降解，加快蛋白折叠和错误蛋白降解。XBPls参与细胞分化、炎症反应等过程。研究发现XBPls在肝细胞癌中高度表达，其通过与Ⅱ型主要组织相容性复合物(HLA)基因启动子结合调控其表达。XBP1s是细胞分化的一个调控因子，可促进细胞分化，Reimold等发现XBPl是调控肝细胞生长的一个重要转录因子，同位素示踪技术证实XBPl基因敲除小鼠的肝组织中肝细胞生长率降低、凋亡细胞增多。另有研究发现XBP1s可能通过激活JNK信号通路介导了IL-1β诱导的腹膜间皮细胞的炎症反应。XBPls与各种细胞的存活与凋亡密切相关。Gomez等研究发现，XBPls的过度表达能降低乳腺癌细胞中雌激素受体的依赖性，改变了许多与细胞凋亡和细胞周期有关的基因表达，通过影响线粒体凋亡通路的活性促进MCF-7和T47D细胞的存活。在氧化应激介导的细胞损伤过程中，XBPls具有重要的保护作用，过度表达XBPls能够恢复XBPl缺失细胞中过氧化氢酶的表达，起到保护细胞不受损伤的作用。对糖尿病肾脏损害的研究发现，高糖刺激细胞XBP1s的表达降低，细胞外基质蛋白合成增加，导致细胞凋亡与坏死增加。可见XBP1s与多种疾病的发生、发展过程相关，通过对不同疾病模型中XBP1s表达水平的研究可为许多疾病的研究提供了新的思路，为进一步阐明疾病的发病机制提供了新的方法。对XBP1s表达水平的研究除采用免疫组化、ELISA和Western免疫印迹等方法从蛋白水平进行研究外，也可从mRNA水平研究XBP1s的表达水平,包括半定量反转录PCR和荧光定量PCR方法等。以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录PCR需要电泳检测，准确度不够高。荧光定量PCR方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单,可应用SYBRgreen染料法检测，无需使用荧光探针，设计简单，采用荧光定量PCR相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助XBP1s表达水平的研究，整个PCR反应过程只需1.2小时即可完成。细胞管家基因需选择维持细胞最低限度功能所不可少的、在所有细胞中均要表达的一类基因，且表达水平受环境因素影响较小。有研究表明比较常用的actin管家基因受内质网应激影响，表达量会减少，不适宜用于内质网应激的参考基因。核糖体蛋白基因产物是维持细胞生命活动所必须的，表达于所有细胞中，其表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节,可用作内质网应激的参考基因。技术实现要素：本发明通过设计人源性XBP1s基因的特异性引物和核糖体蛋白RPL19基因的特异性引物，将其用于XBP1s基因表达水平的检测。本发明的工作原理是应用荧光定量PCRSYBRgreen荧光染料的方法根据相对定量原理，即2-△△CT法确定基因表达水平。本发明包含两套引物系统，一套引物是针对人源性XBP1s基因的特异性引物；另一套引物是针对人的核糖体蛋白RPL19基因设计的特异性引物。根据NCBI公布的humanXBP1smRNA序列（序列号：NM_001079539.1）设计XBP1s引物序列见表1：表1.XBP1s引物设计引物名称序列F-XBP1sCTGAGTCCGCAGCAGGTGR-XBP1sTGTCCAGAATGCCCAACAGG根据NCBI公布的humanRPL19的mRNA序列（序列号：NM_000981.3）设计引物序列见表2：表2.RPL19引物设计引物名称序列F-rplCGAGCGAGCTCTTTCCTTTR-rplAGACCTTCTTCTTGCCACAGC技术效果本发明设计的两套引物可特异性检测XBP1s和RPL19基因的mRNA表达水平，无非特异性扩增，所选择的管家基因表达水平不受内质网应激影响，可对XBP1s基因的表达水平进行准确定量。本发明的检测系统采用SYBRgreen荧光染料方法，无需使用探针，试剂使用方便，只需加入相关检测模板即可，不需要繁琐的操作步骤，检测只需1.2h即可完成。附图与说明附图1为本发明实施例1中XBP1s和RPL19基因扩增产物的融解曲线，其中A图为XBP1s基因扩增产物的融解曲线；B图为RPL19基因扩增产物的融解曲线。附图2.为本发明实施例2中Manf蛋白对PD细胞模型XBP1s基因表达水平的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明实施例中采用诺唯赞的AcetaqSYBRsupermix，采用25微升反应体系，荧光定量PCR仪采用ABI7500。利用本发明的特异性引物组合和方法检测人源性XBP1s基因表达水平时，基本操作为：步骤1.细胞RNA提取采用商品化试剂盒提取细胞RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，并控制提取质量OD260/280～2.0。本发明实施例采用天根总RNA提取试剂盒提取细胞RNA，具体操作按说明书进行；步骤2.cDNA反转录取大约500ngRNA采用商品化试剂盒进行cDNA反转录。本实施例采用Takara的商品化试剂盒PrimeScriptTMRTMasterMix（PerfectRealTime）进行反转录，具体操作按说明书进行；步骤3.荧光定量PCR反应实验中每种模板分别加入两种荧光定量PCR反应体系中分别进行XBP1s和RPL19基因检测，一种反应体系包含组分如下：1×AcetaqSYBRsupermix上游引物（F-XBP1s） 各0.1～0.5μM下游引物（R-XBP1s）各0.1～0.5μM模板（1:5稀释的cDNA)5μl总体积25μl另一种为：1×AcetaqSYBRsupermix上游引物（F-rpl） 各0.1～0.5μM下游引物（R-rpl）各0.1～0.5μM模板（1:5稀释的cDNA)5μl总体积25μl荧光定量PCR反应条件：95℃5min，然后再运行40个循环（具体95℃10s，60℃34s），退火时检测荧光信号。反应结束后可进行融解曲线分析引物扩增反应的特异性；步骤4.检测结果分析根据系统自动基线和对数期阈值设置获得各个反应的CT值，计算2-△△CT值，即实验组XBP1s基因mRNA表达水平与对照组比较的倍数，△△CT=（CTXBP1s（实验组）-CTrpl19（实验组））-（CTXBP1s（对照组）-CTrpl19（对照组））。实施例一慢病毒感染细胞中XBP1s基因表达水平分析将含有GRP78基因干扰序列的包装慢病毒体外感染293T细胞。24孔板中接种293T细胞，接种密度3*105/ml。培养24h后细胞密度约为50%-60%，按MOI2:1进行慢病毒感染，并设不加病毒阴性对照。在37℃，5%CO2培养箱内培养24h，更换新鲜的含10%FBS的高糖DMEM培养基继续培养24h，吸去上清，PBS清洗三遍，收集细胞，提取细胞RNA。分别取500ngRNA反转录cDNA，采用荧光定量PCR法检测XBP1s基因的表达水平，以RPL19作为内参，并与未加病毒感染的细胞进行比较。检测结果见表3：表3.慢病毒感染细胞与对照细胞XBP1s表达水平的比较表3结果表明，慢病毒感染细胞XBP1s基因表达水平较对照组细胞明显升高，是对照组细胞的2.33倍，说明慢病毒感染可使细胞产生内质网应激，诱导XBP1s基因的转录表达。XBP1s和RPL19引物扩增的溶解曲线均只出现单一的融解峰（见图1），说明引物特异性较好，无非特异性扩增。实施例二通过检测XBP1s的表达水平研究帕金森病细胞模型中Manf蛋白的保护作用采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)制作SH-SY5Y细胞损伤的帕金森病细胞模型检测Manf蛋白的保护作用，实验分为对照组（DMEM）组、6-OHDA（50μmol/L）组以及6-OHDA（50μmol/L）+Manf（4µg/ml）组。预先给予Manf蛋白4h后加入6-OHDA作用1h、2h和6h后分别收集细胞，提取RNA，反转录后采用荧光定量PCR测定XBP1s基因的表达水平。通过与对照组比较，计算出各组XBP1s的相对表达水平（见图2），结果表明在Manf蛋白存在情况下，经过1小时后，6-OHDA即可诱导细胞XBP1s基因表达，较对照组明显升高，2h和6h后，XBP1s基因表达水平持续升高；而6-OHDA组XBP1s水平在6h后才检测到升高，说明Manf蛋白的存在有助于应激条件下XBP1s的转录表达，提示MANF蛋白可能通过提高XBP1s的表达发挥其细胞保护作用。通过上述的实施例可以知道，本发明的特异性引物组合及相应的方法，可以特异性检测人源性XBP1s基因的表达水平，避免同源性基因的干扰，并以不受内质网应激影响的RPL19作为内参，提高了人源性XBP1s基因表达水平的检测准确性，检测过程简单、高效。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。SEQUENCELISTING<110>同济大学苏州研究院<120>一种用于检测人源性X盒结合蛋白1s基因表达水平的引物组合及其应用<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>PCR扩增引物<400>1ctgagtccgcagcaggtg18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>PCR扩增引物<400>2tgtccagaatgcccaacagg20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>PCR扩增引物<400>3cgagcgagctctttccttt19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>PCR扩增引物<400>4agaccttcttcttgccacagc21当前第1页1 2 3