一种检测DNA序列的方法与流程

文档序号：11809670阅读：501来源：国知局

本发明涉及一种DNA检测方法，尤其涉及一种简单、高效、定量的DNA检测方法。

背景技术：

自1977年Sanger发明了DNA双脱氧链终止法DNA测序技术以来(Sanger F.,Nichlen S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1977,74(2):5463-5467)，DNA测序已经取得了跨越式发展。Sanger法的原理是在反应体系中加入一定比例的2’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP)，然后随着ddNTP的掺入，链反应会终止延伸。Sanger法操作简单，而且随着荧光标记的发明，逐渐实现了自动化。其中，最著名的测序仪器便是美国ABI公司开发的ABI377和ABI3730等，其中基于毛细管电泳技术的3730到目前仍在广泛使用。虽然Maxam和Gilbert也于1977年发明了化学法测定DNA序列的技术，但是由于操作繁琐，该技术并未获得广泛推广(Maxam A.M.,Gilbert W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1977,74(2):560-564)。

这些年随着下一代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)的飞速发展，DNA测序开始往高通量、低成本的方向在发展。目前NGS市场主要是使用Illumina公司提供的测序平台，剩余的市场使用由Life Technologies(Thermo Fisher Scientific)、454Roche和Pacific Biosciences等公司提供的平台。各个公司的平台各有特点，但是都是在朝着降低成本、提高通量和速度的方向在努力。

自诞生以来，NGS已经在多个领域获得了广泛应用，例如，生物研发、医疗诊断和人类基因组计划等。通常的做法是将双链DNA模板随机打断，然后连上接头进行测序。如果出发的样本是RNA，则需要先将RNA反转录为DNA样本，然后再进行测序。

对于较短的单链DNA(ssDNA)样品，目前也有为数不多一些的技术方案来利用NGS平台进行测定。例如，Gansauge等人曾经使用生物素标记的接头(adaptor)来与ssDNA连接，然后再连入第二个接头，之后用PCR的方法进行扩增，并利用现有的NGS平台进行序列测定(M.-T.Gansauge,M.Meyer,Nat.Protoc.,2013,8(4):737-748)。该方案需要两次连接接头；而且第二个接头是经过特别设计的，含有2’,3’双脱氧结构以保证只连接一条链。同时，该方案比较适合于较少量的ssDNA的序列测定，但特别不适合对ssDNA中序列的定量分析，因此该方法主要用于古生物DNA的测定，重点针对损坏的微量DNA。另外，该方案只能与Illumina平台配套，一定程度上限制了该方案的使用范围。由于该方案还需要进行PCR扩增，且PCR有一定的偏好性，该方案会影响数据的绝对定量结果。

技术实现要素：

针对目前DNA检测方法存在的成本高、适用性差、定量性差等问题，本发明提供了一种新的检测DNA序列的方法，可以实现高效、简便和准确的定性和定量检测。

本发明第一个方面是提供一种检测DNA序列的方法，步骤包括：

从单链DNA(ssDNA)待测样品出发，在DNA序列一个末端连接DNA接头(adaptor)序列；其中，所述DNA接头序列的5’端含有磷酸化基团(Pi基团)；使所述DNA接头序列形成双链；

将ssDNA合成双链DNA；

利用NGS平台进行测序。

本发明上述内中，所述DNA待测样品中，DNA可以是寡核苷酸(oligonucleotide)、或比寡核苷酸更长或更短的DNA；如：可以是5-500碱基的序列，更优选为7-500碱基的序列，更优选为10-450碱基的序列，更优选为20-450碱基的序列，更优选为25-400碱基的序列，更优选为30-350碱基序列，更优选为35-300碱基序列，更优选为40-250碱基序列，如45碱基、50碱基、60碱基、65碱基、70碱基、75碱基、100碱基、150碱基等。

本发明上述内容中，所述DNA接头序列优选为寡核苷酸序列，所述DNA接头序列的长度优选为5-250碱基，更优选为7-240碱基，更优选为10-230碱基，更优选为12-200碱基，更优选为15-180碱基，更优选为20-150碱基，如25碱基、30碱基、50碱基、80碱基、100碱基、110碱基、120碱基。

本发明上述内容中，使所述DNA接头序列形成双链的方法可以是选自：加入引物，其中所述引物与所述DNA接头序列之间至少部分特异互补，以与DNA接头序列形成互补双链；或者所述接头本身设计为部分双链结构。

因此，本发明上述内容中，所述DNA接头序列可以是单链序列，也可以是双链序列，所述双链序列可以是仅为部分双链结构，如5’端为单链结构而3’端为双链结构。

当所述DNA接头序列为单链结构时，所述接头序列3’端优选为含有羟基。

当所述DNA接头序列为双链结构时，5’端含Pi基团的为正链，另一条链为反链。

当所述DNA接头序列为双链结构时，可以优选为3’端为平端、正链的3’端突出、正链的3’端缩进、3’端封闭、3’端带有可化学切割部分、在3’端双链之间通过茎环结构连接。

当所述DNA接头序列为单链、3’端为平端、正链的3’端突出或正链的3’端缩进时，所述正链3’端带有羟基基团、或对含有羟基的3’端进行了可逆修饰。

当所述DNA接头序列含有茎环时，在正链和/或反链上还可以存在能够酶切的碱基修饰或酶切位点，所述碱基修饰可以选自脱氨、烷基化修饰中的任意一种或几种，如甲基化修饰，也可以是尿嘧啶，应当理解的是，所述碱基修饰可以是一个碱基或多个碱基修饰；所述酶切位点如位点非常稀少的酶切位点，如归位内切酶、限制性内切酶的酶切位点。所述归位内切酶如I-Dmol、I-Scel、I-Ceul等，并优选为I-Scel，其识别和酶切DNA核心序列包含如下序列或其反向互补序列：

5’-ATTACCCTGTTATCCCTA-3’

当所述DNA接头序列3’端封闭(如3’端羟基被封闭)时，所述封闭可以是、但不限于：碱基修饰、3’端双脱氧处理中的任意一种，并且所述修饰可以是可逆修饰，如对含有羟基的3’端进行可逆修饰。

当所述DNA接头序列3’端封闭时，在正链或反链上还可以存在能够酶切的碱基修饰或酶切位点，所述碱基修饰可以选自脱氨、烷基化修饰，如甲基化修饰，也可以是尿嘧啶；所述酶切位点如位点非常稀少的酶切位点，如归位内切酶，如 I-Dmol、I-Scel、I-Ceul等。

在本发明的一种优选实施例中，所述检测DNA序列的方法，步骤包括：

从单链DNA(ssDNA)待测样品出发，在DNA序列一个末端连接DNA接头序列；其中，所述DNA接头序列为单链序列，5’端含Pi基团，3’端含羟基；

加入引物，在DNA聚合酶作用下，将ssDNA合成双链DNA；其中，所述引物与所述DNA接头序列之间至少部分特异互补；

利用NGS平台进行测序。

在本发明的一种优选实施例中，所述检测DNA序列的方法，步骤包括：

从单链DNA(ssDNA)待测样品出发，在DNA序列一个末端连接DNA接头序列；其中，所述DNA接头序列含双链结构，其中正链的5’端含Pi基团，正链的3’端含羟基；

在DNA聚合酶作用下，将ssDNA合成双链DNA；

利用NGS平台进行测序。

在本发明的一种优选实施例中，所述检测DNA序列的方法，步骤包括：

从单链DNA(ssDNA)待测样品出发，在DNA序列一个末端连接DNA接头序列；其中，所述DNA接头序列含双链结构，其中正链的5’端含Pi基团，正链和反链之间在3’端形成茎环连接，DNA接头序列中含有甲基化修饰碱基；

在DNA聚合酶作用下，将ssDNA合成双链DNA；

在特异性切割甲基化修饰DNA的酶作用下，去除DNA接头序列中的茎环；

利用NGS平台进行测序。

在本发明的一种优选实施例中，所述检测DNA序列的方法，步骤包括：

在特异性切割甲基化修饰DNA的酶作用下，去除DNA接头序列中的茎环；

在DNA聚合酶作用下，将ssDNA合成双链DNA；

利用NGS平台进行测序。

在本发明的一种优选实施例中，所述检测DNA序列的方法，步骤包括：

从单链DNA(ssDNA)待测样品出发，在DNA序列一个末端连接DNA接头序列；其中，所述DNA接头序列含双链结构，其中正链的5’端含Pi基团，正链和反链之间在3’端形成茎环连接，DNA接头序列中含有尿嘧啶；

在特异性切割尿嘧啶的酶(如NEB公司的USER^TM Enzyme)作用下，去除DNA接头中的茎环；

在DNA聚合酶作用下，将ssDNA合成双链DNA；

利用NGS平台进行测序。

本发明上述内容中，所述待测样品在5’端含有磷酸化基团的，还包括在连接DNA接头序列之前进行脱磷的步骤。

本发明第二个方面是提供一种上述检测DNA序列的方法的应用。所述应用可以是定量、定性检测DNA序列中的任意一种或几种，更优选为进行定量检测DNA。

在一种优选实施例中，所述应用包括在合成核苷酸药物质检中的应用：步骤包括：

将合成的核苷酸药物粗产物进行纯化，分离出纯化产物和杂质产物；

采用本发明第一个方面所述的方法，对纯化产物和/或杂质产物进行检测。

在另一种优选实施例中，所述应用包括在合成核苷酸药物质检中的应用：步骤包括：

将合成的核苷酸药物粗产物进行纯化，分离出纯化产物和杂质产物；

采用本发明第一个方面所述的方法，对纯化产物和/或杂质产物进行检测。

将检测结果与已检测合格的产品中的检测结果相对比，如果检测结果与合格产品一致的检测结果一致，则该纯化后的产物为合格产品；否则为不合格产品。

在另一种优选实施例中，所述应用包括在合成核苷酸药物质检中的应用：步骤包括：

将合成的核苷酸药物粗产物进行纯化，分离出纯化产物和杂质产物；

采用本发明第一个方面所述的方法，对纯化产物和/或杂质产物进行检测。

将检测结果与已检测合格的产品中的检测结果相对比，如果检测结果与合格产品一致的检测结果一致，则该纯化后的产物为合格产品；如果检测结果不一致，则需要对纯化产物进行安全性测试。

在另一种优选实施例中，所述应用包括在合成核苷酸药物质检中的应用：步骤包括：

将合成的核苷酸药物粗产物进行纯化，分离出纯化产物和杂质产物；

采用本发明第一个方面所述的方法，对纯化产物和/或杂质产物进行检测。

将检测结果与已检测合格的产品中的检测结果相对比，如果检测结果与合格产品一致的检测结果一致，则该纯化后的产物为合格产品；如果检测结果不一致，则需要对超出预定含量的杂质进行安全性测试。

本发明上述内容中，所述核苷酸药物可以是预防疾病、治疗疾病的药物中的任意一种或几种。并优选为寡核苷酸类药物，如反义寡核苷酸。

其中，所述药物可以是包括抗病毒药物、抗肿瘤药物、激素类药物中的任意一种或几种，如促红细胞生成素、生长激素、表皮生长因子、胰岛素、白介素、集落刺激因子。

其中，所述反义寡核苷酸也可以是包括化学修饰反义寡核苷酸、Decoy寡核苷酸中的任意一种或几种，如硫代修饰反义寡核苷酸、嵌合寡核苷酸、杂合寡核苷酸、肽核酸、锁核酸、吗啉化寡核苷酸、磷酰胺酯化寡核苷酸、2’-O-烷基化寡核苷酸中的任意一种或几种。

应当理解的是，本发明上述内容中，所述“茎环”指的是一段核苷酸序列，其在3’端将DNA接头的两条链进行连接。

发明人通过广泛而深入的研究，建立了一套用于ssDNA测序的技术方案。首先用给ssDNA连上接头序列，需要加入特异的引物，与接头形成互补的双链，然后在DNA聚合酶的作用下，生成dsDNA，以利用现有的NGS测序平台进行测序分析。实验结果表明，采用上述技术方案成功地进行了多组ssDNA序列的测定。

附图说明

图1为本发明检测DNA序列的方法流程框图；

图2为本发明实施例中几种接头序列结构示意图；

图3为本发明中使用单链接头的检测DNA序列的方法流程示意图；

图4-6为本发明使用双链接头的检测DNA序列的方法流程示意图；

图7-8为本发明使用含茎环结构接头的检测DNA序列的方法流程示意图.

具体实施方式

下面参照附图，并结合具体实施例对本发明检测DNA序列的方法及其应用进行详细介绍。

图1给出了本发明检测DNA序列的方法流程框图，本发明先将ssDNA的一端连接一端DNA接头序列，然后生成双链DNA，最后进行NGS检测。

其中，NGS(Next Generation Sequencing)为高通量测序(High-Throughput sequencing)，是相对于传统的桑格测序(Sanger Sequencing)而言的。目前高通量测序的主要平台代表为Illumina、Life Technologies(Thermo Fisher Scientific)、罗氏公司(Roche)和Pacific Biosciences的测序平台。

图2给出了几种不同的DNA接头序列，其中：

第(1)种为单链接头序列，其5’端为磷酸化基团，3’端为羟基(-OH)；

第(2)种为部分双链接头序列，正链(图中较长的链)5’端为磷酸化基团，3’端为羟基，并且反链(短链)在3’端与正链之间形成双链；该接头序列分为3’端为平端、突出和缩进三种，具体详见下述实施例；

第(3)种为部分双链接头序列，与第(2)种接头序列不同之处在于，两条链在3’端形成茎环结构，彼此通过该茎环结构连接；图中，正链和反链中均含有尿嘧啶U，但本发明也可以仅在正链或仅在反链上含有该尿嘧啶U；

第(4)为部分双链接头序列，与第(3)中接头不同之处在于，反链上含有某种碱基修饰X，该碱基修饰可以是能够进行酶切的甲基化修饰，或者本身为酶切位点，如位点非常稀少的酶切位点，如归位内切酶如I-Dmol、I-Scel、I-Ceul等；如果X为限制性内切酶的酶切位点，可以生成双链后进行酶切，以去除3’端的部分；

第(5)种为部分双链接头序列，与第(2)种接头序列不同之处在于，正链3’端被封闭，例如碱基修饰或者3’端双脱氧处理，因此不能与5’端形成磷酸二酯键，并且3’端带有类似于第(4)中序列的某种碱基修饰X；另外，3’端也可以是可逆修饰，在此情况下，3’端带有可化学切割的部分，而无需该碱基修饰X。

图2中，X或U并不意味着必须是一个碱基，也可以是多个碱基或一个序列段。

实施例1

参照图3，本实施例中DNA接头序列为单链序列。

从ssDNA出发，在ssDNA一个末端连接该单链的DNA接头序列。

加入与该DNA接头序列部分特异互补的引物，以与该DNA接头序列形成互补的双链。

在DNA聚合酶的作用下，将ssDNA形成双链DNA(dsDNA)。

纯化后，利用现有的NGS平台，进行建库、测序等操作。

实施例2

参照图4，本实施例中DNA接头序列为部分双链序列，并且3’端为平端。