一种环状RNA在结直肠癌生物标志物中的应用的制作方法

本发明属于天然核糖核苷酸的用途，涉及环状核糖核苷酸(CPSF6-circRNA)的用途，尤其涉及CPSF6-circRNA结直肠癌患者的新的生物标记中的用途，用于鉴别结直肠癌及更不良预后的对象。

背景技术：

结直肠癌又称大肠癌，是一种常见的恶性肿瘤。结肠癌在早期并无明显症状，直到发病中晚期发现。提高结直肠癌的早期诊断率对于及时治疗和改善预后至关重要。如通过在结直肠癌中出现的CPSF6-circRNA所证明的，已知在结直肠癌组织中有异常的CPSF6-circRNA表达。考虑到CPSF6-circRNA表达量在结直肠癌中可升高或降低，因此提供了疾病进展的病理学指征。

circRNA广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征。是基因组DNA转录表达过程中，环化成环形RNA，的一类非编码RNA。研究表明，一些circRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)来发挥基因表达调控的作用。circRNA利用其microRNA(miRNA)应答元件结合miRNA，以阻断miRNA对其靶标基因表达的抑制作用，从而调控其他相关mRNA的表达水平。circRNA在基因表达调控中重要作用的发现提示circRNA在药物开发和疾病诊治中具有良好的应用前景。

circRNA作为一种调控性RNA(Regulatory RNA)近几年成为肿瘤研究的热点领域。circRNAs其表达具备组织特异性。circRNA中既有一部分作为竞争性内源RNA(ceRNA)来发挥基因表达调控的作用。Thomas B.Hansen等人通过对人AGO蛋白和miR-7的分析研究，证明了circRNA作为高效的microRNA海绵的作用。circRNAs在肿瘤和正常组织中的表达水平差别十分显著，甚至能达到数百甚至数千倍，这种显著的差异使得其在成为候选标志物上具有明显优势。

技术实现要素：

本发明的目的是提供环状RNA(Circular RNA\circRNA)CPSF6-circRNA在结直肠癌生物标志物中的应用，英文名CPSF6-circRNA，CPSF6-circRNA长11434bp，位于人类的第12条染色体上69644908到69656342，CPSF6-circRNA的碱基序列结构，CPSF6是该circRNA的覆盖基因。

本发明提供了鉴别可能患有结直肠癌的对象或结直肠癌的分期，再或者对先前经鉴别患有结直肠癌的对象的预后进行确定的方法及其引物序列结构、PCR产物识别序列。

所述方法包括检测来自所述对象的样品中的CPSF6-circRNA量，其中较高量的CPSF6-circRNA与所述对象患有结直肠癌的可能性增加或者结直肠癌预后不佳的可能性增加相关。

本发明的有益效果有：1)提出了CPSF6-circRNA的用途；2)本发明的研究表明异常的量的CPSF6-circRNA与所述对象患结直肠癌的可能性增加或者可能提示结直肠癌预后不佳。3)circRNA具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征。且circRNA在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中表达量存在差异，因此CPSF6-circRNA具有成为结直肠癌生物标志物的应用前景。

附图说明

图1为CPSF6-circRNA的PCR识别序列与PCR产物测序结果的对比图。

图2为使用CPSF6-circRNA筛查引物对病人组织样品表达量筛查的结果图。

图3为CPSF6-circRNA的简易结构及引物位置图。

具体实施方式

下面结合具体实验步骤对本发明进行进一步描述。

1)实验材料：

临床样品：16例结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织样品由301医院所提供。

试剂：CPSF6-circRNA筛查引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京引物合成部合成；Trizol(货号15596-018)购自Invitrogen；氯仿(货号20100927)购自北京化工，异丙醇(货号1205031)购自西陇化工，乙醇(货号101860)购自北化经销；Random primers(货号C1181)，M-MLV(货号M1705)，Ribonuclease Inhibitor(货号2511)，Nuclease-Free Water(货号2511)，dNTP mix(货号P1195)均购自Promega；Premix Ex TaqTM II(货号DRR081A)购自Takara；Mineral oil(货号D7295)购自Sigma。

2)实验方法：

A、结直肠癌癌变组织/癌旁组织RNA提取

称取1克组织材料，液氮研磨后，转移至1.5毫升RNase-free的离心管中，混匀后室温静置5分钟左右。加入200微升的氯仿，混匀。11000转每分钟离心10分钟。取上清加入200ul的氯仿抽提，11000转每分钟离心10分钟。取上清加入500微升的异丙醇，-20℃沉淀10分钟。11000转每分钟离心15分钟，将沉淀转移至1.5毫升RNase-free离心管中，预冷的75％乙醇洗涤2遍，晾干，RNase-free水溶解(根据情况适当溶解，一般是20-35微升)。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。

B、表达量筛查

1.cDNA合成

1-2微克RNA到14微升RNase-free水中，再加1微升random primer轻柔混匀后加入0.2mlPCR管中。PCR仪70℃孵育5分钟。快速放在冰上2分钟。

配置反应混合物：

42℃孵育1小时，70℃孵育15分钟，4℃保温。

2.Real-time PCR

cDNA中加入50ul的ddH₂O。

在冰上制备QPCR混合物：

每管中加入10微升矿物油。离心机1000转每分钟离心1分钟。将样品放置入QPCR仪中运行，程序如下：

3)实验结果：

参见图1和图2，图1为CPSF6-circRNA的PCR识别序列与PCR产物测序结果的对比图。实验结果表明CPSF6-circRNA的PCR识别序列与PCR产物测序结果比对成功，CPSF6-circRNA在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中表达。图2为使用CPSF6-circRNA筛查引物对病人组织样品表达量筛查的结果图。实验结果表明CPSF6-circRNA在结直肠癌病人的癌组织和癌旁组织中的表达差异较大，癌组织相对于癌旁组织下调存在着从0.1905349倍到0.9904351倍的变化其中6/11的病人下调倍数在0.5以下；上调存在1.599753倍到18.333660倍的表达量变化，其中4/5的病人上调倍数在5倍以内，1/5的病人上调在10倍以上。如此大的表达差异给了CPSF6-circRNA作为结直肠癌生物标志物的应用前景。