本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种XRCC1基因突变检测特异性引物和液相芯片试剂盒。
背景技术：
：人类X射线交叉互补修复基因1(X-rayrepaircross-complementinggene1,XRCC1)是第一个分离到的影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基因,它广泛参与DNA损伤的修复。XRCC1定位于人类染色体19q13.2-19q13.3，大小为33kb，包含17个外显子。纯化的XRCC1蛋白由633个氨基酸残基组成。XRCC1作为脚手架蛋白，通过直接与聚合酶β、DNA连接酶Ⅲ和多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADPribose)polymerase,PARP]形成复合物，共同参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复。很多研究表明，个体XRCC1多态位点是否有突变以及携带各突变等位基因的数目不同都可能影响多种癌的易感性。目前，XRCC1基因多态性的检测技术主要有：基于PCR技术的Real-timePCR、PCR-RFLP等技术，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALDI-TOF-MS)以及免疫组化技术(IHC)。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制。免疫组化虽具有特异性、敏感性强及操作简单等优点，但其抗体使用、操作步骤、结果判断等没有统一标准，从而影响其在临床上的推广与应用。液相芯片，又称流式荧光技术、悬浮阵列，具有检测速度快、结果准确性高、操作简便、功能强大、成本低廉等诸多优点。然而，要液相芯片实现基因突变检测，其检测结果的影响参数较多，包括引物的设计、与tag序列的组合，与PCR引物之间的交叉反应、与其它位点的多条序列的交叉反应、整个检测平台的Tm值的协调等等，在针对目标基因突变检测的液相芯片的设计时，其关键的考虑因素是除了能单独进行检测，还必须能与其它位点进行同步检测。而目前，急需开发一种既然单独检测，又能实现并行检测的XRCC1基因突变检测液相芯片。技术实现要素：本发明的目的之一是提供XRCC1基因突变检测液相芯片试剂盒，该液相芯片试剂盒可用于单独或并行检测XRCC1基因3种常见基因型A1196G、C580T和G839A的野生型和突变型的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下。一种XRCC1基因突变检测液相芯片试剂盒，包括有：(A).针对XRCC1基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自以下至少一对：针对A1196G位点的SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、针对C580T位点的SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、和针对G839A位点的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12；所述tag序列选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.6；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.13～SEQIDNO.18，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、与所述ASPE引物具有相应突变位点的目标序列的引物。在其中一些实施例中，所述扩增引物选自以下至少一对：针对A1196G位点的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20、针对C580T位点的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、和针对G839A位点的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24。在其中一些实施例中，所述ASPE引物对选自以下至少一对：针对A1196G位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.7组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.8组成的序列，针对C580T位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.9组成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.10组成的序列，针对G839A位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.11组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.12组成的序列。本发明的另一目的是提供用于XRCC1基因突变检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下：用于XRCC1基因突变检测的特异性引物，选自以下至少一对：针对A1196G位点的SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、针对C580T位点的SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、和针对G839A位点的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12。本发明的主要优点在于：1.本发明所提供的XRCC1基因突变检测液相芯片试剂盒的检测结果与测序法吻合率高达100％，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的XRCC1基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，特异性引物、tag标签序列、anti-tag标签序列的选取，构建了一个检测参数统一的检测平台，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的单独和并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合，本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，3种突变位点检测可通过一步PCR即可完成3条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片试剂盒敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。具体实施方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例1本实施例所述XRCC1基因突变检测液相芯片试剂盒，主要包括有：一、ASPE引物针对XRCC1基因三种常见基因型A1196G、C580T和G839A的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：表1XRCC1基因的ASPE引物序列(tag序列+特异性引物序列)每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。其中，使用“框”标出的碱基为目标检测突变位点的野生型和突变型碱基，所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。二、anti-tag序列包被的微球根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的10种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列选择的6种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5－10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5－10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5－10个T，微球包被的过程如下：分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物针对XRCC1基因四种常见基因型A1196G、C580T和G839A，设计扩增引物对(见表3)，一次性并行扩增出3条含有3个突变位点的目标序列。表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。实施例2运用实施例1所述的XRCC1基因突变检测液相芯片试剂盒对样本的检测所述各种溶液的配方如下：50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：2×Tm杂交缓冲液过滤后贮存于4℃。ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。一、样本的DNA提取：参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。二、待测样品的PCR扩增设计3对引物，多重PCR一步扩增出3条分别含XRCC1基因三种目标检测突变位点A1196G、C580T和G839A的目标序列，产物大小分别为312bp、337bp以及312bp，引物序列(SEQIDNO.19-24)见上述表3所示。首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQIDNO.19-24的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，使用10mmol/LTrisBuffer配制成终浓度各为10pmol/mL的多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。三、PCR产物的酶切处理1.取7.5ulPCR反应后的产物，加入1ul10×SAP缓冲液、1ulSAP酶和0.5ulExo-I酶；2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)利用实施例1中设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/LTrisBuffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。五、杂交反应1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的6种包被的微球(如实施例1所述)，每种微球浓度均为2.5×105个/ml；2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；3.微球于≥10000g离心1-2min；4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；8.杂交后的微球于≥3000g离心2－5min；9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；10.微球于≥3000g离心2－5min；11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。六、结果检测与数据分析反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；2.NETMFI＝样品MFI－PCR阴性对照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：突变比值＝突变型NETMFI÷(突变型NETMFI+野生型NETMFI)4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。使用本方法检测20份样本的XRCC1基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可计算 得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的XRCC1基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的XRCC1基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出XRCC1的SNP类型，且结果稳定可靠。表4样本检测结果(MFI)表5样本XRCC1基因突变比值(％)样品号A1196GC580TG839A12％2％4％21％2％3％32％1％2％460％2％2％52％2％2％62％3％2％75％2％2％82％2％3％92％1％1％102％3％2％112％2％1％124％2％98％132％1％2％142％1％2％154％97％2％162％2％2％171％1％2％182％1％1％192％1％2％202％2％2％表6样本XRCC1基因突变类型分析结果样本号液相芯片检测结果测序结果1野生型野生型2野生型野生型3野生型野生型41196AG1196AG5野生型野生型6野生型野生型7野生型野生型8野生型野生型9野生型野生型10野生型野生型11野生型野生型12839AA839AA13野生型野生型14野生型野生型15580TT580TT16野生型野生型17野生型野生型18野生型野生型19野生型野生型20野生型野生型实施例3不同的ASPE引物的液相芯片试剂盒对XRCC1基因SNP位点的检测一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)以XRCC1基因A1196G和G839A位点突变检测液相芯片为例，分别针对A1196G和G839A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQIDNO.1-SEQIDNO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQIDNO.13-SEQIDNO.18。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。表7液相芯片制备的设计一、样品检测采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：表8样本XRCC1基因A1196G检测结果与基因多态性分析表9样本XRCC1基因G839A检测结果与基因多态性分析从上述实施例可见，其它针对不同突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的tag序列，其结果依然稳定可靠。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组1和试验组6。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。实施例4XRCC1基因突变检测特异性引物序列的选择一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)以XRCC1基因C580T和G839A的多态性位点检测液相芯片为例，以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对C580T和G839A的野生型和突变型设计 ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备选的特异性引物序列，如表10所示。其中，内碱基为多态性位点。表10特异性引物序列以XRCC1基因C580T和G839A的多态性位点检测液相芯片为例，针对C580T和G839A选用不同的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列则固定为实施例1中的最佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表(表11)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。表11液相芯片制备的设计之二二、样品检测采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：表12样本XRCC1基因C580T检测结果与基因多态性分析表13样本XRCC1基因G839A检测结果与基因多态性分析由本实施例可见，ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组7和试验组10。其它来源于目标检测位点所在序列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结 果相同，即依然是实施例2中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳，具体数据省略。其它针对不同的SNP位点的多种特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，即实施例1所选择的特异性引物，具有更好的信噪比，检测效果也更好，具体数据省略。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3